Набор реагентов для выявления и количественного определения ДНК вирусов папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-FL" по ТУ 9398-053-01897593-2008 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2008/02567 от 04.05.2008 · класс риска 2б

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Вид изделия: Папилломавирус человека нуклеиновая кислота штаммов высокого риска ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 39 контрактов, медианная цена за единицу 43 629 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДАЮ
Зам. директора Федерального 
бюджетного учреждения науки 
«Центральный научно- 
исследовательский институт 
эпидемиологии» Федеральной 
(^|рбб 1?;ло^.надзору в сфере 
£|ащиты П|Эа^^отребителей и 
д  б л о в е ка
.• .-Т Т.,'7 0 , ‘
....
в.г. Акимкин 
2017 г.
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов  
для выявления и количественного определения  
ДНК вирусов папилломы человека (ВПЧ) высокого  
канцерогенного риска (ВКР) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52,  
56, 58, 59 типов в клиническом материале  
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с  
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-FL»
АмплиСенс'’
i J
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии  
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом ЗА IVD


--- стр. 2 ---
Набор реагентов выпускается в 1 варианте.
Вариант FRT
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ
Набор реагентов выпускается в 4 формах комплектации:
Форма 1 включает комплекты реагентов «ДНК-сорб-АМ» вариант 100, «ПЦР-комплект»  
вариант скрин-титр-FRT 2х.
Форма 2 включает комплекты реагентов «ДНК-сорб-АМ» вариант 100, «ПЦР-комплект»  
вариант скрин-титр-FRT 4х.
Форма 3 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант скрин-титр-FRT 2х.  
Форма 4 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант скрин-титр-FRT 4х.
ВНИМАНИЕ! Заявленные аналитические характеристики набора реагентов при работе  
с формами 3 и 4 гарантируются только в случае применения комплектов реагентов для  
экстракции ДНК «ДНК-сорб-АМ» (ТУ 9398-036-01897593-2009), «ДНК-сорб-В» (ТУ 9398-  
003-01897593-2009), «ДНК-сорб-С» (ТУ 9398-075-01897593-2008), «АмплиСенс® ДНК-  
сорб-Д» (ТУ 9398-233-01897593-2015) производства Федерального бюджетного  
учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии»  
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия  
человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).
СОСТАВ
Комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» вариант 100 -  комплект реагентов для  
выделения ДНК из клинического материала включает:
Реагент Описание Объем (мл) Кол-во
Лизирующий раствор
Прозрачная
бесцветная
жидкость*
30 1 флакон
Отмывочный раствор Прозрачная 
бесцветная жидкость 100 1 флакон
Сорбент универсальный Суспензия белого 
цвета 1.0 2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции ДНК Прозрачная 
бесцветная жидкость 5,0 2 пробирки
Комплект реагентов рассчитан на выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)  
из 100 проб, включая контроли.
* При хранении лизирующего раствора при температуре от 2 до 8 °С возможно  
образование осадка в виде кристаллов.
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант скрин-титр-FRT 2х -  комплект  
реагентов для ПЦР-амплификации и количественного определения ДНК вирусов  
папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР) 16, 18, 31, 33, 35, 39,
стр. 2 из 60


--- стр. 3 ---
45, 51, 52, 56, 58, 59 типов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме  
«реального времени» включает:
Реагент Описание Объем (мл) Кол-во
ПЦР-смесь-1-FRT ВПЧ А9 Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,14 6 пробирок 
синяя крышка
ПЦР-смесь-1-FRT ВПЧ А7+ Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,14 6 пробирок 
зеленая крышка
ПЦР-буфер-FRT Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,30 6 пробирок
Полимераза (TaqF) Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,02 6 пробирок
К1 ВПЧ 16,18 Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,04 3 пробирки
К2 ВПЧ 16, 18 Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,04 3 пробирки
КЗ ВПЧ 16,18 Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,04 3 пробирки
ДНК-буфер Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка
Комплект реагентов рассчитан на проведение 216 реакций амплификации (всего 108  
тестов), включая контрол и.
Дополнительно к комплекту реагентов прилагается отрицательный контрольный  
образец (ОКО) этапа выделения:
Реагент Описание Объем (мл) Кол-во
ОКО Прозрачная 
бесцветная жидкость 1.2 1 пробирка
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант скрин-титр-FRT 4х -  комплект  
реагентов для ПЦР-амплификации и количественного определения ДНК вирусов  
папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР) 16, 18, 31, 33, 35, 39,  
45, 51, 52, 56, 58, 59 типов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме  
«реального времени» включает:
Реагент Описание Объем (мл) Кол-во
ПЦР-смесь-1-FRT ВПЧ скрин- 
титр
Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,28 3 пробирки
ПЦР-буфер-FRT Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,30 3 пробирки
Полимераза (TaqF) Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,02 3 пробирки
К1 ВПЧ Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,04 3 пробирки
К2 ВПЧ Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,04 3 пробирки
КЗ ВПЧ Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,04 3 пробирки
ДНК-буфер Прозрачная 
бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка
Комплект реагентов рассчитан на проведение 108 реакций амплификации, включая  
контроли.
сто, 3 из 60


--- стр. 12 ---
ЗОНА 2
Для проведения ПЦР-амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции 
продуктов ПЦР-амплификации требуются:
1. Двухканальный амплификатор, например, «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett  
Research», Австралия), «iQ iCycler» («BioRad», США) с фильтрами для каналов РАМ  
и HEX/JOE, «SmartCyclerll» («Cepheid», США) или эквивалентный.
2. Четырехканальный амплификатор, например, «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett  
Research», Австралия), «МхЗОООР» («Stratagene», США), «Ю5» («BioRad», США) или  
эквивалентный.
3. Для прибора «Rotor-Gene»: Одноразовые полипропиленовые микропробирки для  
ПЦР на 0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные) (например, «Ахудеп», США) для  
постановки в ротор на 36 пробирок или 0,1 мл («Corbett Research», Австралия) для  
постановки в ротор на 72 пробирки.
Для прибора «Ю iCvcIer»: Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР  
на 0,2 мл (куполообразная крышка, стрипованные или нет) (например, «Ахудеп»,  
США), или 96-луночный планшет для ПЦР, снабженный термостабильными  
оптически прозрачными пленками (например, «BioRad», США).
Для прибора «МхЗОООР»: Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР  
объемом 0,2 мл (куполообразная крышка, стрипованные или нет) (например,  
«Ахудеп», США) или плашки для ПЦР с оптически-прозрачными термостабильными  
клейкими пленками.
Для прибора «SmartCyclerll»: Одноразовые полипропиленовые микропробирки для  
ПЦР для прибора «SmartCyclerll» на 25 мкл реакционной смеси («Cepheid», США).  
Центрифуга «MiniSpin» и штатив для пробирок («Cephied», США).
4. ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
5. Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
6. Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (например,  
«Ленпипет», Россия).
7. Одноразовые наконечники для дозаторов до 200 мкл (например, «Ахудеп», США).
8. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл (например,  
«Ахудеп», США).
9. Штативы для наконечников (например, «Ахудеп», США) и микропробирок объемом  
0,2 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия), 0,1мл (например, «Corbett  
Research», Австралия).
10. Холодильник от 2 до 8 “С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
11.Отдельный халат и одноразовые перчатки.
12.Емкость для сброса наконечников.
стр. 12 из 60


--- стр. 13 ---
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АНАЛИЗА
ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ПРОБ
(проводится в ЗОНЕ 1 -  помещении для обработки исследуемого материала).
Объем пробы, необходимый для выделения ДНК, -  0,1 мл.
Порядок работы
1. Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) прогреть,  
перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.
2. Добавление реагентов.
Способ 1:
-  отобрать необходимое количество одноразовых пробирок 1,5 мл (включая 
отрицательный контроль выделения).
- ресуспендировать сорбент универсальный до гомогенной консистенции, внести в  
каждую пробирку по 20 мкл сорбента универсального и по 300 мкл лизирующего 
раствора, используя наконечники с аэрозольным барьером. Промаркировать  
пробирки.
Способ 2:
- перед началом работы во флакон с лизирующим раствором добавить весь объем  
(2 мл на 30 мл лизирующего раствора) предварительно гомогенизированного  
сорбента универсального и перемешать. Допускается хранение полученной смеси в  
течение 2 сут при комнатной температуре. Перед применением тщательно  
перемешать.
- отобрать необходимое количество одноразовых пробирок 1,5 мл (включая 
отрицательный контроль выделения) и, используя наконечник с аэрозольным  
барьером, внести в каждую пробирку по 320 мкл подготовленной смеси  
лизирующего раствора и сорбента универсального. Промаркировать пробирки.
3. В пробирки согласно маркировке внести по 100 мкл пробы, используя для каждой  
пробы отдельный наконечник с аэрозольным барьером. В пробирку отрицательного  
контроля (ОК) выделения внести 100 мкл ОКО, используя наконечник с  
аэрозольным барьером.
4. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин 
при температуре 65 °С в термостате. После окончания инкубации перемешать на  
вортексе и поставить в штатив на 2 мин.
5. Осадить сорбент универсальный в пробирках центрифугированием при 10 тыс  
об/мин в течение 30 с. Не захватывая сорбент универсальный, удалить  
надосадочную жидкость в колбу-ловушку с помощью вакуумного отсасывателя,  
используя для каждой пробы отдельный наконечник без аэрозольного барьера.
стр. 13 из 60


--- стр. 14 ---
6. Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до  
полного ресуспендирования сорбента универсального.
7. Повторить п. 5.
8. Поместить пробирки в термостат с температурой 65 ®С на 5-10 мин для 
подсушивания сорбента универсального. При этом крышки пробирок должны быть  
открыты.
9. В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать на  
вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального. Поместить в  
термостат с температурой 65 °С на 5 мин.
10. Перемешать на вортексе. Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 
1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК  
(ДНК-проба). Указанный материал готов к постановке ПЦР.
ДНК-пробы можно хранить в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С и в
течение года при температуре не выше минус 16 °С.
Пробирки с ДНК-пробами переносят в зону ПЦР-амплификации.
ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ПРОДУКТОВ  
АМПЛИФИКАЦИИ
(проводится в ЗОНЕ 2 -  помещении для проведения ПЦР-амплификации).
Общий объем реакции -  25 мкл, объем ДНК-пробы -  10 мкл.
В комплекте реагентов применяется «горячий старт», который обеспечивается  
использованием химически модифицированной Taq-полимеразы (TaqF-ДНК-  
полимераза), которая активируется при прогреве реакционной смеси при 95 °С в  
течение 15 мин.
Проведение амплификации с использованием «ПЦР-комплекта» вариант скрин-титр- 
FRT 2х
А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР
1. Подготовить реакционную смесь (см. табл. 1 и 2) на необходимое количество  
реакций. При расчете следует учитывать, что каждая постановка реакции  
амплификации сопровождается постановкой как минимум четырех контрольных  
точек (отрицательного контроля и трёх калибраторов). Кроме того, необходимо  
брать реагенты с запасом; рассчитывать на одну реакцию больше. Расчет  
производится исходя из того, что на каждую постановку ПЦР идет:
- 7,0 мкл ПЦР-смеси-1-FRT ВПЧ А9 или ПЦР-смеси-1-FRT ВПЧ А7+;
- 7,5 мкл ПЦР-буфера-FRT;
- 0,5 мкл полимеразы (TaqF).
стр. 14 из 60


