Набор реагентов для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL" по ТУ 9398-007-01897593-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас 1 закупка, где это изделие полностью проходит по требованиям хотя бы в одной позиции.
| Закупка | Окончание подачи | Нач. цена |
|---|---|---|
| Поставка медицинских изделий для клинико-диагностической лаборатории
№ 0190200000326012491 · ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ "ЯМАЛО-НЕНЕЦКИЙ ОКРУЖНОЙ ЦЕНТР ПРОФИЛАКТИКИ И БОРЬБЫ СО СПИД" · Ямало-Ненецкий автономный округ |
12.11.2026 | 988 587 ₽ |
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- УТВЕРЖДАЮ Зам. директора Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно- исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополу»^ человека Малеев 2017 г. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL» АмплиСенс® Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, 111123, город Москва, улица Новогиреевская, дом За IVD --- стр. 2 --- ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ НАЗНАЧЕНИЕ........ .......................................................................................... ПРИНЦИП МЕТОДА........ ........................................................................................... ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ... ........................................................................................ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.............................................................................. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ................................... ФОРМАТ ЖТНСП0РТИР° ВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.::^ СОСТАВ...... 11 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................................11 ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ................................................ времени»ИЕ ami 'лификациис детекцией в режиме «реального....... А. Подготовка пробирок для амплификации .............................. и и н ™ !^ peS ^ “ “ «р— со воемони;;:,5 СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ on реа?еЛн™ Е<<РИ Ю -пр1ГЩИЯ ДНК ^ ЦеЛЬН°Й КР°ВИ ПрИ ™ зо вании комплекта.... Р Та” '|!к янк 1 ' ! ! Л Ы , 0 Й ^ ви "ри ................................................................................................ 25 13 13 16 18 19 С О С О С О Т ф щ ю со --- стр. 3 --- СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения: ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека типа 1 ВКО - внутренний контрольный образец к- - отрицательный контроль ПЦР к+ - положительный контроль ПЦР ок - отрицательный контроль экстракции око - отрицательный контрольный образец ПК - положительный контроль экстракции пко - положительный контрольный образец ПЦР - полимеразная цепная реакция ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора - федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека FL - флуоресцентная детекция FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени» $ НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов «АмплиСенс® ДНК-ВИЧ-FL» предназначен для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) путем амплификации специфического фрагмента провирусной ДНК методом ПЦР с гибридизационно- флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени». Материалом для проведения ПЦР служат пробы ДНК, выделенные из цельной крови человека, либо сухого пятна крови. ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания1. ПРИНЦИП МЕТОДА •$ Выявление провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя два этапа: экстракцию ДНК из образцов клинического материала и амплификацию участков провирусной ДНК и ДНК эндогенного внутреннего контроля (ВКО) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (формат FRT). По каналу, соответствующему флуорофору FAM, детектируется продукт амплификации ДНК ВКО. По каналу, соответствующему флуорофору JOE, детектируется продукт амплификации провирусной ДНК ВИЧ-1. В соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС. стр. 3 из 26 --- стр. 4 --- ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ Набор реагентов выпускается в 1 формате. Формат FRT Набор реагентов выпускается в 4 формах комплектации: Форма 1 включает комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 100, «Гемолитик» (1 флакон), «ПЦР-комплект» вариант FRT Форма 2 включает комплект расходных материалов для сухих пятен крови, комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 100, раствор для лизиса (2 флакона), раствор для преципитации (1 флакон), «Гемолитик» (1 флакон), «ПЦР-комплект» вариант FRT. Форма 3 включает комплект реагентов «ДНК-сорб-В» вариант 100, «Гемолитик» (2 флакона), «ПЦР-комплект» вариант FRT Форма 4 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке. Формы комплектации 1 и 2 предназначены для проведения полного ПЦР- исследования, включающего экстракцию ДНК из клинического материала (цельная кровь, сухие пятна крови) методом преципитации и амплификацию провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и ДНК эндогенного внутреннего контроля с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Форма комплектации 3 предназначена для проведения полного ПЦР- исследования, включающего экстракцию ДНК из клинического материала (цельная кровь) методом сорбции на силикагеле и амплификацию провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и ДНК эндогенного внутреннего контроля с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Форма комплектации 4 предназначена для производственных целей для последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам. ВНИМАНИЕ! Форма 3 предназначена для проведения ПЦР-исследования при использовании в качестве клинического материала только образцов цельной крови. ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 4 используется только в соответствии с регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Формы комплектации 1, 2 и 3 рассчитаны на проведение 100 реакций амплификации, включая контроли. стр. 4 из 26 --- стр. 5 --- АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Аналитическая чувствительность Вид клинического материала Комплект для экстракции ДНК Комплект для амплификации и детекции Объем клинического материала, мкл Аналитическая чувствительность, ГЭ/мл ДНК ВИЧ-12 Цельная кровь «РИБО-преп», «ДНК-сорб-В» «ПЦР- комплект» вариант FRT 250 100 «ПЦР- комплект» вариант FRT 100 250 Сухая капля крови «РИБО-преп» «ПЦР- комплект» вариант FRT (один круг, d=12 мм) 1x103 Аналитическая специфичность Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством добавления в реакцию геномной ДНК/РНК следующих организмов и вирусов: вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита D, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус ветряной оспы, вирус герпеса человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки западного Нила, аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Homo sapiens. Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы не были. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III— IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I— IV групп патогенности». При работе необходимо всегда следует выполнять следующие требования: Температура в помещении лаборатории от 20 до 28 °С, относительная влажность от 15 до 75%. Количество геномных эквивалентов (ГЭ) ДНК ВИЧ-1 в 1 мл образца клинического материала. --- стр. 6 --- - Рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, организовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III— IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Убирать и дезинфицировать разлитые образцы, используя дезинфицирующие средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III— IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции, продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы, оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. | - Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также использованные реагенты, упаковку3, биологический материал, включая материалы, инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом, следует удалять в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно- эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. - Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром4. Одноразовую пластиковую посуду I (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для обеззараживания медицинских отходов. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин. - Набор реагентов предназначен для одноразового применения для проведения ПЦР-исследования указанного количества проб (см. раздел «Состав»), - Набор реагентов готов к применению согласно данной инструкции. Применять Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты, упаковка относятся к классу опасности медицинских отходов Г. Для удаления надосадочной жидкости в процессе экстракции с помощью вакуумного отсасывателя используются одноразовые наконечники без фильтра. стр. 6 из 26 --- стр. 7 --- набор реагентов строго по назначению. - К работе с набором реагентов допускается только персонал, обученный методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико-диагностической лаборатории в установленном порядке (СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами 1 1 1 — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»), - Не использовать набор реагентов, если нарушена внутренняя упаковка или внешний вид реагента не соответствует описанию. - Не использовать набор реагентов, если не соблюдались условия транспортирования и хранения согласно инструкции. - Не использовать набор по истечении срока годности. - Использовать одноразовые неопудренные перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реагентами. Тщательно вымыть руки по окончании работы. Все операции проводятся только в перчатках для исключения контакта с организмом человека. - Избегать вдыхания паров, контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. Вреден при проглатывании. При контакте немедленно промыть пораженное место водой, при необходимости обратиться за медицинской помощью. - При соблюдении условий транспортировки, эксплуатации и хранения риски взрыва и возгорания отсутствуют. - Листы безопасности материалов (SDS - safety data sheet) доступны по запросу. Оценка вероятных событий, в результате наступления которых могут произойти отрицательные последствия для организма человека. При использовании по назначению и соблюдении вышеперечисленных мер предосторожности контакт с организмом человека исключен. При аварийных ситуациях возможно следующее: - раздражение слизистой оболочки глаз у чувствительных лиц, - раздражение кожи у чувствительных лиц, - аллергическая реакция, - вред при вдыхании, - вред при приеме внутрь. Специфические воздействия комплекта реагентов на организм человека (для всех форм комплектации): - Канцерогенный эффект отсутствует. - Мутагенное действие отсутствует. - Репродуктивная токсичность отсутствует. стр. 7 из 26 --- стр. 8 --- ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ЗОНА 1. Экстракция ДНК из клинического материала 1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс). 2. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» (до 16000 д). 3. Вортекс. 4. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С. 5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости. 6. Автоматические дозаторы переменного объема. 7. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл в штативах. 8. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл. 9. Штативы для пробирок объемом 1,5 мл. 10. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК. 11.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09. 12. Емкость для сброса наконечников. При работе с сухими пятнами крови: 13. Компостеры с диаметром 6 мм (например, Qiagen, Германия). ЗОНА 2. Проведение ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации 1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс). 2. Центрифуга/вортекс. 3. Автоматические дозаторы переменного объема. 4. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл в штативах. 5. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл. 6. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С. 7. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09. 