Набор реагентов для выявления и количественного определения мРНК химерного гена bcr-abl (вариант М-bcr) и мРНК гена abl в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени" "АмплиСенс® Лейкоз Квант M-bcr-FRT" по ТУ 9398-033-01897593-2007 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 7 --- Формат поста- новки & Количественный ЦЦ^ 0 ^Скрининговый (качественны Одна панель (Ротор 36) Две панели (Ротор 72) Одна панель (Ротор 36) Две панели (Ротор 12) Количество исследуемых клинических образцов 5 образцов 11 образцов 10 образцов 22 образца Экстракция РНК 12 экстракций 5 клинических образ цов в двух повторах, низкоконцентриро ванный положитель ный контроль-(ПКО- 1), а также отрица тельный контроль в одном повторе 24 экстракции 11 клинических об разцов в двух повто рах, низкоконцентри рованный положи тельный контроль (ПКО-1), а также от рицательный контроль в одном повторе 12 экстракций 10 клинических об разцов, низкоконцен трированный положи тельный контроль (ПКО-1), а также от рицательный кон троль в одном повторе 24 экстракции 22 клинических об разца, низкоконцен трированный положи тельный контроль (ПКО-1), а также от рицательный кон троль в одном повторе Постановка ПЦР с обрат ной тран скрипцией (ОТ-ПЦР) 18 реакций на ПЦР - смеси-1 Ъсг-аЫ 16 реакций на ПЦР- смеси-1 И-аЫ 12 экстрагированных образцов и 1 ПЦР К- в обе смеси, 5 и 3 ДНК- калибраторов в одном повторе каждый (в за висимости от смеси), соответственно. 36 реакций на ПЦР- смеси-1 Ъсг-аЫ 32 реакций на ПЦР- смеси-1 И-аЫ 24 экстрагированных образца и 2 ПЦР К- в обе смеси, 5 или 3 ДНК-калибраторов в двух повторах каждый (в зависимости от смеси). 14 реакций на ПЦР- смеси-1 Ъсг-аЫ 14 реакций на ПЦР- смеси-1 И-аЫ 12 экстрагированных образцов. ПЦР К- и ДНК-калибратор КЗ для смеси П-аЫ и ПЦР К- и ДНК- калибратор К5 для смеси М-Ъсг-аЫ в од ном повторе каждый. 26 реакций на ПЦР- смеси-1 Ъсг-аЫ 26 реакций на ПЦР- смеси-1 И-аЫ 24 экстрагированных образца ПЦР К-, ДНК- калибратор КЗ для смеси И-аЫ и ПЦР К- и ДНК-калибратор К5 для смеси М-Ъсг-аЫ в одном повторе каж дый. Примечание: Одна панель - приведен расчет для постановки с использованием компонентов комплекта «РЕВЕРТА-Ь» (КТ-ппх, ОТТ лиофилизированный) «АмплиСенс» (ПЦР-смесь-1-РКТ- М-Ъсг-аЫ, ПЦР-смесь-1-РЯТ-А-ай/, ПЦР-буфер-РКТ, Полимераза (ТарР)) по одной пробирке каж дого. Две панели - приведен расчет для постановки с использованием компонентов по две про бирки каждого. КОНТРОЛЬ НАБОРА РЕАГЕНТОВ. Положительные контрольные образцы (ПКО-1 и ПКО-2) - представляют собой коли чественно охарактеризованные фрагменты мРНК Ъсг-аЫ, защищенные оболочкой РНК- содержащего фага. Данные контрольные образцы позволяют оценить качество прохожде ние всех этапов исследования, а также работоспособность реагентов. Оценка осуществля ется при сравнении заданных концентраций контролей, указанных в паспорте к набору ре агентов с результатами, полученными в ходе исследования. Необходимо проводить поста новку положительного контрольного образца ПКО-1 (низкоконцентрированный) всякий раз, когда происходит обработка образцов. Положительный контрольный образец ПКО-2 (высококонцентрированный) рекомендуется исследовать 1 раз (в начале использования) для данного набора реагентов. ДНК-калибраторы (К1, К2, КЗ, К4, К5) - представляют собой количественно охаракте ризованные препараты плазмид, содержащих вставку кДНК участка химеры Ъсг-аЫ и участка гена нормализатора аЫ. Используются для построения калибровочной прямой ПЦР для обеих ПЦР-смесей М-Ъсг-аЫ и И-аЫ, а также в качестве положительных контро лей ПЦР. Отрицательный контрольный образец (ОКО) - представляет собой образец, исходно не содержащий РНК Ъсг-аЫ и РНК аЫ, прошедший все этапы пробоподготовки. Позволя ет оценить качество и чистоту работы, а также валидность данных. 