Набора реагентов для выявления ДНК Coxiella burnetii в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® Coxiella burnetii-FL" по ТУ 9398-195-01897593-2011 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- УТВЕРЖДЕНА Приказом Росздравнадзора от N° УТВЕРЖДАЮ Директор Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно- исследовательский институт эпи^Р Ш ^я^гии» Федеральной в сфере ар^% отребителей и .ёла^^гю!^йК^%ловека “• ‘ I и окровскии 2011 г. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления ДНК Coxiella burnetii в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Coxiella burnetii-FL» АмплиСенс’ ш1 Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, 111123, город Москва, улица Новогиреевская, дом За --- стр. 2 --- СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................................. 3 НАЗНАЧЕНИЕ................................................................................................................................. 3 ПРИНЦИП МЕТОДА....................................................................................................................... 3 ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ....................................................4 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ...................................................................................5 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ..................................................................................................5 ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ....................................................6 ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА... 8 ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ Д Н К ............................8 СОСТАВ........................................................................................................................................... 11 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................................................11 ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ ........................................................12 ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»..................................................................................................................................... 12 А. Подготовка пробирок для амплификации ................................................................. 12 Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»...............13 АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................................14 СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ .......................16 ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «РИБО- преп»................................................................................................................................................17 СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ ............................................19 ОГЛАВЛЕНИЕ --- стр. 3 --- список СОКРАЩЕНИЙ В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения: В КО - внутренний контрольный образец К - - отрицательный контроль ПЦР К+ - положительный контроль ПЦР НК - нуклеиновые кислоты (РНК/ДНК) В - - отрицательный контроль экстракции ПКО - положительный контрольный образец ПЦР - полимеразная цепная реакция ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека __________________ FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени» НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов «АмплиСенс® C o x ie lla b u r n e tii-F L » предназначен для выявления ДНК Coxiella burnetii в клещах, биологическом материале от людей (кровь, мокрота, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал) и материале от животных (кровь, секционный материал, плацента и абортивный материал) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания.^ ПРИНЦИП МЕТОДА Выявление Coxiella burnetii методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа: экстракцию ДНК из образцов биологического материала, ПЦР-амплификацию участка ДНК данного микроорганизма и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится непосредственно в ходе ПЦР (формат FRT). Экстракция ДНК из биологического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО STI-87), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами проводится реакция амплификации участка ДНК Coxiella burnetii при помощи специфичных к этому участку ДНК праймеров и фермента TaqF-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствует флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в В соответствии с директивой Европейского Союза 98/79/ЕС --- стр. 4 --- результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфических продуктов амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентных сигналов. Детекция флуоресцентных сигналов при использовании формата FRT происходит непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ Набор реагентов выпускается в 1 формате. Формат FRT Набор реагентов выпускается в 3 формах комплектации; Форма 1 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F. Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 50, «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F. Форма 3 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке. Форма комплектации 1 предназначена для проведения амплификации ДНК Coxiella burnetii с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции РНК/ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Форма комплектации 2 предназначена для проведения полного ПЦР- исследования, включающего экстракцию ДНК из биологического материала и амплификацию ДНК Coxiella burnetii с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Форма комплектации 3 предназначена для производственных целей для последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам. ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 3 используется только в соответствии с регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. --- стр. 5 --- АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Аналитическая чувствительность Вид биологического материала (объем исследуемой пробы) Комплект для выделения ' РНК/ДНК^- Комплект для амплификации и детекции Аналитическая чувствитель ность^, ГЭ/мл Пробоподготовка ^ материала -клещи рода Dermacentor (50 мкл клещевой суспензии); -кровь(лейкоцитарная фракция крови, 200 мкл); -10 % суспензия тканей селезенки и печени (50 мкл) «РИБО-преп» «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F 5x10^ Данная чувствительность достигается при соблюдении нижеизложенных правил пробоподготовки биоматериала и рекомендуемом исследуемом объеме пробы Аналитическая специфичность Аналитическая специфичность изучена на бактериях Rickettsia conorii ssp. caspia, Ehrlichia muris и Francisella tularensis, a также вирусах - вирусе Западного Нила, вирусе Крымской-Конго геморрагической лихорадки и IHerpesvirus. При работе с РНК/ДНК вышеперечисленных микроорганизмов, а также ДНК человека, ДНК клещей и ДНК грызунов не выявлено ложноположительных результатов. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Взятие, хранение материала, транспортирование на исследование и работу с ним проводят в соответствии с инструктивно-методическими документами, регламентирующими выполнение исследований; СП 1.3. 1285-3 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». При работе необходимо выполнять следующие требования: - Следует рассматривать исследуемые образцы как потенциально инфекционные и работать с ними в биологическом кабинете в соответствии СП 1.3. 1285-3 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» - Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезинфицирующие средства в соответствии с СП 1.3. 1285-3 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)». Количество геномных эквивалентов микроорганизма (ГЭ) в 1 мл образца исследуемого материала. --- стр. 6 --- - Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения, продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы, оборудование и реактивы в Зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. - Уничтожать образцы в соответствии с СП 1.3. 1285-3 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. - Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции. - Допускать к работе с набором только специально обученный персонал. - Не использовать набор по истечении срока годности. - Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании работы. - Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской помощью. - Листы безопасности материалов (MSDS - material safety data sheet) доступны по запросу. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 1. 0,15 М NaCI (физиологический раствор) или фосфатный буферный раствор (PBS) (натрия хлорид, 137 мМ; калия хлорид, 2,7 мМ; натрия монофосфат, 10 мМ; калия дифосфат, 2 мМ; рН=7,5±0,2) для проведения пробоподготовки клещей, тканей внутренних органов, секционного материала. 2. 96 % раствор этанола для проведения пробоподготовки клещей, обработанных маслом. 3. Глицерин для проведения пробоподготовки клещей. 4. Гомогенизатор TissueLyser LT (Qiagen, Германия) и металлические шарики из нержавеющей стали диаметром 5 мм и 7 мм рекомендуются для гомогенизации тканей органов и клещей. 5. Стерильные фарфоровая ступка и пестик для пробоподготовки внутренних органов и секционного материала. 6. Реагент «МУКОЛИЗИН» производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии 6 --- стр. 7 --- Роспотребнадзора для предварительной обработки мокроты. ЗОНА 1. Экстракция ДНК из биологического материала. 7. Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК «РИБО-преп» (ТУ 9398-071- 01897593-2008) - при работе с формой комплектации 1. 8. Ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия, класс биологической безопасности II тип А). 9. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С. 10.Автоматические дозаторы переменного объема (от 20 до 200 мкл, от 100 до 1000 мкл). 11.Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл. 12.Штатив для пробирок объемом 1,5 мл. ф 13.Одноразовые наконечники с фильтром до 100 и 1000 мкл. 14.Штативы для наконечников. 15.Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс д. 16.Вортекс. ^ 17. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости. 18.Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С. 19.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки в соответствии с МУ 1.3.2569-09. 20.Емкость для сброса наконечников. ЗОНА 2. Проведение ПЦР и гибридизациоино-флуоресцентной детекции ф продуктов амплификации 21. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс). 22. Центрифуга/вортекс. 23. Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 50 мкп, от 20 до 200 мкл). 24. Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в штативах. 25. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл. 26. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С. 27. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки в соответствии с МУ 1.3.2569-09. 28. Емкость для сброса наконечников. 29. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» (например, Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия), iCycler i05 (Bio-Rad, 7 --- стр. 8 --- США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях по применению данного набора реагентов). 30. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл: а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой крышкой (например, Ахудеп, США) - при использовании прибора планшетного типа; б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, Ахудеп, США) или пробирки для ПЦР к Rotor-Gene, объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (например, Corbett Research, Австралия; Qiagen, Германия) - при использовании прибора роторного типа. ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА Осуществляется в соответствии с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г, а также СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». Материалом для исследования служат: - Иксодовые клещи: Rhipicephalus, Haemaphysalis, Dermacentor, Ixodes. Материал от людей: - Цельная периферическая кровь, мокрота, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал (ткани мозга, сердца, легких, селезенка). Материал от животных: - кровь, плацента, абортивный материал, секционный материал (селезенка). Кровь, мокроту, промывные воды бронхов, ликвор, секционный материал доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 1 сут. При поступлении в лабораторию проводят пробоподготовку крови, ликвора, промывных вод бронхов с получением бактериального осадка, после чего либо сразу приступают к экстракции нуклеиновых кислот либо замораживают пробу для длительного хранения. Клещей хранят или живыми (до 1 мес), или 1 нед при температуре не выше минус 16 °С, далее - при температуре не выше минус 68 °С. Секционный и абортивный материал, а также плаценту хранят 1 нед при температуре не выше минус 16 °С, далее - при температуре не выше минус 68 °С. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ ДНК 1. Клещи --- стр. 9 --- Клещей предпочтительнее исследовать индивидуально. В том случае, если клещи были обработаны маслом, их следует поместить в пробирки типа «Эппендорф», добавить 500 мкл 96 % этанола и встряхнуть на вортексе. Пробирку центрифугировать в течение 3-5 с на микроцентрифуге типа вортекс для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки, после чего жидкость аккуратно отобрать с помощью вакуумного отсасывателя. Затем в пробирку с клещами добавить 500 мкл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида или PBS-буфера, встряхнуть на вортексе, центрифугировать в течение 3-5 с на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки, после чего жидкость аккуратно отобрать с помощью вакуумного отсасывателя. Для приготовления суспензий клещей использовать стерильную фарфоровую чашку и стерильный пестик. При наличии автоматического гомогенизатора TissueLyser LT применять следующие параметры гомогенизации: 1) для клещей родов Rhipicephalus, Haemaphysalis и Dermacentor диаметр шариков 7 мм, частота 50 Гц/с, время гомогенизации 10-12 мин, объем буфера 700 мкп (ненапитавшийся клещ) или 1000- 1500 мкл (напитавшийся клещ и пулы клещей); 2) для клещей рода Ixodes диаметр шариков 5 мм, частота 50 Гц/с, время гомогенизации 5-10 мин, объем буфера 300 мкп (ненапитавшийся клещ) или 700-1000 мкп (напитавшийся кпещ и пулы клещей). В случае гомогенизации напитавшихся клещей в ступке их предварительно следует проколоть стерильной одноразовой иглой в нескольких местах для выхода крови. Клещей растирать в 700 мкл (если проба состоит из одного ненапитавшегося клеща родов Rhipicephalus, Haemaphysalis, Dermacentor) или в 300 мкл (если проба состоит из одного ненапитавшегося клеща рода Ixodes), в 1-1,5 мл (если гомогенизируют пул клещей или напитавшегося клеща родов Rhipicephalus, Haemaphysalis, Dermacentor), или в 1000 мкл (если гомогенизируют пул клещей или напитавшегося клеща рода Ixodes) 0,15 М раствора хлорида натрия, смешивая раствор с клещами небольшими объемами, затем полученную суспензию центрифугировать при 5 тыс об/мин в течение 2 мин и отобрать 50 мкл надосадочной жидкости для экстракции ДНК. Оставшийся объем суспензии без осадка перенести в новую пробирку типа «Эппендорф» и внести глицерин (10 % по объему), пробу перемешать и заморозить при температуре не выше минус 16 °С для последующего исследования. 2. Кровь Взятие цельной периферической крови у людей проводится утром натощак в пробирку с 6 % раствором ЭДТА в соотношении 1:20. Закрытую пробирку несколько 9 --- стр. 10 --- раз переворачивают. В пробирку типа «Эппендорф» внести 1,5 мл цельной крови, взятой с ЭДТА, и центрифугировать при 800 об/мин (380 g при диаметре ротора 50 мм) в течение 10 мин; затем верхний слой плазмы (500-600 мкл) с лейкоцитами перенести во вторую пробирку типа «Эппендорф» и центрифугировать при 9 О О О g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость (за исключением 200 мкл жидкости над осадком клеток) перенести в контейнер с дезинфицирующим раствором, а осадок клеток и 200 мкл надосадочной жидкости использовать для экстракции ДНК. 3. Внутренние органы, плацента и абортивный материал от животных, секционный материал, полученный от человека Кусочки объемом не менее 0,5 см^ тщательно растереть в гомогенизаторах или с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, добавить стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида или PBS-буфер не менее 500 мкл и тщательно перемешать. При подготовке плаценты гомогенизаторы использовать не рекомендуется. Готовую 10% суспензию отстаивать при комнатной температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу перенести в пробирки вместимостью 1,5 мл. ДНК выделяют из 50 мкл суспензии. 4. Мокрота Предобработку материала выполнять по инструкции к реагенту «МУКОЛИЗИН». Для экстракции ДНК использовать 50 мкл пробы. 5. Ликвор и промывные воды бронхов 1,0 мл клинического образца перенести в пробирку типа «Эппендорф» и центрифугировать при 9 О О О g в течение 5 мин. Надосадочную жидкость (за исключением 200 мкл жидкости над осадком клеток) перенести в контейнер с дезинфицирующим раствором, а осадок клеток и 200 мкл надосадочной жидкости использовать для экстракции ДНК. Материал после пробоподготовки до экстракции ДНК можно хранить при температуре не выше минус 20 °С в течение 1 мес или длительно при температуре не выше минус 68 °С. 10 --- стр. 11 --- ФОРМАТ FRT ФОРМАТ FRT СОСТАВ Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 50 - комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала - включает: Реактив Описание Объем, мл Кол-во Раствор для лизиса Прозрачная жидкость голубого цвета^ 15 1 флакон Раствор для преципитации Прозрачная бесцветная жидкость 20 1 флакон Раствор для отмы вки 3 Прозрачная бесцветная жидкость 25 1 флакон Раствор для отмы вки 4 Прозрачная бесцветная жидкость 10 1 флакон РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 1.2 4 пробирки Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК/ДНК из 50 проб, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 2. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F - комплект реагентов для амплификации фрагмента ДНК Coxiella burnetii с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» - включает; Реактив Н Описанйе Объем, мл Кол-во ПЦР-смесь-1-FRT Coxiella burnetii Прозрачная бесцветная жидкость 0.6 1 пробирка ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT Прозрачная бесцветная жидкость 0.3 1 пробирка Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная жидкость 0,03 1 пробирка ПКО ДНК Coxiella burnetii! ST\ Прозрачная бесцветная жидкость 0,2 1 пробирка ДНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка Комплект реагентов рассчитан на проведение 60 реакций амплификации, включая контроли. К комплекту реагентов прилагается контрольный образец этапа экстракции: Реактив ? Описание Объем, мл Кол-во ВКО STI-87 Прозрачная бесцветная жидкость 0.6 1 пробирка ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ПЦР-исследование состоит из следующих этапов: ^ При хранении раствора для лизиса при температуре от 2 до 8 °С возможно образование осадка в виде кристаллов. II