--- стр. 16 ---
Количество образцов, N 1 2 3 4 5 6 7
смесь ПЦР-буфера-FRT и 
полимеразы (TaqF), мкл 48 56 64 72 80 88 96
ПЦР-смесь-1-FRT А9, мкл 
(синяя крышка) 42 49 56 63 70 77 84
Количество образцов, N 8 9 10 11 12 13 14
смесь ПЦР-буфера-FRT и 
полимеразы (TaqF), мкл 104 112 120 128 136 142 150
ПЦР-смесь-1-FRT А9, мкл 
(синяя крышка) 91 98 105 112 119 126 Вся
пробирка
- Смешать в отдельной пробирке часть полученной смеси ПЦР-буфера-FRT и  
полимеразы (TaqF) с ПЦР-смесью-1-FRT А7+ (зеленая крышка).
Количество образцов, N 1 2 3 4 5 6 7
смесь ПЦР-буфера-FRT и 
полимеразы (TaqF), мкл 48 56 64 72 80 88 96
ПЦР-смесь-1-FRT А7+, 
мкл (зеленая крышка) 42 49 56 63 70 77 84
Количество образцов, N 8 9 10 11 12 13 14
смесь ПЦР-буфера-FRT и 
полимеразы (TaqF), мкл 104 112 120 128 136 142 150
ПЦР-смесь-1-FRT А7+, 
мкл (зеленая крышка) 91 98 105 112 119 126 Вся
пробирка
3. В половину пробирок внесите по 15 мкл приготовленной смеси ВПЧ FRT А9 в другую  
половину - приготовленной смеси ВПЧ FRT А7+.
4. В готовые пробирки, используя наконечники с аэрозольными барьерами, внести по  
10 мкл ДНК-проб, выделенных из исследуемых или контрольных проб этапа  
выделения ДНК. ДНК-пробы сначала добавлять в пробирку с приготовленной  
смесью ВПЧ FRT А9, потом в пробирку со смесью ВПЧ FRT А7+ (см. схему 1).  
ВНИМАНИЕ! При добавлении ДНК-проб необходимо избегать попадания  
сорбента в реакционную смесь для ПЦР.
5. Поставить контрольные и калибровочные реакции амплификации; (для каждой 
смеси):
а) отрицательный контроль (К-) -  вместо ДНК-пробы внести по 10 мкл ДНК-  
буфера в пробирку с приготовленной смесью ВПЧ FRT А9, потом в пробирку со  
смесью ВПЧ FRT А7+;
б) калибраторы ВПЧ (К1, К2, КЗ) -  в три пробирки с приготовленной смесью ВПЧ  
FRT А9 внести по 10 мкл каждого ДНК-калибратора ВПЧ (К1 ВПЧ, К2 ВПЧ,  
КЗ ВПЧ), в три пробирки с приготовленной смесью ВПЧ FRT А7+ внести по 10 
мкл каждого ДНК-калибратора ВПЧ (К1 ВПЧ, К2 ВПЧ, КЗ ВПЧ).
стр. 16 из 60


--- стр. 17 ---
Схема 1
2 пробирки -  на 
один клинический 
обпазеи
Размещение пробирок и внесение реагентов 
(только ПРИ использовании пробирок)
К2ВПЧ
(б )@ @ ® (о )(о )@ (о )@ (о )(о )(5 )@ (§ ^(5 ]|§ : ш 5 ©
§ § ©
t
Образиы с I по 14
КЗ ВПЧ 
К2ВПЧ 
KI ВПЧ
■  Смесь ВПЧ FRT А9 - синяя крышка  
'Смесь ВПЧFRTА7+ -  зеленая крышка
отрицательные контроли
ВНИМАНИЕ! В случае если используется планшет для ПЦР (лрибор «iQ iCycler»)  
необходимо вносить образцы согласно порядку установки пробирок в прибор  
(см. приложение «Проведение амплификации и анализ результатов для прибора  
iQ iCycler»).
Б. Проведение реакции амплификации
1. Установите пробирки в реакционный модуль.
2. Запрограммируйте прибор для выполнения соответствующей программы  
амплификации и детекции флуоресцентного сигнала согласно описанию для данного  
прибора (см. приложения).
3. Анализ результатов осуществляется автоматически в программном обеспечении,  
соответствующем используемому оборудованию.
Принципы, лежащие в основе автоматического анализа данных:
Сигнал в данной пробирке по данному каналу считается положительным, если  
соответствующая кривая накопления флуоресценции пересекает линию порога.  
Характеристикой данного сигнала является пороговый цикл -  цикл, которому  
соответствует точка пересечения флуоресцентной кривой и линии порога. Именно  
значения пороговых циклов анализируются программой автоматического учета  
результатов. В соответствие с этими значениями автоматически происходит  
построение калибровочной прямой и расчет концентраций ДНК человека и ДНК ВПЧ.  
Конечный результат нормированной концентрации ДНК ВПЧ на количество клеток  
человека рассчитывается по формуле:
число копий ДНК ВГГЧ 
число копий ДНК человека X200000 = lg(bIT4 на 100 тыс. клеток)
Для каждой серии набора реагентов существуют значения концентраций  
калибраторов. Эти значения указываются во вкладыше, прилагаемом к набору  
реагентов, и должны быть указаны в соответствующих ячейках программы  
автоматической интерпретации результатов.
стр. 17 из 60


--- стр. 18 ---
Вся постановка считается валидной  если:
- в отрицательных контролях сигнал отсутствует по всем каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow/HEX/TET):
-  во всех калибраторах выявляются сигналы по всем каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow/НЕХЯЕТ).
- значение коэффициента корреляции калибровочных прямых для всех каналов не  
ниже 0,98.
ВНИМАНИЕ! В случае невалидности постановки все полученные данные  
считаются недостоверными, требуется повтор постановки.
Результат выявления ДНК ВПЧ данного образца считается:
Отрицательным, если в обеих пробирках для данного образца регистрируется сигнал  
внутреннего контроля (ВК) (канал FAM/Green) и при этом количество клеток человека  
на реакцию более 500.
Положительным, если регистрируется сигнал по каналу JOE/Yellow/HEX/TET хотя бы в  
одной из двух пробирок. Результат:
- один или несколько типов из филогенетической группы А9 (если сигнал выявлен в  
пробирке со смесью ВПЧ FRT А9);
- один или несколько типов из филогенетической группы А7 или 51/56 типы (если  
сигнал выявлен в пробирке со смесью ВПЧ FRT А7+).
Невалидным,
- если ни в одной из 2-х пробирок не регистрируется положительных сигналов по  
каналам (JOE/Yellow/HEX/TET) (А9, А7, А5/А6), а сигнал внутреннего контроля  
(FAM/Green) не регистрируется или количество клеток человека на реакцию не  
превышает 500.
- в образце регистрируется слабоположительный(ые) сигнал(ы) по каналу  
JOE/Yellow/HEX/TET, однако сигнал внутреннего контроля (FAM/Green) не  
регистрируется или количество клеток на реакцию не превышает 500.
ВНИМАНИЕ! Невалидный результат требует повторного исследования образца,  
начиная с этапа выделения ДНК или взятие материала.
стр. 18 из 60


--- стр. 19 ---
Проведение амплификации с использованием «ПЦР-комплекта» вариант скрин-титр- 
FRT4X
А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР
1. Предварительно необходимо подготовить смесь ПЦР-буфера-FRT и полимеразы 
(TaqF). Содержимое одной пробирки с полимеразой (TaqF) (0,02 мл) необходимо 
полностью перенести в пробирку с ПЦР-буфером-FRT (0,3 мл) и аккуратно  
перемешать на вортексе, не допуская образования пены. Промаркировать пробирку,  
указав дату приготовления смеси. Для смешивания реагентов использовать только  
стерильные наконечники с аэрозольным барьером.
ВНИМАНИЕ! Приготовленная смесь рассчитана на проведение 40 реакций. Смесь  
хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 3 мес и использовать по мере  
необходимости.
2. Поставить в штатив необходимое количество пробирок для амплификации  
исследуемых и контрольных образцов ДНК. Тип микропробирок зависит от  
используемого прибора.
3. Внести реактивы в пробирки (см. табл. 3).
Таблица 3
Способы внесения реактивов в пробирки
Первый способ -  экономный Второй способ
1. Раскапать в микропробирки по 7 
мкл ПЦР-смеси-1-FRT ВПЧ скрин- 
титр
2. Раскапать сверху по 8 мкл 
приготовленной смеси ПЦР- 
буфера-FRT и полимеразы 
(TaqF)
1. Приготовить реакционную смесь на  
необходимое количество реакций - смешайте в 
отдельной пробирке ПЦР-смесь-1-FRT ВПЧ 
скрин-титр и приготовленную смесь ПЦР- 
буфера-FRT и полимеразы (TaqF) из расчета 
на каждую реакцию:
- 7 мкл ПЦР-смеси-1-FRT ВПЧ скрин-титр;
-  8 мкл смеси ПЦР-буфера-FRT и  
полимеразы (TaqF).
При расчете следует учитывать, что постановка 
сопровождается постановкой как минимум  
четырех контрольных точек (отрицательного 
контроля и трёх калибраторов). Кроме того, 
необходимо брать реагенты с запасом; рассчи­
тывать на одну реакцию больше (см. табл. 4).
2. Раскапать приготовленную смесь в
микропробирки по 15 мкл.__________________
ВНИМАНИЕ! Смесь полимеразы (TaqF), ПЦР-буфера-FRT и ПЦР-смеси-1-FRT ВПЧ  
скрин-титр должна быть использована в течение 2 ч после приготовления!
сто. 19 из 60


--- стр. 20 ---
Таблица 4
Схема приготовления реакционных смесей для п исследуемых образцов,
Необходимо
исследовать
образцов:
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
ПЦР-смесь-1-FRT 
ВПЧ скрин-титр, 
мкл
56 63 70 77 84 91 98 105 112 119 126 133 140 147 154
смесь ПЦР- 
буфера-FRT и 
полимеразы 
(TaqF), мкл
64 72 80 88 96 104 112 120 128 136 144 152 160 168 176
Необходимо
исследовать
образцов:
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
ПЦР-смесь-1-FRT 
ВПЧ скрин-титр, 
мкл
161 168 175 182 189 196 203 210 217 224 231 238 245 252 259
смесь ПЦР- 
буфера-FRT и 
полимеразы 
(TaqF), мкл
184 192 200 208 216 224 232 240 248 256 264 272 280 288 296
4. В готовые пробирки внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из клинических проб. 
ВНИМАНИЕ! При добавлении ДНК-проб необходимо избегать попадания  
сорбента в реакционную смесь для ПЦР.
5. Поставить контрольные и калибровочные реакции амплификации;
а) отрицательный контроль (К-) -  внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера;
б) калибраторы ВПЧ (К1, К2, КЗ) -  в три пробирки внести по 10 мкл каждого ДНК-  
калибратора ВПЧ (К1 ВПЧ. К2 ВПЧ, КЗ ВПЧ).
Б. Проведение реакции амплификации
1. Установить пробирки в реакционный модуль.
2. Запрограммируйте прибор для выполнения соответствующей программы  
амплификации и детекции флуоресцентного сигнала согласно описанию для данного  
прибора (см. приложения).
3. Анализ результатов осуществляется автоматически в программном обеспечении,  
соответствующем используемому оборудованию.
Принципы, лежащие в основе автоматического анализа данных:
Сигнал в данной пробирке по данному каналу считается положительным, если  
соответствующая кривая накопления флуоресценции пересекает линию порога.  
Характеристикой данного сигнала является пороговый цикл -  цикл, которому  
соответствует точка пересечения флуоресцентной кривой и линии порога. Именно  
значения пороговых циклов анализируются программой автоматического учета  
результатов. В соответствие с этими значениями автоматически происходит
стр. 20 из 60