7 из 16 --- стр. 8 --- ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА. ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ РНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА. Проводится в ЗОНЕ-1 -комнате для обработки клинического материала. Объем клинического материала для выделения РНК - 150-200 мкл. ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «Кпазе-&ее», «Опазе- 1тее». В случае исследования в количественном формате экстракция РНК и постановка ОТ-ПЦР проводится в двух повторах для каждого образца. В случае исследования в скрининговом (качественном) формате осуществляют экстракцию РНК из одной половины забранного материала, вторую сохраняют при температуре не выше минус 16 °С для обеспечения возможности проведения повторного исследования. Порядок работы. 1. Лизис. Вариант 1. Кровь с ЭДТА. а) Обработка крови реагентом «Гемолитик»: При невозможности отобрать лейкоцитарное кольцо провести этап отмывки клеток белой крови при помощи реагента «Гемолитик». Для этого в отдельную пробирку объемом 10 мл для каждого образца внести 7,0 мл гемолитика и добавить 2,5 мл цельной крови. Полученный раствор перемешать на вортексе и центрифугировать 5 мин при 3 тыс. об/мин. Супернатант отобрать, не задевая осадка. Добавить в каждую пробирку с осадком клеток 800 мкл раствора Б. Лизированный таким образом образец может храниться при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 месяца и при температуре не выше минус 68 °С в течение 1 года. Разделить полученный лизат на 2 равные части: для этого отобрать по 400-450 мкл лизата в чистые пробирки на 1,5 мл б) Обработка клеток крови «лейкоцитарного кольца» /без использования «Гемолитика»): Отобрать необходимое количество пробирок объемом 1,5 мл и внести в них по 800 мкл раствора О. Поместить в приготовленные пробирки около 200 мкл отобранных белых клеток крови (не позднее чем через 48 часов после забора крови при условии хранения цельной крови при температуре от 2 до 6 °С). Лизированный таким образом образец мо жет храниться при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 месяца и при температу ре не выше минус 68 °С в течение 1 года. Разделить полученный лизат на 2 равные части: для этого отобрать по 400-450 мкл лизата в чистые пробирки на 1,5 мл. Вариант 2. Кровь с РНК-стабилизатором. Обработку начать с разделения образца на 2 равные части. Для этого в 2 отдельные пробирки на 5 мл отобрать по 4,5 мл образца. Произвести центрифугирование 10 мин при 5000§. Отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадка. Добавить в каждую пробирку с осадком 400 мкл раствора В. ВНИМАНИЕ! После добавления раствора О осадок полностью не растворяется. Полное растворение осадка происходит после добавления ацетата натрия и раствора А. 2. Подготовка положительных и отрицательных контролей (ПКО-1 или ПКО-2, ОКО). В две пробирки внести по 400 мкл раствора Б и 50 мкл ОКО. Затем в одну из пробирок внести 10 мкл ПКО-2 Ъсг-аЫ-гес (или ПКО-1 Ьсг-аЫ-гес). Перемешать на вортексе, осадить. 3. Добавить к образцам, лизированным в растворе О, 40 мкл ацетата натрия. Переме шать на вортексе. Центрифугировать для удаления капель с крышки пробирки. 4. Добавить к раствору 400 мкл раствора А, перемешать на вортексе. Центрифугировать для удаления капель с крышки пробирки 8 из 16 --- стр. 9 --- 5. Добавить к раствору 130 мкл раствора В. Перемешать на вортексе 1-2 минуты (рас твор может быть от молочно-белого цвета до цвета какао с молоком в зависимости от количества попавших в образец эритроцитов). 6. Поставить пробирки в морозильную камеру с температурой не выше минус 16 °С на 10 минут. 