8. Емкость для сброса наконечников. 9. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» (например, Rotor-Gene 3000/6000, (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия), iCycler iQ, iQ5 (Bio-Rad, США), МхЗОООР (Stratagene, США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях по применению данного набора реагентов). 10.Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл: стр. 8 из 26 --- стр. 9 --- а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой крышкой (например, Axygen, США) - при использовании прибора планшетного типа; б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, Axygen, США), или пробирки для ПЦР к Rotor-Gene, объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (например, Corbett Research, Австралия; Qiagen, Германия) — при использовании прибора роторного типа. стр. 9 из 26 --- стр. 18 --- СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения. Хранение. Комплект расходных материалов для сухих пятен крови хранить при температуре от 15 до 25 °С. Комплект реагентов «ДНК-сорб-В» хранить при температуре от 2 до 25 °С, кроме ОКО. Комплект реагентов «РИБО-преп» и ОКО из комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» хранить при температуре от 2 до 8 °С. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» хранить при температуре не выше минус 16 °С. Не допускается замораживание/оттаивание ПКО ДНК ВИЧ-1 и ДНК человека более двух раз, после размораживания ПКО ДНК ВИЧ-1 и ДНК человека хранить при температуре от 2 до 8 °С не более 6 мес. ПЦР-смесь-1-FRT ВИЧ, ОТ-ПЦР-смесь-2- FEP/FRT и полимеразу (TaqF) после размораживания не хранить. ПЦР-смесь-1-FRT ВИЧ хранить в защищенном от света месте. стр. 18 из 26 --- стр. 19 --- ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ Производитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик набора реагентов, требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора реагентов направлять по адресу 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, e-mail: cs@pcr.ru9. При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию (в РФ - Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим законодательством. Заведующий НПЛ ОМДиЭ ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора Е.Н. Родионова Главный врач ФГБУ «Поликлиника №1 Управления делами Президента Российской Федерации Е.В. Ржевская Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете потребителя на сайте: www.amplisens.ru . оставить, заполнив анкету стр. 19 из 26 --- стр. 20 --- СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ REF LOT I V D VER Номер по каталогу А Осторожно! Обратитесь к инструкции по применению Код партии V Содержимого достаточно для проведения п- количества тестов Медицинское изделие для диагностики in vitro . Использовать до Дата изменения □3 Обратитесь к инструкции по применению Температурный диапазон N,1/. Не допускать воздействия солнечного света Верхнее ограничение температуры |W f] Дата изготовления Изготовитель стр. 20 из 26 --- стр. 21 --- ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Экстракция ДНК из цельной крови при использовании комплекта реагентов «РИБО-преп» Объем клинического материала для экстракции ДНК - 0,1 мл или 0,25 мл. Примечание - Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов. Подготовка клинического материала при экстракции ДНК из крови 1. Взять пробирки на 1,5 мл с завинчивающейся крышкой для обработки необходимого количества проб и контролей, промаркировать. В пробирки, предназначенные для клинических проб, внести отдельными наконечниками по 1,0 мл гемолитика и по 0,25 мл исследуемой цельной крови соответственно маркировке. Если исследуется кровь новорожденных детей, к 1,0 мл гемолитика добавить 0,1 мл крови. Закрыть пробирки и аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе. 2. Оставить пробирки при комнатной температуре на 5 мин, затем еще раз аккуратно перемешать содержимое пробирок на вортексе и оставить на 5 мин. 3. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 8 тыс об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость отобрать с помощью вакуумного отсасывателя, не задевая осадка. Полученный осадок лейкоцитов может быть немедленно лизирован или заморожен при температуре не выше минус 16 °С на две недели, а при температуре не выше минус 68 °С на длительное время. Лизис клинического материала 1. Промаркировать одну дополнительную пробирку положительного контроля (ПК) и внести в нее 5 мкл ПКО ДНК ВИЧ-1 и ДНК человека. 2. Промаркировать одну дополнительную пробирку отрицательного контроля (ОК) и внести в нее 5 мкл РНК-буфера. 3. Добавить в пробирки с лейкоцитами и в пробирки с контрольными образцами по 300 мкл раствора для лизиса. 4. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и прогреть 5 мин при 65 °С в термостате. 5. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе. 6. Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин. стр. 21 из 26 --- стр. 22 --- 7. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра для каждой пробы. 8. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив. 9. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. 10.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра для каждой пробы. 11. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. 12. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. 13.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра для каждой пробы. 14. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты). 15. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. 16. Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР. Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 °С. стр. 22 из 26 --- стр. 23 --- ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Экстракция ДНК из сухих пятен крови при использовании комплекта реагентов «РИБО-преп» Объем клинического материала для экстракции ДНК - 1 сухое пятно крови. Примечание - Раствор для лизиса (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов. 1. Взять пробирки на 1,5 мл для обработки необходимого количества проб и контролей, промаркировать. 2. Взять необходимое количество заранее простерилизованных компостеров (с диаметром 6 мм). 