--- стр. 21 ---
построение калибровочной прямой и расчет концентраций ДНК человека и ДНК ВПЧ.  
Конечный результат нормированной концентрации ДНК ВПЧ на количество клеток  
человека рассчитывается по формуле:
Ig
число копий ДНК ВПЧ 
число копий ДНК человека
X 200000 = lg(Bn4 на 100 тыс. клеток)
Для каждой серии набора реагентов существуют значения концентраций  
калибраторов. Эти значения указываются во вкладыше, прилагаемом к набору  
реагентов, и должны быть указаны в соответствующих ячейках программы  
автоматической интерпретации результатов.
Вся постановка считается валидной,  если;
- в отрицательных контролях сигнал отсутствует по всем каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red);
- во всех калибраторах выявляются сигналы по всем каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red);
-  значение коэффициента корреляции калибровочных прямых для всех каналов не  
ниже 0,98.
ВНИМАНИЕ! В случае невалидности постановки все полученные данные  
считаются недостоверными, требуется повтор постановки.
Результат выявления ДНК ВПЧ данного образца считается:
Отрицательным, если в образце регистрируется сигнал внутреннего контроля (ВК)  
(канал FAM/Green) и при этом количество клеток человека на реакцию более 500.  
Положительным, если;
- регистрируется сигнал по каналу JOE/Yellow -  результат: один или несколько типов  
из филогенетической группы А9 (16, 31, 33, 35, 52, 58);
- регистрируется сигнал по каналу ROX/Orange -  результат: один или несколько типов  
из филогенетической группы А7 (18, 39, 45, 59);
- регистрируется сигнал по каналу Cy5/Red -  результат: 51 и/или 56 тип(ы)  
(филогенетические ветви А5 и А6).
Невалидным, если в образце не регистрируется положительных сигналов по каналам  
(JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red) (А9, А7, А5/А6), а сигнал внутреннего контроля  
(FAM/Green) не регистрируется или количество клеток человека на реакцию не  
превышает 500.
ВНИМАНИЕ! Невалидный результат требует повторного исследования образца,  
начиная с этапа выделения ДНК или взятия материала.
стр. 21 из 60


--- стр. 22 ---
СРОК годности. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 6 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не
подлежит.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С  
не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными  
температурами хранения.
Хранение. Комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» хранить при температуре от 2 до 25 °С. 
«ПЦР-комплект» (кроме полимеразы (TaqF), ПЦР-смеси-1-FRT ВПЧ скрин-титр, ПЦР-  
смеси-1-FRT ВПЧ А9 и ПЦР-смеси-1-FRT ВПЧ А7+) хранить при температуре от 2 до 
8 °С. ПЦР-смесь-1-FRT ВПЧ скрин-титр, ПЦР-смесь-1-FRT ВПЧ А9, ПЦР-смесь-1-FRT  
ВПЧ А7+ и полимеразу (TaqF) хранить при температуре не выше минус 16 °С.
стр. 22 из 60


--- стр. 23 ---
гарантийные  обязательства  производителя
Производитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик  
набора реагентов, требованиям, указанным в технической и эксплуатационной  
документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий  
транспортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество комплекта реагентов «АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-  
FL» направлять по адресу 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, e-mail:  
cs@pcr.ru^.
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению  
набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и  
обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников  
при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется направить  
сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную государственную  
регулирующую организацию (в РФ -  Федеральная служба по надзору в сфере  
здравоохранения) в соответствии с действующим законодательством.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ  
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии  
Роспотребнадзора Е.Н. Родионова
Главный врач ФГБУ «Поликлиника №1»  
Управления делами Президента  
Российской Федерации Е.В. Ржевская
^  Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету потребителя на сайте:  
www.amplisens.ru .
сто. 23 из 60


--- стр. 24 ---
символы, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ
REF| Номер по каталогу
lot |
О Й ]
I
м 1
А
Код партии
Медицинское изделие для 
диагностики in vitro
Температурный диапазон
Изготовитель
Осторожно! Обратитесь к 
инструкции по применению
2
VER
□ 3
н
Содержимого достаточно 
для проведения п- 
количества тестов
Использовать до
Дата изменения
Обратитесь к инструкции по 
применению
Дата изготовления
стр. 24 из 60


--- стр. 25 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ  
ДВУХКАНАЛЬНОГО ПРИБОРА «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research»,  
Австралия)
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и  
программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-  
Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для  
русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.
Проведение реакции амплификации
1. Включите прибор, запустите программу RotorGene.
2. Для дальнейшей автоматической обработки результатов выберете один из  
вариантов установки пробирок в барабан прибора:
- Установите последовательно начиная с первой ячейки все пробирки со смесью ВПЧ  
FRT А9, затем, не меняя порядка все пробирки со смесью ВПЧ FRT А7+; 
ВНИМАНИЕ! Если вы проводите исследование менее чем 14 образцов  
(нелолная загрузка карусели), то необходимо выставлять пробирки со  
смесью ВПЧ FRT А9 начиная с 19 ячейки барабана для адекватной  
интерпретации результатов реакции.
- Установите пробирки попарно: смесь ВПЧ FRT А9 и смесь ВПЧ FRT А7+ для первого
образца, смесь ВПЧ FRT А9 и смесь ВПЧ FRT А7+ для второго образца и т.д ......
смесь ВПЧ FRT А9 и смесь ВПЧ FRT А7 для калибратора К1, смесь ВПЧ FRT А9 и  
смесь ВПЧ FRT А7+ для калибратора К2, смесь ВПЧ FRT А9 и смесь ВПЧ FRT 7+ для  
калибратора КЗ, смесь ВПЧ FRT А9 и смесь ВПЧ FRT А7+ для отрицательного  
контроля амплификации К-.
ВНИМАНИЕ! Если вы не полностью заполняете карусель прибора, то ее следует  
уравновесить. Для этого заполните незанятые места пустыми пробирками (не  
используйте пробирки от предыдущих экспериментов).  Лунка 1 обязательно  
должна быть заполнена какой-либо исследуемой пробиркой (не пустой).
3. Установите карусель в прибор, закройте крышку.
4. Запустите программу амплификации. Для этого  
способов:
Использование шаблонного Файла для запуска программы амплификации  
ВНИМАНИЕ! Для проведения амплификации настоятельно рекомендуется  
использование прилагаемого к комплекту реагентов шаблонного файла  
«AmpliSens FRT HR HPV Screen RG2x.ret».
Для использования шаблона для данного набора реагентов необходимо  
предварительно скопировать прилагающийся к комплекту файл «AmpliSens FRT HR  
HPV Screen RG2x.ret»  в папку «Templates» папки программы «RotorGene». При  
установке «Rotor-Gene» по умолчанию путь к указанной папке следующий:  
«C:\Program Files\RotorGene 6\Templates» -  для прибора «Rotor-Gene» 3000 и  
«C:\Program Files\RotorGene 6000 Software\Templates» -  для прибора «Rotor-Gene»  
6000. После выполнения этой процедуры в окне «New Run»/«HoBbm тест»  
(вызывается кнопкой «New»/«HoBbm» панели инструментов) появится пункт  
«AmpliSens FRT HR HPV Screen RG2x».  Его и следует выбирать для запуска нового  
эксперимента.
Примечание: шаблонный файл можно открыть из другой папки. Для этого в окне  
«New Рип»/«Новый тест» выберите вкладку «Advanced»/«Дemaльный мастер» и в  
ней пункт «Open А Template In Another Folder...»/«Открыть шаблон из другой  
папки...», далее перейдите в папку, содержащую файл «AmpliSens FRT HR HPV  
Screen RG2x.ret» и откройте его.
используйте один из следующих
стр. 25 из 60


--- стр. 26 ---
в шаблонном файле уже заданы все необходимые параметры амплификации,  
поэтому необходимо только внести данные об эксперименте и расшифровку  
образцов.
Самостоятельное программирование
- Запустите мастер нового эксперимента в режиме «Advanced»/«Дeтaльный  
мастер»:
- В окне, следующем после окна выбора ротора, необходимо установить объем  
реакционной смеси Reaction volume/Объем реакции (pL)  равный 25. Для прибора  
«Rotor-Gene» 6000 так же необходимо установить галочку напротив параметра 15 pL oil  
layer volume/15 pL объем масла/воска,
- Задайте программу амплификации (см. табл. 5);
Программа амплификации ДНК ВПЧ ВКР
Таблица 5
16, и 3, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов
Этап Температура, °С Время Измерение
ФЛУОР^
Повторов
Hold/Удерж.темп-ры 95 15 мин 1
Но1с12/Удерж. темп-ры2 65 2 мин - 1
Cycling/ Циклирование
95 20 с -
5
64
Touchdown;
1 deg. per cycle /  
Снижать темп-ру 
шага
на 1 град, каждый 
цикл
25 с -
65 55 с —
СусНпд2/Циклирование2
95 15с —
4060 25 с —
65 40 с FAM/Green,
JOE/Yellow
Примечание. Для задания программы амплификации можно воспользоваться  
прилагаемым к комплекту реагентов файлом в формате ПО «RotorGene»  
(AmpliSens FRT HR HPV Screen-titr RG2x Program.pro).
ВНИМАНИЕ! Можно также использовать универсальную программу амплификации и  
детекции «АмплиСенс-1 RG» (см. табл. 6). С использованием этой программы можно  
одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов по единой  
программе (например, совместно с тестами для выявления ДНК возбудителей ИППП).  
Аналитические характеристики данного набора реагентов при использовании  
универсальной программы амплификации не изменяются.
Таблица 6
Программа амплификаь ИИ «АмплиСенс-1 RG»
Этап Температура, “С Время Измерение
флуор. Повторов
Hold/Удерж.темп-ры 95 15 мин — 1
Cycling/ Циклирование
95 5с —
560 20 с —
72 15 с -
СусНпд2/Циклирование2
95 5с —
4060 20 с
FAM/Green,
JOE/Yellow,
ROX/Orange,
Cv5/Red
72 15с -
стр. 26 из 60


--- стр. 27 ---
Примечание. Каналы ROX/Orange и Cy5/Red включаются при необходимости, если  
проводятся тесты в формате «мультиплекс», для которых используются эти  
каналы.
■  З а д а й т е  п ар ам етр ы  калибровки « C a lib ra te » /« G a in  O ptim isation»/«O nT.ypoB H fl сигн.»
в «Advanced»/«Дeтaльный мастер» -  мастере нового эксперимента):
а) осуществлять калибровку по каналам FAM/Green, JOE/Yellow (нажать кнопку  
«Calibrate Acquiring»/«Optimise Асди1ппд»/«Опт.детек-мых»);
б) калибровать перед первым измерением («Perform Calibration Before 1® *
Acquisition»/« Perform Optimisation Before 1®* Acquisition»/«Bыпoлнить
оптимизацию при 1-м шаге детекции»);
в) устан о в ка калибровки ка н а л а для всех кр а си те л е й  о т 4 F I д о 8F I (кнопка  
« E d it...» /« rip a B K a ...» , окно «A uto gain calibration ch an n el settings»/«ABTO -  
о п ти м и зац и я уровня си гн а л а »).
3. Запустите амплификацию, выбрав кнопку «Start гип»/«Старт» и присвоив имя файлу  
эксперимента.
4. Внесите данные в таблицу образцов (открывается автоматически после запуска  
амплификации). В колонке «Мате»/«Имя» укажите названия/номера исследуемых  
клинических образцов. Так как для анализа образца используется две пробирки, то  
для правильной автоматической интерпретации результатов присвойте обеим  
пробиркам, соответствующим данному образцу одинаковое имя. Напротив всех  
исследуемых образцов, включая контрольные, установите тип «ипкпо\л/п»/«Образец».  
Для ячеек, соответствующих пустым пробиркам установите тип «Мопе»/«Пусто».  
Калибраторы назовите «К1», «К2», «КЗ», отрицательный контроль -  «К-».
ВНИМАНИЕ! При установке типа «Нопе»/«Пусто» данные образца не  
анализируются.
ОБРАБОТКА И АНАЛИЗ ДАННЫХ 
Оценка данных
Просмотрите необработанные данные прибора по двум каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow) выбирая кнопки «Cycling А...»  на панели «СЬаппе1з»/«Каналы». Обратите  
внимание на следующие моменты;
■ среди всех сигналов образцов по каналу должен быть хотя бы один положительный  
(положительный сигнал имеет характерную S-образную кривую накопления  
флуоресценции см. рис. 1). При правильной постановке и течении эксперимента  
обязательно должны присутствовать сигналы калибраторов К1, К2, КЗ.
ВНИМАНИЕ! При полном отсутствии положительных сигналов по  
флуоресцентному каналу обработка данных канала может дать некорректный  
результат.
■ наличие образцов с фоновым сигналом, резко отличающимся от большинства  
свидетельствует об ошибке при внесении в пробирку реакционной смеси или  
образца ДНК (см. рис. 26 и раздел «Возможные проблемы и ошибки).
Допускается разница в фоновых сигналах смесей ВПЧ FRT А9 и ВПЧ FRT А7+
Обработка данных
1. Удостоверьтесь, что все анализируемые образцы активны в легенде справа.
2. Запустите функцию «Analysis»/«Aнaлиз», выберите вкладку
«Quantitation»/«Koличecтвeнный» и в ней канал FAM/Green, затем кнопку  
«Show»/« Показать».
3. После открытия окна «Quantitation analysis»/«Koличecтвeнный анализ» вручную  
установите пороговый цикл; Threshold/Порог = 0,03.
4. В ы берите л инейны й тип ш калы  (« L in e a r ес а1е»/«Л и н ей н ая ш к а л а » ), акти в и р уй те  
парам етры  « D y n a m ic  tu b e » /« Д и н a м и ч .ф o н » , «S lo p e  C orrect»/«KoppeK T.yK noHa».
5. Выберите параметр « M o re  se ttin g s»/«O u tlier R e m o v a l» /« y c T p a H e H n e  выбросов» и  
установите значение порога отрицательных проб (NTC threshold /Порог Фона - ПФ)  
равным 15 %.
ВНИМАНИЕ! Достаточно редко из-за нисходящего характера кривых в начале
стр. 27 из 60