7. Центрифугировать пробирки 10 мин при 13-16 тыс. об/мин (если количество пробирок нечетное, уравновесить центрифугу пробиркой на 1,5 мл, содержащей примерно 1 мл воды). В процессе центрифугирования раствор разделится на две фазы: нижнюю, со держащую белки и ДНК, и верхнюю - водную, содержащую РНК. 8. Во время центрифугирования образцов отобрать новые пробирки объемом 1,5 мл в ко личестве соответствующем количеству обрабатываемых образцов (включая контроль ные). Внести в каждую по 400 мкл раствора С. ВНИМАНИЕ! В две пробирки с раствором С, в дальнейшем предназначенных для экстракции ПКО-2 (или ПКО-1) и ОКО необходимо внести по 10 мкл тРНК 1 мкг/мкл (препарата нагрузочной РНК). 9. С образцов после центрифугирования аккуратно отобрать верхнюю фазу (приблизи тельно 400 мкл), используя наконечники с аэрозольным барьером и перенести в про бирки, содержащие раствор С. Верхняя фаза образцов ПКО-1, ПКО-2 и ОКО перено сится в пробирки, содержащие раствор С и тРНК. 10. Перемешать на вортексе, центрифугировать для удаления капель с крышки пробирки и поставить в морозильную камеру с температурой не выше минус 16 °С на 20 минут. 11. Центрифугировать пробирки 10 минут при 14 - 16 тыс. об/мин. Визуально найти поло жение осадка РНК (если пробирка была помещена в центрифугу «хвостиком» или мет кой на крышке пробирки вверх, то осадок после центрифугирования будет находиться на дне пробирки строго под «хвостиком» или меткой). Аккуратно отобрать надосадоч- ную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Если осадок не виден глазом, отобрать надосадочную жидкость не касаясь стенок, оставив на дне пробирки примерно 20 мкл. 12. На время центрифугирования поместить флакон с раствором для отмывки 3 в моро зильную камеру с температурой не выше минус 16 °С. 13.Осадок ресуспендировать в 800 мкл холодного раствора для отмывки 3. Перемешать на вортексе, центрифугировать 10 мин при 14-16 тыс. об/мин. Отобрать надосадоч ную жидкость, не задевая осадка. 14. Подсушить осадок в термостате для микропробирок при температуре 56 °С в течение 5-7 минут. При этом крышки пробирок должны быть открыты. 15. Растворить осадок в 30 мкл РНК-элюента Ь с г - а Ы , прогреть при температуре 56 °С в течение 2-3 минут. Супернатант содержит очищенную РНК. Пробы готовы к постанов ке реакции обратной транскрипции и ПЦР. Раствор РНК можно хранить при температуре не выше минус 68 °С в течение года. ЭТАП 2. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПРОВЕДЕ НИЕ ПЦР. Проводится в ЗОНЕ 2 - комнате для подготовки и проведения ОТ и амплификации (ПЦР). I . П о с т а н о в к а р е а к ц и и о б р а т н о й т р а н с к р и п ц и и . (Общий объем реакции - 25 мкл, объем РНК-пробы - 15 мкл) При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластико вые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «К/Лазе-Ггее», «ОИазе- Ггее». ВНИМАНИЕ! «РНК-элюент Ъсг-аЫ» содержит компоненты, необходимые для про хождения реакции обратной транскрипции. Недопустимо использование РНК, разведен ной в других растворах для элюции РНК. Порядок работы: 1. Отобрать необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл. 9 из 16 --- стр. 10 --- 2. Приготовить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку с БТТ лиофи- лизированным добавить 125 мкл КТ-пнх и тщательно перемешать на вортексе, оса дить капли с крышки пробирки. 3. К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (ММ1 у), перемешать на вортексе, осадить капли с крышки пробирки. 