3. Используя для каждого образца отдельный компостер выбить в соответствующие пробирки круги с сухими пятнами крови. Для получения достаточного количества материала компостером необходимо вырезать одно целое пятно крови, последовательно совершая 4-5 вырезаний. 4. Промаркировать одну дополнительную пробирку положительного контроля (ПК) и внести в нее 5 мкл ПКО ДНК ВИЧ-1 и ДНК человека. 5. Промаркировать одну дополнительную пробирку отрицательного контроля (ОК) и внести в нее 5 мкл РНК-буфера. 6. В пробирки, содержащие бумагу с сухими пятнами крови, и с контрольными образцами добавить по 700 мкл раствора для лизиса. Закрыть пробирки и аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе. 7. Переставить пробирки в термостат и прогреть при 65 °С в течение 30 мин. Во время инкубации пробирки необходимо встряхивать на вортексе каждые 8- 10 мин. 8. Во время инкубации необходимо приготовить и промаркировать необходимое количество свежих пробирок на 1,5 мл для клинических образцов. 9. Вынуть из термостата пробирки и процентрифугировать их на микроцентрифуге в течение 1 мин при 10 тыс об/мин. 10. Для клинических образцов перенести надосадочную жидкость в соответствующие промаркированные свежие пробирки. ВНИМАНИЕ! Необходимо перенести максимальное количество жидкости. Для этого во время отбора жидкости наконечником необходимо отжимать бумагу, находящуюся в осадке. Допустимо попадание небольшого количества бумаги вместе с отобранной жидкостью в свежие пробирки. 11. Добавить в пробирки по 600 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе. 12. Процентрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при --- стр. 24 --- « 13 тыс об/мин. 13. Аккуратно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра для каждой пробы. 14. Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру одновременно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе сверху крышкой или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив. 15. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. 16.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра для каждой пробы. 17. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. 18. Процентрифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. 19.Осторожно, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра для каждой пробы. 20. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин для подсушивания осадка (при этом крышки пробирок должны быть открыты). 21. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. 22. Процентрифугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР. Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 °С. < стр. 24 из 26 --- стр. 25 --- ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Экстракция ДНК из цельной крови при использовании комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» Объем клинического материала для экстракции ДНК - 0,1 мл или 0,25 мл. Примечание - Лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если они хранились при температуре от 2 до 8 °С) прогреть при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов. Подготовка клинического материала при экстракции ДНК из крови 1. Взять пробирки на 1,5 мл с завинчивающейся крышкой для обработки необходимого количества проб и контролей, промаркировать. В пробирки, предназначенные для клинических проб, внести отдельными наконечниками по 1,0 мл гемолитика и по 0,25 мл исследуемой цельной крови соответственно маркировке. Закрыть пробирки и аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе. Если исследуется кровь новорожденных детей, к 1,0 мл гемолитика добавить 0,1 мл крови. 2. Оставить пробирки при комнатной температуре на 3 мин, затем еще раз аккуратно перемешать содержимое пробирок на вортексе и оставить на 3 мин. 3. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 8 тыс об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость отобрать с помощью вакуумного отсасывателя, не задевая осадка. 4. К осадку добавить 0,5 мл гемолитика, перемешать на вортексе и оставить на 3 мин. 5. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге при 8 тыс об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость отобрать с помощью вакуумного отсасывателя, не задевая осадка. 6. Повторить отмывку лейкоцитов гемолитиком. После последней отмывки осадок клеток должен быть белым, допускается наличие только небольшого налета розоватого цвета над осадком (остатки разрушенных эритроцитов). Полученный осадок лейкоцитов может быть немедленно лизирован или заморожен при температуре не выше минус 16 °С на две недели, а при температуре не выше минус 68 °С на длительное время. Лизис клинического материала 1. В каждую пробирку к осадку лейкоцитов добавить по 300 мкл лизирующего раствора, перемешать на вортексе до полного суспендирования клеток. 2. Приготовление положительного контроля (ПК). В отдельную пробирку, предназначенную для положительного контроля, добавить 300 мкл стр. 25 из 26 --- стр. 26 --- лизирующего раствора, 95 мкл ОКО и 5 мкл ПКО ДНК ВИЧ-1 и ДНК человека. 3. Приготовление отрицательного контроля (ОК). В отдельную пробирку, предназначенную для отрицательного контроля, добавить 300 мкл лизирующего раствора и 5 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. 4. Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 10 мин, перемешивая осадок каждые две минуты. 5. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. 6. Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Осадить сорбент универсальный центрифугированием при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. 7. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. 8. Повторить пункт 7. 9. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 10 мин для подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть открыты. 10. В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 65 °С на 5 мин. 11. Процентрифугировать пробирки на максимальных оборотах микроцентрифуги в течение 1 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР. Очищенную ДНК можно хранить в течение недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 года при температуре не выше минус 16 °С. стр. 26 из 26