--- стр. 28 ---
эксперимента возможно явление пересечения линии порога (Threshold/Порог) и  
кривых флуоресценции на первых циклах, при этом программа RotorGene может  
засчитывать данные пересечения за положительный сигнал (рис. 7).  Для 
устранения эффекта воспользуйтесь функцией «Eliminate cycles  
before...»/«Исключить циклы до...», задав значение 5, проигнорировав тем самым  
пересечение порога и кривой флуоресценции на первых пяти циклах.
6. В таблице результатов («Quant. Пези11з»/«Количественные результаты»): выделите  
колонку « N am e »/«M M H » однократно иделкнув мышью на заголовке. Скопируйте  
колонку, выбрав «Сору»/«Копировать» из контекстного меню (вызывается правой  
кнопкой мыши) (рис. 9).
7. Откройте прилагаюицийся к комплекту реагентов файл Microsoft® Excel «AmpliSens  
FRT HR HPV Screen RG2x Results Matrix.xls»,  согласитесь на включение макроса.  
Примечание: если при открытии документа Excel не активируется макрос  
(выдается соответствующее сообщение, кнопка «Результаты» неактивна)  
необходимо изменить уровень безопасности Microsoft® Excel. Для этого выберите  
в меню пункт «Сервис»>«Макрос»>«Безопасность...» и установите средний  
уровень безопасности.
Чтобы экспортировать (копировать) таблицу результатов анализа в Excel без  
искажения русского шрифта, необходимо переключить свою клавиатуру на  
русский шрифт перед тем как нажать в меню «Экспорт в Excel» или  
«Копировать».
8. Установите курсор на ячейку «Name» столбца «Обозначение образца» таблицы  
«Данные прибора» и выберите «Вставить» из контекстного меню {рис. 10).
9. Аналогично выберите и скопируйте колонку «Ct» из таблицы результатов  
(«Quant.Results»/«Koличecтвeнныe результаты»). Установите курсор в таблице Excel  
в ячейку «Ct» под названием флуоресцентного красителя FAM/Green.
10. Повторите процедуру флуоресцентного красителя JOE/Yellow.
11. Установите режим «Количественный анализ», внутренняя калибровка.
12. Внесите данные концентраций калибраторов в таблицу «Знач. калибр.»  в 
соответствие с вкладышем к данной серии набора реагентов.
13. В столбце «Обозначение» проверьте, что калибратор К1 имеет имя «К1»,  
калибратор К2 имеет имя «К2», калибратор КЗ имеет имя «КЗ» (без пробела между  
буквой К и цифрой), отрицательный контроль -  «К-» или «-»
14. Сохраните файл Microsoft® Excel под другим именем.
Анализ данных
Анализ данных осуществляется автоматически. После внесения всех данных в матрицу  
данных Excel, нажмите кнопку результаты.  В колонке «результаты» появятся  
выявленные в образцах филогенетические группы ВПЧ, а так же результат:  
положительный (pos), отрицательный (пед),  слабоположительный (weak),  невалидный
{NN).
Далее в таблице отображается количество клеток человека на реакцию, используется  
для оценки валидности образца. Далее приводятся расчеты концентрации ДНК ВПЧ,  
выраженной в 1д на 10® клеток по группам и суммарная вирусная нагрузка. В последнем  
столбце приводится возможная трактовка клинической значимости результата в
Результат 1 д  (копий Д Н К ВПЧ на  
100 тыс клеток) Трактовка
<3 Клинически малозначимая
3-5 Клинически значимая. Нельзя исключить  
дисплазию, существует риск развития дисплазии
>5 Клинически значимая, повышенная. Высокая  
вероятность наличия дисплазии
стр. 28 из 60


--- стр. 29 ---
Для корректной обработки данных программой необходимо в колонке «Name»:
■ обозначить пробирки с разными смесями, но соответствующие одному образцу  
одинаковым именем;
■ обозначить положительные контроли как «+» или «К+», а отрицательные контроли  
как «-» или «К-».
ВОЗМОЖНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ОШИБКИ
Перед использованием набора реагентов рекомендуется изучить этот раздел.
Возможные
Проблемы Причина Как выявить? Способы
устранения
Отрицательные
образцы
анализируются
программой
RotorGene  как
положительные.
Неправильная  
математическая  
обработка отрицательных  
образцов при наличии  
участка падения  
флуоресценции на  
начальных циклах  
(рис. 2а, 8)
Пересечение линией  
порога нисходящих кривых  
флуоресценции на  
начальных циклах (рис.7)
Типичный
положительный образец  
имеет характерную S-  
образную кривую  
накопления
флуоресценции (рис. 1, 3  
-  6). Некорректно  
обработанные  
отрицательные образцы  
имеют вид довольно  
прямых линий, идущих  
снизу вверх (рис. 8) ______
Необходимо  
воспользоваться  
функцией «Ignore  
Rrst»/«MzHop. 
первые»  выбрав  
значение 5 циклов.  
Если это не приводит  
к должному  
результату  
попробуйте  
увеличить это  
значение иа 1 -  5.
На графике  
обработанных кривых  
флуоресценции красная  
линия порога  
(Threshold/Порог)  
пересекает или  
«задевает» кривые  
флуоресценции в левой  
части графика (первые  
циклы) (рис. 7)
воспользуйтесь  
функцией «Eliminate  
cycles before...»/  
«Исключить циклы  
до...»,  задав  
значение 5,  
(игнорируется  
пересечение порога и  
кривой
флуоресценции на  
первых 5 циклах)
Снижение  
чувствительности  
из-за загрязнения  
линз прибора
Загрязнение линз ведет к  
снижению эффективности  
возбуждения и  
регистрации  
флуоресценции, что в  
первую очередь  
сказывается на образцах с  
малым количеством  
специфичной ДНК,  
даю щих малое  
увеличение
флуоресценции____________
Низкие значения  
фонового сигнала по  
всем 4 каналам  
измерения
ф луоресценции(<1)при  
максимальном значении  
умножителя «gain» (10).
Проводить очистку  
горизонтальной и  
вертикальной линз  
прибора сухим  
одноразовым ватным  
тампоном не реже 1  
раза в месяц
Снижение  
чувствительности  
из-за разрушения  
зондов
Неправильное хранение  
или эксплуатация  
реагентов комплекта  
(повышенная  
температура,  
многократное открывание  
пробирок со смесями,  
работа в загрязненных  
условиях) могут приводить  
к разрушению  
олигонуклеотидов
Разрушение зондов  
может быть выявлено  
только при сравнении  
данных экспериментов в  
начале и по прошествии  
определенного времени  
использования  
реагентов или при  
сравнении с адекватно  
хранящимися  
реагентами той же  
серии.  Выявляется по  
снижению значения  
автоматически  
выбираемого ____________
Использовать смеси,  
хранившиеся в  
адекватных условиях  
с неистекшим сроком  
годности (см.  
Хранение)
сто. 29 из 60


--- стр. 30 ---
Возможные
Проблемы Причина Как выявить? Способы
устранения
коэффициента 
умножения gain в разных 
экспериментах более 
чем на 2 единицы {при 
использовании одного и  
того же прибора).  
ВНИМАНИЕ! эффект 
увеличения умножителя 
gain может также 
наблюдаться после 
очистки линз прибора от 
сильного загрязнения
Снижение 
чувствительности 
из-за снижения 
активности TaqF- 
полимеразы
Неправильное хранение 
полимеразы или 
нарушение условий 
стерильности приводит к 
разрушению фермента
Выявляется по 
отсутствию сигнала 
положительного 
контроля или если 
значение порогового 
цикла положительного 
контроля выше порога 
слабых образцов
Использовать 
адекватно 
хранящийся (см. 
Хранение)  или новый 
фермент.
Примечание. Информацию по всем установленным параметрам эксперимента, а так же  
отчет по автокалибровке можно найти, просмотрев установки эксперимента (кнопка  
«8еШпдз»/«Установки»). В частности, вкладка «Меээадезя/кСообщения» пункт
Возможные ошибки Признаки Способ устранения
Контаминация специфичной 
ДНК
Появление сигнала по любому 
каналу в отрицательном 
контроле
Повторное проведение 
эксперимента, принятие мер 
по выявлению и устранению 
источника контаминации
В пробирку не 
внесено/внесено меньше 
образца ДНК
Фоновый сигнал образца сильно 
превосходит другие (видно на 
необработанных кривых) (рис. 
26). Образец отрицательный.
Повторное исследование 
образца, начиная с этапа ПЦР
В пробирку не 
внесено/внесено меньше 
реакционной смеси или 
внесено больше образца ДНК
Фоновый сигнал образца сильно 
ниже других (видно на 
необработанных кривых) (рис. 
26).
Если образец отрицательный, 
требуется повторное 
исследование, начиная с 
этапа ПЦР
Не задан параметр 
автокалибровки от 4FI до 8FI 
или ошибка в первой 
пробирке барабана (ее 
отсутствие, неправильное 
внесение образца ДНК или 
реакционной смеси)
Большинство фоновых сигналов 
флуоресценции меньше 1 или 
больше 20
Задать параметр при 
следующем запуске. Если 
произошел «зашкал» или 
сигналы очень слабые (при 
обработке нет положительных 
сигналов, фон меньше 0,5) 
необходим повтор 
исследования начиная с этапа 
ПЦР.
При приготовлении смеси 
реагентов не внесена TaqF- 
полимераза
Ни в одном образце, включая 
положительный контроль, не 
регистрируется ни один 
положительный сигнал
Повторное исследование с 
правильно приготовленными 
смесями (начиная с этапа
_[ЩР)______________________
сто. 30 из 60


--- стр. 31 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ. РИСУНКИ
I. Необработанные данные
II. Обработанные данные
а) нормальные кривые после обработки (типичный S-образный вид, линия порога  
пересекает кривые только в области накопления флуоресценции)
Ч о л п
0 ,1 5
0 ,1 _
од е
0
F k jo r o . i4 o r m
О .Э
0,1_
0
F U o r o ,
T fr e ih o W
to  " 5  * 1 0  '1 5  '2 0  '2 5  * 3 0  “ S S  '4 C y d e
’ис.З. Канал Fam -  внутренний контроль (Ь-глобиновый ген)
to  * 5  '1 0  '1 5  '2 0  to 5  '3 0  '3 5  '«yds
Phc,4, Канал Cy5
« л я
0 ,1 5
0 ,1
од е
0
П и о г о .
0 ,2 5
0 ,2
0 ,1 5
0 ,1
0 ,0 5
О
n u o r o .
T h r M h o U  — — — ^  —  _____ T h te d id d  _
to  '5  * 1 0  '1 5  * 2 0  '2 5  'Э О  * Э 5  '« С у М
Рис.5. Канал Joe
to  '5  '1 0  '1 5  '2 0  " г б  '3 0  '3 5  '«yds
Рис.6. Канал Rox
сто. 31 из 60