4. Внести в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси. 5. Используя наконечник с аэрозольным барьером добавить 15 мкл РНК-пробы в про бирку с реакционной смесью, используя наконечник с барьером. Осторожно переме шать. 6. Поставить пробирки в амплификатор (термостат) по программе: Этап Температура Продолжительность этапа 1 50°С 15 мин 2 95°С 3 мин Готовый препарат кДНК можно хранить при температуре не выше минус 16 °С в те чение недели или при температуре не выше минус 68 °С в течение года. II. П о с т а н о в к а ПЦР. (Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем кДНК-пробы - 10 мкл) Порядок работы. А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР. 1. Отобрать необходимое количество микропробирок для ПЦР на 0,2 мл или 0,1 мл. Расчет количества микропробирок осуществляется исходя из того, что каждый образец исследу ется в двух ПЦР-смесях (ПЦР-смесь-1 -РКТ М-Ьсг-аЫ и ПЦР-смесь-1-РКТ М-аЬГ). Кроме того, осуществляется постановка отрицательных контролей (по одному для каждой ПЦР- смеси-1-РКТ), ДНК стандартов в количественном формате (5 для ПЦР-смесь-1-РКТ М-Ъсг- аЫ и 5 для смеси ПЦР-смесь-1-РКТ М-аЫ) или положительных контролей ПЦР в каче ственном формате (по одному для каждой ПЦР-смеси-1-РКТ). Если число необходимое пробирок И, то: в случае исследования в количественном формате: N = Количество образцов кДНК *2 + 10 в случае исследования в скрининговом (качественном) формате N = Количество образцов кДНК *2 + 4 2. В случае исследования одной (двух) панели образцов подготовить реакционные смеси исходя из следующего: - ПЦР-буфера-РКТ и полимеразы (ТацР). Содержимое одной пробирки с полиме разой (ТацР) (0,02 мл) необходимо полностью перенести в пробирку с ПЦР- буфером-РКТ (0,3 мл) и аккуратно перемешать на вортексе, не допуская образова ния пены. - В пробирку с ПЦР-смесью-1-РКТ М - Ь с г - а Ы добавить 145 мкл приготовленной смеси ПЦР-буфера-РКТ и полимеразы (ТацР). Перемешать на вортексе, осадить капли. - Аналогично в пробирку с ПЦР-сместью-1-ГКТ Н-аЫ добавить 145 мкл приготов ленной смеси ПЦР-буфера-РКТ и полимеразы (ТацР). Перемешать на вортексе, оса дить капли. В случае исследования двух панелей смеси готовят аналогично, но в двойном объеме. 3. В случае исследования иного количества образцов расчет производится исходя из то го, что на каждую постановку ПЦР идет: - 7,0 мкл ПЦР-смеси-1-ГКТ; - 7,5 мкл ПЦР-буфера-РКТ; - 0,5 мкл полимеразы (ТацР). При расчете необходимо брать реагенты с запасом: рассчитывать на одну реакцию больше. Для исследования N образцов кДНК (каждый в одном повторе) необходимо смешать: 10 из 16 --- стр. 11 --- Количественный формат Качественный (скрининговый) формаг^Щ^ Смесь для выявления М-Ъсг-аЫ Смесь для выявления М-аЫ Смесь для выявления М-Ьсг-аЫ Смесь для выявления Ы-аЫ (N+7) * 7,0 мкл ПЦР- смеси-1-РК.Т М-Ьсг-аЫ (N+7) * 7,5 мкл ПЦР- буфера-РКТ (N+7) * 0,5 мкл поли меразы (ТацР) (N+5) * 7,0 мкл ПЦР- смеси-1-РКТ М-аЫ (N+5) * 7,5 мкл ПЦР- буфера-РКТ (N+5) * 0,5 мкл поли меразы (ТацР) (N+3) * 7,0 мкл ПЦР- смеси-1-РК.Т М-Ъсг-аЫ (N+3) * 7,5 мкл ПЦР- буфера-РКТ (N+3) * 0,5 мкл поли меразы С^эдР) (N+3) * 7,0 мкл ПЦР- смеси-1-РВТ №аЫ (N+3) * 7,5 мкл ПЦР- буфера-РКТ (N+3) * 0,5 мкл поли меразы (ТацР) 7 = 5 ДНК-стандартов + 1 отрицательный контроль + 1 запас 5 = 3 ДНК-стандарта + 1 отрицательный контроль +1 запас 3 = 1 положительный контроль + 1 отрица тельный контроль +1 запас 3 = 1 положительный контроль + 1 отрица тельный контроль +1 запас 5. 6. Внести в каждую микропробирку для ПЦР, предназначенную для детекции транскрипта М-Ъсг-аЫ по 15 мкл приготовленной реакционной смеси М-Ьсг-аЫ и в каждую микропро бирку для ПЦР, предназначенную для детекции гена-нормализатора аЫ по 15 мкл приго товленной реакционной смеси №аЫ Используя наконечник с аэрозольным барьером, добавить по 10 мкл образца кДНК в пробирку с реакционной смесью М-Ьсг-аЫ, затем в пробирку с реакционной смесью И- аЫ. Вне зависимости от количества исследуемых панелей (одна или две) необходимо поста вить контрольные точки: В случае исследования в количественном формате: необходимо поставить 5 контрольных образцов - калибраторов - для смеси М-Ъсг-аЫ. Для этого в 5 пробирок вносят 5 ДНК-калибраторов (К1, К2, КЗ, К4, К5) по 10 мкл каждого поставить 3 контрольных образца - калибратора - для смеси А г -аЫ. Для этого в 3 пробирки вносят 3 ДНК-калибратора ПКО (К1, К2, КЗ) по 10 мкл каждого. В случае исследования в скрининговом (качественном) формате : необходимо поставить положительные контроли ПЦР. Для этого в одну пробирку со смесью М-Ъсг-аЫ и в одну пробирку со смесью Ы-аЫ внести по 10 мкл ДНК- калибратора ПКО (КЗ). Б. Проведение амплификации (ПЦР). 1. Поместить пробирки в амплификатор. 2. Запрограммировать прибор для выполнения соответствующей программы амплифика ции и детекции флуоресцентного сигнала (см. таблицы 1,2). Таблица 1. Программа амплификации для <<Ко1ог-Сепе» 3000/6000 («СогЬеП КезеагсЬ», Австралия) Этап Температура, °С Время Измерение флуорес ценции Повторов НоЫ 95 15 мин — 1 СусНп§ 95 15 с — 4560 45 с ЮЕ/ Уе11о\у - Задать измерение флуоресценции перед первым измерением (РеДбгт саНЬгабоп Ъе- йге йгз! асяшзкюп); - Задать параметры калибровки для каналов ЮЕ/Уе11о\у в диапазоне ЗР1-5Р1. 11 из 16 --- стр. 12 --- Таблица 2. Программа амплификации для «К^ 1Сус1ег», «К^б» («Вю-Кас!», США); Этап Температура, °С Время Измерение флуорес ценции Повторов 1 95 15 мин - 1 2 95 20 с - 4760 55 с НЕХ 3. После окончания реакции приступить к учету результатов. АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в ре жиме «реального времени» в соответствии с инструкцией к прибору. В пробирках с ПЦР- смесью-1-РКТ М-Ьсг-аЫ регистрируют накопление продукта амплификации участка кДНК М-Ьсг-аЫ (ПКО), в пробирках с ПЦР-смесью-1-РКТ Ц-аЫ - кДНК гена- нормализатора/внутреннего контроля (ВКО) аЫ. Скрининговый (качественный) формат Наличие характерных сигмообразных кривых накопления флуоресцентного сигна ла, пересекающих пороговую линию в пробирках с ПЦР-смесью-1-РК.Т М-Ъсг-аЫ свидетельствует о наличии мРНК транскрипта Ьсг-аЫ в образце - положительном результате исследования. Отсутствие положительного сигнала в ПЦР-смеси-1-РК.Т М-Ъсг-аЫ при валидном значении сигнала гена-нормализатора по смеси И-аЫ свидетельствует об отрица тельном результате исследования Сигнал гена нормализатора считается валидным, если значение порогового цикла «СЬ> (пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией) в ПЦР-смеси-1-РКТ Ы-аЫ для данного образца меньше значения порогового цикла положительного контроля (ДНК-калибратор ПКО (КЗ)). Результаты не подлежат учету если: 1. Сигнал гена-нормализатора является невалидным. Требуется перестановка дан ного образца, начиная с первого этапа анализа. В случае воспроизведения ре зультата требуется перезабор материала 2. Появление любого значения С1 в таблице результатов для отрицательного кон троля (ОКО) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительны ми. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выяв лению и ликвидации источника контаминации. Количественный формат На основании значений порогового цикла «СЬ> (пересечение кривой флуоресцен ции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией) и исходя из заданных значений калибраторов сначала для смеси М-Ьсг-аЫ, затем для смеси А- аЫ (заданные концентрации калибраторов идентичны для обеих смесей) происхо дит автоматическое построение калибровочной прямой и расчет значений копий кДНК Ъсг-аЫ и П-аЫ в образце ПЦР (см. руководство к соответствующему тер моциклеру для ПЦР в реальном времени). Полученные значения используют для расчета нормализованной концентрации