--- стр. 32 ---
Анализ результатов
Quant. Results - Cycling A.JOE... -  /,□. Ш
1  Name Type 1  Cl 1  Given Cone (copC al.
842t Unknown
Unknown
i 20,06!
Unknown 31,60
Unknown
G90kt Unknown
Unknown
Unknown
25,33’
Unknown 28,82;
+ Positive Control 28,66 I
Г. Positive Control 31,89’ 1
+ Positive Control 31,86 1
+ Positive Control 28,19 1
Negative Control 
Negative Control 
Negative Control 
Negative Control
—
Рис.9, таблица результатов «Quant.Results»
Дата: Описание:
Обозначить парные  
неподписанные как пустые
Обозначить 1
Порог  слабых-  
о^изцов, Ct
Последовательность установки пробирок в  
прибор
ВК HPVA9 H PVA 7*
[по :ледовательно все пробирки со смесью A9^ затем все со смесью А7+ j
Результаты обсчета
25 33 32
Данные при 5ора
№Ns Обозначение образца
Fam
(ВИ)
Joe
<HPV) №No Обозначение обраэц! Результаты
Name Ct Ct ветвь А9 ветвь А 7.5 1 ,5G o6«Ni
1 * * * * *
2 * * * * *
3 * * * * *
4 S k •К * » ♦
5 * * * «
6 * * •к * •к
7 * * * * •к
8 Ik * * * ♦
9 * * ♦ * ♦
10
Л *- * * *
11 * * ♦ * *
12 * * * * *
13 * * * *
14 * * * *
15 * * * * •к
16 * * * * *
17 * * * * *
18 * * * * *
19 * * * * ♦
Рис. 10. программа «AmpliSens FRT HR HPV Screen RG2x Results Matrix.xls»
стр. 32 из 60


--- стр. 33 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ  
ПРИБОРА «iO iCycler» («BioRad», США)
Проведение реакции амплификации
1. Включите прибор, запустите программу «iQ iCycler».
2. Задайте схему планшета -  схему расположения пробирок в модуле и измерение  
флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам РАМ и HEX в модуле Plate  
Setup. Сохраните.
3. Поместите в модуль в соответствии с заданной схемой экспериментальные  
пробирки.
4. Запустите на амплификаторе «Ю iCycler» программу «AmpliSens FRT HR HPV Screen  
iQ» (выбрав или создав эту программу в модуле View Protocols) с заданной схемой  
планшета (см. табл. 7).
ВНИМАНИЕ! Для задания программы амплификации рекомендуется  
использовать прилагаемый к комплекту файл «AmpUSens FRT HR HPV Screen  
iQ.tmo».  Для его использования перейдите в раздел «Library» на вкладку «View  
Protocol» и далее перейдите в папку, содержащую указанный файл, однократно  
щелкните на имени файла для его активации.
Программа амплификации ДНК ВПЧ ВКР
Таблица 7
16,18, 31,33, 35, 3£ I, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов
Этап Температура Время Измерение
флуор. Повторов
1 95 °С 15 мин — 1
2 65 °С 2 мин — 1
95 °С 20 с —
3
64 “С 
Тегпо
1.0 на цикл
25 с - 5
65 “С 55 с —
95 °С 20 с -
4 60 °С 25 с - 42
65 °С 55 с РАМ, HEX
Примечание. Если прибор не откалиброван по каналу HEX, возможно использование  
канала JOE.
ВНИМАНИЕ! Можно также использовать универсальную программу амплификации и 
детекции «АмплиСенс-1 iQ» (см. табл. 8). С использованием этой программы можно  
одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов по единой  
программе (например, совместно с тестами для выявления ДНК возбудителей ИППП).  
Аналитические характеристики данного набора реагентов при использовании  
универсальной программы амплификации не изменяются.
Таблица 8
Этап Температура Время Измерение
флуор. Повторов
1 95 °С 15 мин 1
2
95 °С 5 с —
560 °С 20 с -
72 °С 15 с -
3
95 “С 5 с —
4060 °С 30 с РАМ, HEX, ROX, 
Су5
72 °С 15с -
стр. 33 из 60


--- стр. 34 ---
Примечание. Каналы ROX и Су5 включаются при необходимости, если проводятся  
тесты в формате «мультиплекс», для которых используются эти каналы.
5. Перед запуском выполнения программы в окне модуля «Run-Time Central» задайте  
измерение факторов лунок по исследуемым пробиркам -  под строкой «Select well  
factor source» выберите вариант «Experimental Plate». Используется стандартная  
программа для определения внутреннего фактора лунок (файл dynamicwf.tmo; 95 °С -  
30с далее 2 цикла с измерением флуоресценции: 95 °С -30с).
Установка пробирок в прибор.
Для дальнейшей автоматической обработки результатов выберите один из  
следующих способов установки пробирок в прибор:
- Вариант 1: Установите в прибор пару пробирок, соответствующих одному  
клиническому образцу: сначала со смесью ВПЧ FRT А9 затем ВПЧ FRT А7+. 
Затем пару, соответствующую следующему образцу и т.д.
- Вариант 2 (обратный): Установите в прибор пару пробирок, соответствующих  
одному клиническому образцу: сначала со смесью ВПЧ FRT А7+ затем ВПЧ FRT  
А9. Затем пару, соответствующую следующему образцу и т.д.
Пары пробирок устанавливаются по горизонтали слева направо.
При установке пробирок желательно не использовать краевые лунки, т.е.  
установку пробирок начинать со второй лунки во втором ряду и заканчивать  
предпоследней лункой в предпоследнем ряду. При этом, однако, в одной  
постановке будет участвовать не более 60 пробирок.
Схема 2
Установка пробирок в прибор
Пара пробирок,  
соответствующая 
одному 
клиническому 
образцу
Краевые лунки,  
желательно не 
использовать
6. После установки пробирок закройте крышку прибора и нажмите кнопку «Begin Run»,  
задайте имя файла результатов.
ОБРАБОТКА И АНАЛИЗ ДАННЫХ 
Оценка данных
Желательно после прохождения эксперимента просматривать необработанные данные  
прибора по двум каналам (FAM, HEX/JOE). Для этого выберите отображение  
информации по одному из каналов (окно «Select а Reporter»),  после чего установите  
режим отображения («Select Analysis Mode»):  «Background subtracted».
Среди всех сигналов образцов по каналу должен быть хотя бы один положительный  
(положительный сигнал имеет характерную S-образную кривую накопления  
флуоресценции). При правильной постановке и течении эксперимента обязательно  
должен присутствовать сигнал положительного контроля.
При полном отсутствии положительных сигналов по флуоресцентному каналу  
обработка данных канала может дать некорректный результат.
Обработка данных
Вернитесь к режиму отображения данных «PCR Base Line Subtracted Curve Fit».
1. Удостоверьтесь, что все анализируемые образцы отображаются. (В окне «Select  
Wells» изображение всех анализируемых лунок должно быть синим).
2. В модуле «Select Reporter» выберите канал Fam-490.
3. В модуле «Treshold Cycle Calculations» задайте параметр Baseline cycle «User  
defined». Baseline cycles «2» through «10». Обычно до задания этого параметра  
кривые флуоресценции по каналу FAM отображаются не вполне корректно, что
сто. 34 из 60


--- стр. 35 ---
4.
6.
выражается в «опрокидывании» кривых флуоресценции (начальный и конечный  
участки довольно сильно нисходящие, а не горизонтальные, см. рис. 5).
Задайте автоматический выбор порога Threshold Position -  Auto Calculated. В случае  
если при автоматическом выборе порога, пороговая линия оказывается слишком  
высоко (на уровне выхода флуоресцентных кривых на плато) необходимо задать  
режим Threshold Position -  User Defined и установить линию порога на высоте 1/3  
между базовой линией и уровнем выхода кривых на плато (см. рис 3).
В таблице результатов, однократно щелкнув ло заголовку, выделите колонку  
«Treshold Cycle СЬ>. Скопируйте колонку, нажав комбинацию клавиш «Ctrl+С».  
Откройте прилагающийся к комплекту реагентов файл Microsoft® Excel «AmpliSens  
FRT HR HPV Screen iQ Results Mathx.xls»,  согласитесь на включение макроса.  
Примечание: если при открытии документа Excel не активируется макрос  
(выдается соответствующее сообщение, кнопка «Результаты» неактивна)  
необходимо изменить уровень безопасности Microsoft® Excel. Для этого выберите  
в меню пункт «Сервис»>«Макрос»>«Безопасность...» и установите средний  
уровень безопасности.
7. Установите курсор на ячейку «Ct» под названием флуоресцентного красителя РАМ  
таблицы «Данные прибора» и выберите «Вставить» из контекстного меню.
8. Далее аналогично щелкнув по заголовку «Identifier» и нажав Ctrl+C (в программе iQ  
iCycler) установите курсор на ячейку «Identifier» столбца «Обозначение образца»  
таблицы «Данные прибора» и выберите «Вставить» из контекстного меню.
9. В модуле «Select Reporter» выберите канал Hex-530/Joe-530.
10.Обычно автоматический выбор базовой линии проходит правильно, потому кривые  
не «заваливаются». Если же все же это произошло, то в модуле «Threshold Cycle  
Calculations» задайте параметр Baseline cycle «User defined». Baseline cycles «2»  
through «10».
11.Задайте автоматический выбор порога Threshold Position -  Auto Calculated.
12. Аналогично выберите и скопируйте колонку «Threshold Cycle Ct» из таблицы  
результатов. Установите курсор в таблице Excel в ячейку «Ct» под названием  
красителя HEX.
13. В выпадающем списке «Последовательность установки пробирок в прибор»  
выберите Ваш способ установки пробирок (см. пункт «Установка пробирок»).
14. Внесите данные порогов слабых образцов в соответствие с вкладышем к данной  
серии комплекта реагентов.
15. Сохраните файл Microsoft® Excel под другим именем.
Анализ данных
Анализ данных осуществляется автоматически. После внесения всех данных в матрицу  
данных Excel, нажмите кнопку результаты. В колонке «результаты» появятся  
выявленные в образцах филогенетические группы ВПЧ, а так же результат;  
положительный (pos), отрицательный (лед), слабоположительный (weak),  невалидный  
(N/V).
Для корректной обработки данных программой необходимо в колонке «Обозначение  
образца» («Identifier»):
- обозначить пробирки с разными смесями, но соответствующие одному образцу  
одинаковым именем или обозначить только одну из пробирок, имя второй оставив  
пустым.
- обозначить положительные контроли как «+» или «К+», а отрицательные  
контроли как «-» или «К-».
стр. 35 из 60