РНК М-Ьсг-аЫ в исследуемых и контрольных образцах по следующей схеме: 1. рассчитать отношение для всех образцов Число копий кДНК М-Ьсг-аЫ / число копий кДНК П-аЫ 2. рассчитать среднее значение отношения концентраций М-Ьсг-аЫ/аЫ для двух повторов образца 12 из 16 --- стр. 13 --- Результаты не подлежат учету если: 3. Значение концентрации аЫ (ген-нормализатор) менее 10000 копий / реакция: образец не валидный, требуется перестановка данного образца, начиная с перво го этапа анализа. В случае воспроизведения результата требуется перезабор ма териала. 4. Отличие отношений концентрации М-Ъсг-аЫ/Ы-аЫ для двух повторов одного образца более чем четырехкратное. Т.е. (повтор-1 М-Ъсг-аЫ/Ы-аЫ) / (повтор-2 М-Ъсг-аЫ/Ы-аЫ) > 4 или < 0,25 • За исключением образцов, для которых измеренное число копий М-Ъсг-аЫ менее 25. 5. Коэффициент корреляции КЛ2 при построении калибровочной прямой менее 0,98: требуется перестановка всех проб, начиная с первого этапа анализа. 6. Рассчитанные концентрации ПКО-1/ПКО-2 не укладываются в диапазон, ука занный во вкладыше: требуется перестановка всех образцов, начиная с первого этапа анализа. 7. Появление любого значения С 1 в таблице результатов для отрицательного кон троля (ОКО) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительны ми. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выяв лению и ликвидации источника контаминации. Дополнительную информацию можно узнать в следующих статьях: a. Ни§Ьез Т, Е)ешт§ег М е 1 а1. Мош1опп§ СМТ райепН гезропсИп§ 1о й-еайпеп! \уН Ь 1угозте 1а- пазе тЫЬйогз: геу1е\у апс! гесоттепбайопз Рог Ьагтоптп§ сиггеп! теЙюс1о1о§у Рог бе 1ес1т§ ВСК-АВЬ 1гапзспр1з ап<3 к1пазе ёотат тиШюпз апс! Рог ехргеззт§ гезикз. В1оос1. 2006 М 1;108(1):28-37; b. ОаЪеЧ ], ВеШапЗ Е е! а1 81апбагсЙ2айоп апс! диаН1у соп!го1 зШсИез оР ‘геаКйте’ яиапИ́аЦуе ге- уегзе 1гапзспр1азе ро1утегазе сЬат геасПоп оР Гизюп §епе 1гапзспр1з Рог гезШиа1 сйзеазе 0е1ес- Йоп т 1еикет'ш - а Еигоре А§ат$1 Сапсегрго&гат. Ьеикегша. 2003 Оес; 17(12):2318-57. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ. Аналитическая чувствительность. Оценка чувствительности набора реагентов проведена с использованием контрольных РНК-содержащих фаговых препаратов Ь3а2 (содержит 13 и 14 экзон Ьсг и 2 экзон аЫ) и Ъ2а2 (содержит 13 экзон Ьсг и 2 экзон аЫ) с известной концентрацией. Экстракции РНК и постановке ОТ-ПЦР в режиме «реального времени» подвергались 2-кратные разведения Вариант мРНК Чувствительность, копий мРНК на экстракцию Чувствительность, копий мРНК на мл Ъ2а2 24 (19,5-28,5) 237 (189-282) Ь3а2 48 (37,5-52,5) 474 (378-525) Чувствительность, копий мРНК на экстракцию - количество частиц контрольного фага, которое необходимо добавить в экстракцию, для обеспечения положительного результата анализа в 100% случаев в присутствии 10 7 лейкоцитов. За величину чувствительности принято разведение контрольного фага, воспроизводимо определяемое как положительное в 12 повторах из 12. При соблюдении протокола набора реагентов данная величина отра жает минимальное детектируемое количество копий мРНК в !/2 лейкоцитарной массы за бранного образца периферической крови или ‘ А образца костного мозга. Таким образом, при обработке 2,5 мл периферической крови чувствительность детекции составляет 20-30 копий мРНК/мл (по протоколу исследование проводится в 2х повторах, в одну экстрак цию попадают лейкоциты из 1,25 мл цельной крови). Чувствительность, копий мРНК на мл - пересчитанная величина чувствительности на 1 мл препарата (исходя из того, что в экстракцию попадает 0,1 мл образца). Данная величина чувствительности может быть актуальна, например, при исследовании цельной крови без отбора лейкоцитарной массы. 