--- стр. 36 ---
ВОЗМОЖНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ОШИБКИ
Перед использованием комплекта рекомендуется изучить этот раздел.
Возможные
Проблемы Причина Как выявить? Способы
устранения
Обработанные
кривые
флуоресценции 
(режим PCR Base  
Line Subtracted  
Curve Fit)  
«заваливаются» - 
см. рис. 5_______
Неправильная
математическая
обработка
экспериментальных
данных программой Ю
iCycler.
См. рис 5, начальный и 
конечный участки 
являются довольно 
сильно нисходящими, а 
не горизонтальными
В модуле «Threshold 
Cycle Calculations» 
задайте параметр 
Baseline cycle «User 
defined» и для 
расчета: Baseline 
cycles «2» through 
«10 ».
Снижение
чувствительности 
из-за разрушения 
зондов
Неправильное хранение 
или эксплуатация 
реагентов комплекта 
(повышенная 
температура, 
многократное открывание 
пробирок со смесями, 
работа в загрязненных 
условиях) могут приводить 
к разрушению 
олигонуклеотидов
Разрушение зондов 
может быть выявлено
только при сравнении 
данных экспериментов в 
начале и по прошествии 
определенного времени 
использования
Использовать смеси, 
хранившиеся в 
адекватных условиях 
с неистекшим сроком 
годности (см.  
Хранение)
реагентов или при 
сравнении с адекватно 
хранящимися 
реагентами той же 
серии. Выявляется по 
увеличению значения 
фоновой флуоресценции 
(флуоресценция в 
начале эксперимента, 
оценивается в режиме 
Background subtracted) в 
разных экспериментах 
более чем в 3 раза {при  
использовании одного и  
того же прибора и  
одинаково
приготовленных  
растворов для расчета  
факторов лунок).  
ВНИМАНИЕ! эффект
увеличения 
флуоресценции может 
также наблюдаться 
после очистки
оптической системы 
прибора__________
Снижение 
чувствительности 
из-за снижения 
активности TaqF- 
полимеразы
Неправильное хранение 
полимеразы или 
нарушение условий 
стерильности приводит к 
разрушению фермента
Выявляется по 
отсутствию сигнала 
положительного 
контроля или если 
значение порогового 
цикла положительного 
контроля выше порога 
слабых образцов_____
Использовать 
адекватно 
хранящийся (см.  
Хранение)  или новый 
фермент.
стр. 36 из 60


--- стр. 37 ---
Возможные ошибки Признаки Способ устранения
Контаминация специфичной 
ДНК
Появление сигнала по любому 
каналу в отрицательном 
контроле
Повторное проведение 
эксперимента, начиная с 
этапа ПЦР, принятие мер по 
выявлению и устранению 
источника контаминации
При приготовлении смеси 
реагентов не внесена TaqF- 
полимераза
Ни в одном образце, включая 
положительный контроль, не 
регистрируется ни один 
положительный сигнал
Повторное исследование, с 
правильно приготовленными 
смесями начиная с этапа ПЦР
ПРИЛОЖЕНИЕ. РИСУНКИ
I. Необработанные данные (режим Background subtracted).
1
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
?Clt Амр1КкаНм гз Cycle; 06-S«p-0S 8z м  control pMtel KMOO.opd
Рис.1. Исходные кривые (Fam)
2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
>C1I Amplificetion n Cycle: 06*3«p*0S 7^T^£cfeen 8x on control penel 10-Ю0.ор4
_______Рис.2. Исходные кривые (Joe/Hex) ___________
и. Обработанные данные (режим PCR Base Line Subtracted Curve Fit)
a) нормальные кривые после обработки (типичный S-образный вид, линия порога  
пересекает кривые только в области накопления (Ьлуооесиениии). _____________
о 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46
тех АмрМк«е1оп V3 Cyde: 06-Sep-(K r(f%l?een 8i о* control рм>е1 Ю*100.«^
Рис.З. Обработанные кривые (Fam) -  установлен параметр  
«пользовательского» расчета базовой линии (User Defined)
VCK Aii^Mkntion <rs Cyde; 06*3<^ЧК Т^Г^^асеп 8z on coMrolpeoel lO-tOO-opd
Рис.4. Обработанные кривые (Joe/Hex)
'X 7 1ЛО  ДП


--- стр. 38 ---
б) неправильная обработка кривых.
III. Анализ результатов.
Threshold
Cycie
Ct
сэ 1  3 1 .1 1
С 4 26.2
С5 31.4
С б 26.9
С8 31.4
С9 33.2
СЮ 34.0
D3 30.0
D4 25.2
DS 33.6
06 32.0
07 27.9
010 26.8
Е З 33.3
Е 4 28.7
Е 5 30.5
Е Б 26.5
Identifier
Рис.6. Таблица результатов
сто 38 из 60


--- стр. 39 ---
Дата:
АмплиСенс® FRT ВПЧ ВКР Скрин iQ
Описание:
Обозначить парные Порог слабых
неподписанные как пустые образцов. а
Обозначить 1 ВК HPVA9 HPV А7т
25 33 32
Последовательность установки пробирок  в 
_________________прибор_________________
I комбинировано смеси А9 - fi,7+t А9 - А7+.. :в
Данные прибора
№№ Обозначение образца Fam
(ВК)
HEX
(HPV)
Identifier Ct Ct
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Результаты обсчета
№№ Обозначение образц! Результаты
ветвь А9 ■ оть А7.51,51 О б Н П 1<* * * *
* * * *
* * * *
* * * * *
* * * * *
* ♦ * * *
* * * *
* * * * *
* * * * *
* * * * *
* * * * *
* * *
* * * *
* * * *
* * *
* * * * *
* * * * *
Рис.7. Программа «AmpliSens FRT HR HPV Screen iQ Results Matrix.xls»
CTD. 39 из 60


--- стр. 40 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ  
ПРИБОРА «SmartCycler» («Cepheid», США)
3.
Проведение реакции амплификации
1. Включить прибор и запустить программу «SmartCycler».
2. Перед установкой реакционных пробирок в прибор необходимо отцентрифугировать  
их в течение 3 с на прилагающейся к прибору «SmartCycler» центрифуге.
Установить пробирки в прибор.
Варианты установки пробирок.
Для дальнейшей автоматической обработки результатов выберите один из  
следующих способов установки пробирок в прибор:
- Вариант 1: Установите последовательно в 2 соседних (по номеру) модуля пару  
пробирок, соответствующих одному клиническому образцу: сначала со смесью  
ВПЧ FRT А9 затем ВПЧ FRT А7+. Затем пару, соответствующую следующему  
образцу и т.д.
- Вариант 2 (обратный): Установите последовательно в 2 соседних (по номеру)
4.
модуля пару пробирок, соответствующих одному клиническому образцу: сначала  
со смесью ВПЧ FRT А7+ затем ВПЧ FRT А9. Затем пару, соответствующую  
следующему образцу и т.д.
ВНИМАНИЕ! Пары пробирок устанавливаются по горизонтали слева направо.
В основном меню программы выбрать пункт «Define Protocols». В открывшемся в  
нижнем левом углу экрана выбрать кнопку «New Protocol». Дать название протоколу  
и задать следующие параметры эксперимента (см. табл. 9):
Таблица 9
Программа амплификации ДНК ВПЧ ВКР 
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов
Этап Температура, Время Измерение
флуор. Повторов
Stage 1. Hold 95 900 c — 1
Stage 2. Hold 65 120 c — 1
Stage 3.  
3-Temperature  
Cycle
95 20 c —
563 30 c —
65 60 c —
Stage 4.  
3-Temperature  
Cycle
95 25 c —
4260 30 c —
65 60 c Включено
8.
9.
5. В нижней части окна выбрать кнопку «Save Protocol».
6. Нажать кнопку «Create Run» в основном меню программы.
7. В левой центральной части экрана нажать кнопку «Dye set» и выбрать комбинацию 
FTTC25.
В центре экрана нажать кнопку «Add/Remove Sites» и в появившемся окне выбрать  
нужный протокол (программу) и сайты, в которых будет проводиться анализ. Нажать  
кнопку «ОК».
Запустить выполнение программы эксперимента кнопкой «Start Run»B нижней части  
экрана. В появившемся диалоговом окне указать имя файла, в котором будут  
сохранены все данные эксперимента.
10. В открывшемся окне можно посмотреть основные параметры эксперимента.
11. Для присвоения названия образцам нажать кнопку «Results Table». В открывшейся  
таблице в колонке Sample ID дать название образцам. Название можно присваивать  
только одному из образцов данной пары. Согласно инструкции к прибору.  
Контрольным образцам К1, К2, КЗ необходимо обозначить как Standart и задать  
значения калибраторов из вкладыша, отрицательному «-».
сто. 40 из 60


--- стр. 41 ---
12.Интенсивность флюоресценции можно наблюдать в ходе эксперимента: по каналу  
TET/JOE для ДНК ВПЧ и по каналу РАМ для внутреннего контроля.
2.
3.
ОБРАБОТКА И АНАЛИЗ ДАННЫХ 
Обработка данных
1. После проведения амплификации производится расчёт концентрации ДНК ВПЧ по  
двум пробиркам.
Выберите в меню пункт «Analysis settings».
В открывшемся окне задайте уровень пороговой линии равный 10 для каналов РАМ  
и TET/JOE и нажмите кнопку «Update Analysis» в нижней части окна. В таблице  
результатов (окно «Results Table») для каждого образца появятся значения  
пороговых циклов (Ct) и концентрации.
Нажмите кнопку «Export» в нижней левой части окна программы. В появившемся  
диалоговом окне установите галочку только напротив пункта «Results table and  
Analysis Settings».  Нажмите кнопку «Export». Присвойте имя файлу.
Конечный результат нормированной концентрации ДНК ВПЧ по двум пробиркам на  
количество клеток человека рассчитывается по формуле:
A) число копий ДНК ВПЧ по первой пробирке  разделить на число копий ДНК человека  
по первой пробирке, полученный результат умножить на 200000;
Б) число копий ДНК ВПЧ по второй пробирке  разделить на число копий ДНК человека  
по второй пробирке, полученный результат умножить на 200000;
B) результат расчёта по первой пробирке сложить с результатом по второй пробирке;
Г) вычислить десятичный логарифм из полученного значения;
Д) искомый результат является концентрацией ДНК ВПЧ в 1д копий ДНК ВПЧ,  
приходящийся на клеток:
5.
\%{ВПЧ _но_100_ тыс.клеток -
lg(-
колтество  _ ДНК _ ВПЧ _  1
* 200000+-
количество _ ДНК _ ВПЧ _  2 *200000)
количество  _ ДНК _ человека _  1  количество _ ДНК _ человека __  2
6. Сохраните файл Microsoft® Excel под другим именем.
Анализ данных
Вся постановка считается валидной если:
- в отрицательных контролях сигнал отсутствует по всем каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow/НЕХЛ’ЕТ);
- во всех калибраторах выявляются сигналы по всем каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow/НЕХЯЕТ).
- значение коэффициента корреляции калибровочных прямых для всех каналов не  
ниже 0,98.
ВНИМАНИЕ! В случае невалидности постановки все полученные данные  
считаются недостоверными, требуется повтор постановки.
Результат выявления ДНК ВПЧ данного образца считается:
Отрицательным, если в обеих пробирках для данного образца регистрируется сигнал  
внутреннего контроля (ВК) (канал FAM/Green) и при этом количество клеток человека  
на реакцию более 500.
Положительным, если регистрируется сигнал по каналу JOE/Yellow/HEX/TET хотя бы в  
одной из двух пробирок. Результат:
- один или несколько типов из (рилогенетической группы А9 (если сигнал выявлен в  
пробирке со смесью FRT ВПЧ ВКР А9);
-  один или несколько типов из филогенетической группы А7 или 51/56 типы (если  
сигнал выявлен в пробирке со смесью FRT ВПЧ ВКР А7+).
Невалидным,
стр. 41 из 60


--- стр. 42 ---
- если ни одной из 2-х пробирок не регистрируется положительных сигналов по  
каналам (JOE/Yellow/HE)^ET) (А9, А7, А5/А6), а сигнал внутреннего контроля  
(FAM/Green) не регистрируется или количество клеток человека на реакцию не  
превышает 500.
- в образце регистрируется слабоположительный(ые) сигнал(ы) по каналу  
JOE/Yellow/HEX/TET,  однако сигнал внутреннего контроля (FAM/Green)  не  
регистрируется или количество клеток человека не превышает 500.
ВНИМАНИЕ! Невалидный результат требует повторного исследования образца,  
начиная с этапа выделения ДНК или взятие материала.
Возможные ошибки Признаки Способ устранения
Контаминация специфичной 
ДНК
Появление сигнала по любому 
каналу в отрицательном 
контроле
Повторное проведение 
эксперимента, принятие мер 
по выявлению и устранению 
источника контаминации
При приготовлении смеси 
реагентов не внесена TaqF- 
полимераза
Ни в одном образце, включая 
положительный контроль, не 
регистрируется ни один 
положительный сигнал
Повторное исследование с 
правильно приготовленными 
смесями
стр. 42 из 60


--- стр. 43 ---
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ  
ЧЕТЫРЕХКАНАЛЬНОГО ПРИБОРА «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research»,  
Австралия)
Далее по тексту термины, соответствующие разным версиям приборов и  
программного обеспечения указаны в следующем порядке: для прибора «Rotor-  
Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для  
русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.
Проведение реакции амплификации
1. Включите прибор, запустите программу RotorGene.
2. Установите пробирки в карусель прибора так, чтобы первая пробирка попала в лунку  
1; установите карусель в прибор, закройте крышку.
ВНИМАНИЕ! Если вы не полностью заполняете карусель прибора, то ее следует  
уравновесить. Для этого заполните незанятые места пустыми пробирками (не  
используйте пробирки от предыдущих экспериментов).  Лунка 1 обязательно 
должна быть заполнена какой-либо исследуемой пробиркой (не пустой).
3. Запустите программу амплификации. Для этого используйте один из следующих  
способов:
Использование шаблонного Файла для запуска программы амплификации.  
ВНИМАНИЕ! Для проведения амплификации настоятельно рекомендуется  
использование прилагаемого к набору реагентов шаблонного файла  
«AmpliSens FRT HR HPV Screen RG4x.ret».
Для использования шаблона для данного набора реагентов необходимо  
предварительно скопировать прилагающийся к набору реагентов файл «AmpliSens  
FRT HR HPV Screen RG4x.ret»  в папку «Templates» папки программы «Rotor-Gene».  
При установке «Rotor-Gene» по умолчанию путь к указанной папке следующий:  
«C:\Program Files\RotorGene 6\Templates»  - RotorGene 3000 и «C:\Program Files\Rotor-  
Gene 6000 Software\Templates» - RotorGene 6000.  После выполнения этой процедуры  
в окне «New Пип»/«Новый тест» (вызывается кнопкой «New»/«HoBbm» панели  
инструментов) появится пункт «AmpliSens FRT HR HPV Screen RG4x».  Его и следует  
выбирать для запуска нового эксперимента.
Примечание: шаблонный файл можно открыть из другой папки. Для этого в окне  
«New Рип»/«Новый тест» выберите вкладку «Advanced»/«Дemaльный мастер» и в  
ней пункт «Open А Template In Another Folder...»/«Открыть шаблон из другой  
папки...», далее перейдите в папку, содержащую файл «AmpliSens FRT HR HPV  
Screen RG4x.ret» и откройте его.
В шаблонном файле уже заданы все необходимые параметры амплификации,  
поэтому необходимо только внести данные об эксперименте и расшифровку  
образцов.
Самостоятельное программирование
-  Запустите мастер нового эксперимента в режиме «Абуапсес1»/«Детальный  
мастер».
- в окне, следующем после окна выбора ротора, необходимо установить объем  
реакционной смеси Reaction volume/Объем реакции (pL)  равный 25. Для прибора «Rotor­
Gene» 6000 так же необходимо установить галочку напротив параметра 15 pL oil layer  
volume/15 pL объем масла/воска.
-  задайте программу амплификации (см. табл. 10).
ПРИЛОЖЕНИЕ 4
стр. 43 из 60


--- стр. 44 ---
Таблица 10
Программа амплификации ДНК ВПЧ ВКР  
16, 18. 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов
Этап Температура, °С Время Измерение
ФЛуор. Повторов
Hold/Удерж, темп-ры 95 15 мин — 1
Но1д2/Удерж. темп-ры2 65 2 мин — 1
Cycling
95 20 с —
5
64
Touchdown:
1 deg. per cycle /  
Снижать темп-ру 
шага
на 1 град, каждый 
цикл
25 с -
65 55 с —
СусИпд2/Циклирование2
95 15с —
40
60 25 с -
65 25 с
FAM/Green,
JOE/Yellow,
ROX/Orange,
Cy5/Red
Примечание. Для задания программы амплификации можно воспользоваться  
прилагаемым к набору файлом в формате ПО «RotorGene» (AmpliSens FRT HR HPV  
Screen RG4x Program.pro).
ВНИМАНИЕ! Можно также использовать универсальную программу амплификации и  
детекции «АмплиСенс-1 RG» (см. табл. 11). С использованием этой программы можно  
одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов по единой  
программе (например, совместно с тестами для выявления ДНК возбудителей ИППП).  
Аналитические характеристики данного набора реагентов при использовании  
универсальной программы амплификации не изменяются.
Таблица 11
Программа амплификаи ИИ «АмплиСенс-1 RG»
Этап Температура, °С Время Измерение
флуор. Повторов
Hold/Удерж.темп-ры 95 15 мин — 1
Cycling/ Циклирование
95 5с —
560 20 с -
72 15с -
СусНпд2/Циклирование2
95 5с -
4060 20 с
FAM/Green,
JOE/Yellow,
ROX/Orange,
Cy5/Red
72 15с -
Примечание. Каналы ROX/Orange и Суб/Red включаются при необходимости, если  
проводятся тесты в формате «мультиплекс», для которых используются эти  
каналы.
-  задайте параметры калибровки «Calibrate»/«Gain Optimisation»/«OnT.ypoBHn сигн.»  
в «Advaпced»/«Дeтaльный мастер» - мастере нового эксперимента):  
а) осуществлять калибровку по каналам FAM/Green, JOEA'ellow, ROX/Orange,  
Cy5/Red (нажать кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Асди1ппд»/«Опт.детек-  
мых»;
стр. 44 из 60


--- стр. 45 ---
б) калибровать перед первым измерением («Perform Calibration Before 1® *
Acquisition»/«Perform Optimisation Before Acquisition»/«BbinonHHTb
оптимизацию при 1-м шаге детекции»);
в) установка калибровки канала для всех красителей от 4FI до 8FI (кнопка «Edit...»/  
«Правка...», окно «Auto gain calibration channel зеШпд8»/«Авто-оптимизация  
уровня сигнала»).
4. Запустите амплификацию, выбрав кнопку «Start гип»/«Старт» и присвоив имя файлу  
эксперимента.
5. Внесите данные в таблицу образцов (открывается автоматически после запуска  
амплификации). В колонке «Name» укажите названия/номера исследуемых  
клинических образцов. Напротив всех исследуемых образцов, включая контрольные,  
установите тип «ипкпо\л/п»/«Образец». Для ячеек, соответствующих пустым  
пробиркам установите тип «Мопе»/«Пусто». Калибраторы назовите «К1», «К2», «КЗ»,  
отрицательный контроль -  «К-».
ВНИМАНИЕ! При установке типа «Нопе»/«Пусто» данные образца  
анализироваться не будут!
ОБРАБОТКА И АНАЛИЗ ДАННЫХ 
Оценка данных
Просмотрите необработанные данные прибора по всем четырем каналам (FAM/Green,  
JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red) выбирая кнопки «Cycling А...» на панели  
«СЬаппе1з»/«Каналы». Обратите внимание на следующие моменты:
-  среди всех сигналов образцов по каналу должен быть хотя бы один положительный  
(положительный сигнал имеет характерную S-образную кривую накопления  
флуоресценции {см. рис. 1). При правильной постановке и течении эксперимента  
обязательно должны присутствовать сигналы калибраторов К1, К2, КЗ).
ВНИМАНИЕ! При полном отсутствии положительных сигналов по  
флуоресцентному каналу обработка данных канала может дать некорректный  
результат.
- наличие образцов с фоновым сигналом, резко отличающимся от большинства  
свидетельствует об ошибке при внесении в пробирку реакционной смеси или  
образца ДНК (см. рис. 26 и раздел «Возможные проблемы и ошибки).
Обработка данных
1. Удостоверьтесь, что все анализируемые образцы активны в легенде справа.
2. Запустите функцию «Апа1у8!з»/«Анализ», выберите вкладку  
«Q uantitation»/«KoHH4ecTBeHHbM » и в ней канал F A M /G re e n , затем кнопку  
«S h o w »/«n o K a3aT b ».
3. После открытия окна «Quantitation analysis»/«Konn4ecTBeHHbM анализ» вручную  
установите пороговый цикл: Threshold/Порог = 0,03.
4. Выберите линейный тип шкалы («Linear 8са1е»/«Линейная шкала»), активируйте  
параметры «Dynamic ШЬе»/«Динамич.фон», «Slope СоггесЬ>/«Коррект.уклона».
5. Выберите параметр « M o re  se ttin g s »/« O u tlier R e m o v a l» /« y c T p a H e H n e  выбросов» и  
установите значение порога отрицательных проб (NTC threshold /Порог Фона - ПФ)  
равным 20 %.
ВНИМАНИЕ! Достаточно редко из-за низходящего характера кривых в начале  
эксперимента возможно явление пересечения линии порога (Threshold/Порог) и  
кривых флуоресценции на первых циклах, при этом программа RotorGene может  
засчитывать данные пересечения за положительный сигнал (рис. 7).  Для  
устранения эффекта воспользуйтесь функцией «Eliminate cycles  
before...»/«Исключить циклы до...», задав значение 5, проигнорировав тем самым  
пересечение порога и кривой флуоресценции на первых пяти циклах.
6. В таблице результатов (« Q u a n t. R esults»/«K onn4ecTB eH H bie результаты»): выделите  
колонку «Мате»/«Имя» однократно щелкнув мышью на заголовке. Скопируйте  
колонку, выбрав «Сору»/«Копировать» из контекстного меню (вызывается правой  
кнопкой мыши) {рис. 9).
стр. 45 из 60


--- стр. 46 ---
7. Откройте прилагающийся к набору реагентов файл Microsoft® Excel «AmpliSens FRT  
HR HPV SCREEN Quant Results Matrix.xls», согласитесь на включение макроса.  
Примечание: если при открытии документа Excel не активируется макрос (выдается  
соответствующее сообщение, кнопка «Результаты» неактивна) необходимо изменить  
уровень безопасности Microsoft® Excel. Для этого выберите в меню пункт  
«Сервис»>«Макрос»>«Безопасность...» и установите средний уровень безопасности.  
Чтобы экспортировать (копировать) таблицу результатов анализа в Excel без  
искажения русского шрифта, необходимо переключить свою клавиатуру на русский  
шрифт перед тем как нажать в меню «Экспорт в Excel» или «Копировать».
8. Установите курсор на ячейку «Name» столбца «Обозначение» и выберите  
«Вставить» из контекстного меню {рис. 10).
9. Аналогично выберите и скопируйте колонку «Ct» из таблицы результатов  
(«Quant.Results»/«Koличecтвeнныe результаты»). Установите курсор в таблице Excel  
в ячейку «Ct» под названием соответствующего флуоресцентного красителя.
10. Повторите процедуру для других флуоресцентных красителей.
11. Установите режим «Количественный анализ», внутренняя калибровка.
12. Внесите данные концентраций калибраторов в таблицу «Знач. калибр.»  в  
соответствие с вкладышем к данной серии набора реагентов.
13. В столбце «Обозначение» проверьте, что калибратор К1 имеет имя «К1»,  
калибратор К2 имеет имя «К2», калибратор КЗ имеет имя «КЗ» (без пробела между  
буквой К и цифрой), отрицательный контроль -  «К-» или «-».
14. Сохраните файл Microsoft® Excel под другим именем.
Анализ данных
Анализ данных осуществляется автоматически. После внесения всех данных в матрицу  
данных Excel, нажмите кнопку результаты. В колонке «результаты» появятся  
выявленные в образцах филогенетические группы ВПЧ, результат: положительный  
(pos), отрицательный (пед),  слабоположительный (weak),  невалидный (NA/).  Далее в  
таблице отображается количество клеток человека на реакцию, используется для  
оценки валидности образца. Далее приводятся расчеты концентрации ДНК ВПЧ,  
выраженной в 1д на 10® клеток по группам и суммарная вирусная нагрузка. В последнем  
столбце приводится возможная трактовка клинической значимости результата в
Результат 1д (копий ДНК ВПЧ на 
100 тыс клеток) Трактовка
<3 Клинически малозначимая
3-5 Клинически значимая. Нельзя исключить 
дисплазию, существует риск развития дисплазии
>5 Клинически значимая, повышенная. Высокая 
вероятность наличия дисплазии
ВОЗМОЖНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ОШИБКИ
Возможные
проблемы Причина Как выявить? Способы устранения
Отрицательные
образцы
анализируются
программой
RotorGene  как
положительные.
Неправильная
математическая
обработка
отрицательных образцов 
при наличии участка 
падения флуоресценции 
на начальных циклах 
(рис. 2а, 8)
Типичный положительный 
образец имеет 
характерную S-образную 
кривую накопления 
флуоресценции (рис. 1,3-  
6). Некорректно 
обработанные 
отрицательные образцы 
имеют вид довольно 
прямых линий, идущих 
снизу вверх (рис. 8)
Необходимо 
воспользоваться 
функцией «Ignore  
ПгзЬ>/«Игнор. первые»  
выбрав значение 5 
циклов. Если это не 
приводит к должному 
результату, 
попробуйте увеличить 
это значение на 1 - 5.
Пересечение линией 
порога нисходящих 
кривых флуоресценции
На графике обработанных 
кривых флуоресценции 
красная линия порога
воспользуйтесь 
функцией «Eliminate  
cycles before...»/
стр. 46 из 60