13 из 16 --- стр. 14 --- 1Могт. Пиого. Аналитическая специфичность. Оценена на 240 образцах периферической крови здоровых доноров. Во всех случаях вы являлся валидный сигнал внутреннего контроля (гена-нормализатора аЫ) и не выявлялся сигнал Ъсг-аЫ. Воспроизводимость. [ Ьгези. 25 Сус1е 14 из 16 --- стр. 15 --- . Иного. Оценка ошибки измерения концентрации мРНК при использовании в качестве стандартов ДНК-плазмид, а также ошибки измерения концентрации мРНК Ь3а2 при использовании Ь2а2-стандартов. Ввиду того, что эффективности амплификации плазмидной ДНК и кДНК после реакции реверсии несколько отличаются, а также отличаются эффективности амплификации фраг ментов Ъ2а2 и Ь3а2 (ввиду отличий в длине), может наблюдаться небольшое искажение величины измеряемой концентрации. Для оценки величины ошибки измерения концентрации были определены эффективности ПЦР на препаратах мРНК и кДНК вариантов Ь3а2 и Ъ2а2. Мишень Эффективность реак ции Ожидаемая ошибка измерения концен трации для точки порядка 5*103 ко- пий/мл, разы (разность 1д) ДНК Ъ2а2 0,930±0,020 1 РНК Ъ2а2 0,910±0,010 1,104 (0,043 1В) РНК Ь3а2 0,855±0,025 1,901 (0,279 1ц) За единицу принята ошибка измерения концентрации ДНК Ъ2а2, так как данный вариант используется в качестве стандартов в наборе реагентов. Точность определения концентрации РНК Ь с г - а Ы в экспериментальных условиях по ДНК стандартам. Концентрация РНК- фага, определенная не зависимым методом Тип фага (повторов) Результат измерения концентра ции в данном наборе реагентов относительно ДНК-сгандартов Ошибка, разность частиц/мл 1§ ча стиц/мл Среднее, 1§ частиц/мл Ст.откл СУ% 1.77 * 10й 6.25 Ъ2а2 (5) 6.37 0,05 0.77 -0.12 2.53 * 104 4.40 Ъ2а2 (5) 4.46 0.05 1.22 -0.06 1,58 * 10й 6.20 Ь3а2 (5) 6.09 0.10 1.57 0.11 2,79 * 104 4.45 Ь3а2 (5) 4.09 0.09 2.19 0.36 15 из 16 --- стр. 16 --- ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ. Обеззараживание биоматериала и реагентов следует проводить на каждой стадии от дельно, помещая одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) в специаль ные контейнеры, содержащие дезинфицирующее средство, которое может быть использо вано для обеззараживания медицинских отходов. СРОК ГОДНОСТИ, УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ. Срок годности. 1 год. Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С в те чение 5 сут. При получении разукомплектовать. Хранение. Комплект реагентов «РИБО-золь-Б» (кроме ацетата натрия, РНК-элюента Ъсг- аЫ и тРНК), ПЦР-буфер-РКТ, ДНК-буфер и ДНК-калибраторы (из комплекта реагентов «АмплиСенс») хранить при температуре от 2 до 8 °С. Комплект реагентов «РЕВЕРТА-Ь», «АмплиСенс» (кроме ПЦР-буфера-РКТ, ДНК-буфера и ДНК-калибраторов), ацетат натрия, РНК-элюент Ьсг-аЫ и тРНК (из комплекта реагентов «РИВО-золь-Э») хранить при температуре не выше минус 16 °С. Условия отпуска. Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учре ждений. ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ. Производитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик набо ра реагентов, требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора реагентов направлять в по адресу 111123, г.Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, е-гпаП: С5@рсг.ш2 3. При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению набо ра реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, со здающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется направить сообщение по адресу, указан ному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию (в РФ - Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим законодательством. 2 Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету потре бителя на сайте: уууууу.атрНзепз.ги. 16 из 16 --- стр. 17 --- к