--- стр. 47 ---
Возможные
проблемы Причина Как выявить? Способы устранения
на начальных циклах 
(рис.7)
(Threshold) пересекает или 
«задевает» кривые 
флуоресценции в левой 
части графика (первые 
циклы) (рис. 7)
«Исключить циклы  
до...»,  задав значение 
5, (игнорируется 
пересечение порога и 
кривой флуоресценции 
на первых 5 циклах)
Снижение 
чувствительност 
и из-за 
загрязнения 
линз прибора
Загрязнение линз ведет 
к снижению 
эффективности 
возбуждения и 
регистрации 
флуоресценции, что в 
первую очередь 
сказывается на образцах 
с малым количеством 
специфичной ДНК, 
дающих малое 
увеличение
флуоресценции________
Низкие значения 
фонового сигнала по всем 
4 каналам измерения 
флуоресценции(<1)при 
максимальном значении 
умножителя «gain» (10).
Проводить очистку 
горизонтальной и 
вертикальной линз 
прибора сухим 
одноразовым ватным 
тампоном не реже 1 
раза в месяц
Снижение 
чувствительност 
и из-за 
разрушения 
зондов
Неправильное хранение 
или эксплуатация 
реагентов комплекта 
(повышенная 
температура, 
многократное 
открывание пробирок со 
смесями, работа в 
загрязненных условиях) 
могут приводить к 
разрушению 
олигонуклеотидов
Разрушение зондов может 
быть выявлено только при 
сравнении данных 
экспериментов в начале и 
по прошествии 
определенного времени 
использования реагентов 
или при сравнении с 
адекватно хранящимися 
реагентами той же серии. 
Выявляется по снижению 
значения автоматически 
выбираемого
коэффициента умножения 
gain в разных 
экспериментах более чем 
на 2 единицы {при 
использовании одного и  
того же прибора).  
ВНИМАНИЕ! эффект 
увеличения умножителя 
gain может также 
наблюдаться после 
очистки линз прибора от 
сильного загрязнения
Использовать смеси, 
хранившиеся в 
адекватных условиях с 
неистекшим сроком 
годности (см. 
Хранение)
Снижение 
чувствительност 
и из-за снижения 
активности 
TaqF-
полимеразы
Неправильное хранение 
полимеразы или 
нарушение условий 
стерильности приводит к 
разрушению фермента
Выявляется по 
отсутствию сигнала 
положительного контроля 
или если значение 
порогового цикла 
положительного контроля 
выше порога слабых 
образцов______________
Использовать 
адекватно хранящийся 
(см. Хранение)  или 
новый фермент.
Примечание: Информацию по всем установленным параметрам эксперимента, а так же  
отчет по автокалибровке можно найти, просмотрев установки эксперимента (кнопка  
«8еШпдз»/«Установки»). В частности, вкладка «Меззадез»/«Сообщения» пункт  
«Autocalibration Log Messages»  - отчет об автокалибровке - отчет об автокалибровке.
Г.ТП 47 мя RD


--- стр. 48 ---
Возможные ошибки Признаки Способ устранения
Контаминация специфичной 
ДНК
Появление сигнала по 
любому каналу в 
отрицательном контроле
Повторное проведение 
эксперимента, принятие мер по 
выявлению и устранению 
источника контаминации
В пробирку не 
внесено/внесено меньше 
образца ДНК
Фоновый сигнал образца 
сильно превосходит другие 
(видно на необработанных 
кривых) (рис. 26).  Образец 
отрицательный.
Повторное исследование образца, 
начиная с этапа ПЦР
В пробирку не 
внесено/внесено меньше 
реакционной смеси или 
внесено больше образца ДНК
Фоновый сигнал образца 
сильно ниже других (видно 
на необработанных кривых) 
(рис. 26).
Если образец отрицательный, 
требуется повторное 
исследование
Не задан параметр 
автокалибровки от 4FI до 8FI 
или ошибка в первой пробирке 
барабана (ее отсутствие, 
неправильное внесение 
образца ДНК или реакционной 
смеси)
Большинство фоновых 
сигналов флуоресценции 
меньше 1 или больше 20
Задать параметр при следующем 
запуске. Если произошел 
«зашкал» или сигналы очень 
слабые (при обработке нет 
положительных сигналов, фон 
меньше 0,5) необходим повтор 
исследования начиная с этапа 
ПЦР
При приготовлении смеси 
реагентов не внесена TaqF- 
полимераза
Ни в одном образце, включая 
положительный контроль, не 
регистрируется ни один 
положительный сигнал
Повторное исследование, с 
правильно приготовленными 
смесями начиная с этапа ПЦР
ПРИЛОЖЕНИЕ. РИСУНКИ 
I. Необработанные данные.
сто. 48 из 60


--- стр. 49 ---
II. Обработанные данные.
а) нормальные кривые после обработки (типичный S-образный вид, линия порога
Ч т
0.1S
0.1_
о д а
0
Fkjcro. Ч е г т
0,3
0,1
0
Fluoro.
Ш м Ь о И
to to '1 0 *15 '20 'д а  "ЭО '35 ‘4Сус1в
^ис.З. Канал Fam -  внутренний контроль (Ь-глобиновый ген)
to  to  Н о  * 1 5  '2 0 'д а  '3 0  '3 5  'дсул
Рис.4. Канал Су5
Ч о л п
о д а
0 ^.
0.15
0 ,1
од а
0
Fkjoro. Чопп
0,25
0,2
0,15
0,1
од а
0
L
Fluoro.
U r M h o U T T m h a U
to  to  Н о  'is '2 0 *25 'ЭО '35 '4С у«в
Рис.5. Канал Joe
" 'о  ? Т о  Т б  S 5б S S Т сул
Рис.6. Канал Rox
стр. 49 из 60


--- стр. 50 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ 5
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ  
ПРИБОРА «105» («BioRad», США)
Проведение реакции амплификации
• Включите прибор, запустите программу iQ5
ВНИМАНИЕ! Лампа должна быть прогрета до запуска эксперимента не менее 15 мин.
Этап Температура, °С Время Измерение
флуор. Повторов
Cycle 1 95 15 мин — 1
Cycle 2
95 1 5 c —
6
65
Touchdown:
1 deq. per cycle
55 c -
65 25 c —
Cycle 3
95 1 5 c —
4160 55 c Real-tim e
65 25 c -
Для задания программы можно воспользоваться прилагающимся к набору реагентов  
файлом «AmpliSens FRTHR HPV Screen iQ5.tmo».
ВНИМАНИЕ! Можно также использовать универсальную программу амплификации и 
детекции «АмплиСенс-1 iO». С использованием этой программы можно одновременно  
проводить в одном приборе любое сочетание тестов по единой программе (например,  
совместно с тестами для выявления ДНК возбудителей ИППП).
Аналитические характеристики данного набора реагентов при использовании  
универсальной программы амплификации не изменяются.
Этап Температура Время Измерение
флуор. Повторов
1 95 “С 15 мин - 1
2
95 “С 5 с —
560 “С 20 с —
72 °С 15 с —
3
95 “С 5 с -
4060 “С 30 с РАМ, HEX, ROX,  
Су5
72 “С 1 5 с
Примечание. Каналы ROX и Суб включаются при необходимости, если проводятся  
тесты в формате «мультиплекс», для которых используются эти каналы.
• Создайте новую плашку образцов («Plate Setup»). Обозначьте образцы. Задайте  
измерение флуоресценции по четырем каналам: РАМ, HEX, ROX, Суб.
• Нажмите кнопку Run. Выберите режим измерения факторов лунок (Well factor).  
Допускается использование как режима с измерением факторов лунок по  
экспериментальным пробиркам, так и фиксированных факторов лунок (рекомендуется). 
Запустите эксперимент.
ОБРАБОТКА И АНАЛИЗ ДАННЫХ 
Обработка данных
1. Перейдите в режим «Data Analysis».
2. Просматривайте данные отдельно по каждому из четырех каналов.
3. Для каждого канала проверьте правильность автоматического выбора пороговой линии. 
В норме пороговая линия должна пересекать только сигмообразные кривые накопления
стр. 50 из 60


--- стр. 51 ---
сигнала положительных образцов и контролей и не пересекать базовую линию. В  
случае если это не так, повысьте уровень порога.
4. Активируйте кнопку «Results» (расположена под кнопками с названиями флуорофоров).
5. Щелкните правой кнопкой мыши на появившейся таблице с результатами. В  
выпадающем меню выберите «Export to Excel». Согласитесь на сохранение файла. В  
случае если на компьютере установлена программа Microsoft Excel, данный файл  
откроется автоматически. (Если данная программа не установлена, дальнейшая  
обработка осуществляется на компьютере с Excel). Структура данного файла такова,  
что сначала последовательно следуют все результаты по каналу Earn, затем Hex, Rox и 
Суб.
6. Откройте прилагающийся к набору файл Microsoft® Excel «AmpliSens HR HPV SCREEN  
Quant 96 Results Matrix.xls» {программа расчета результатов),  согласитесь на  
включение макроса.
Примечание: если при открытии документа Excel не активируется макрос (выдается  
соответствующее сообщение, кнопка «Результаты» неактивна) необходимо  
изменить уровень безопасности Microsoff' Excel. Для этого выберите в меню пункт  
«Сервис»>«Макрос»>«Безопасность...» и установите средний уровень безопасности.
7. В файле с результатами выделите и скопируйте ячейки столбца «Threshold Cycle (Ct)»,  
соответствующие каналу Fam. Перейдите к программе расчета результатов и вставьте  
скопированные ячейки в столбец Fam, начиная с первой ячейки.
8. Аналогично скопируйте ячейки столбца «Threshold Cycle (Ct)», соответствующие каналу  
Hex, затем Rox и Суб в столбцы Hex, Rox и Суб программы расчета результатов.
9. Скопируйте имена образцов из столбца «Identifier» (если они обозначались) в столбец  
«Имя» программы расчета.
10. В колонке «Имя» программы расчета результатов обозначьте образцы,  
соответствующие калибраторам строго как К1, К2 и КЗ, отрицательные контроли как «-» 
или «К-». Ячейки, не соответствующие экспериментальным пробиркам, -  знаком #.
11 .Сохраните файл Microsoft® Excel под другим именем.
12. Нажмите кнопку «Результаты».
Анализ данных
Анализ данных осуществляется автоматически. После внесения всех данных в матрицу  
данных Excel, нажмите кнопку результаты. В колонке «результаты» появятся  
выявленные в образцах филогенетические группы ВПЧ, результат: положительный  
{роз),  отрицательный (лед), слабоположительный {weak),  невалидный {N/V).  Далее в  
таблице отображается количество клеток человека на реакцию, используется для  
оценки валидности образца. Далее приводятся расчеты концентрации ДНК ВПЧ,  
выраженной в 1д на 10® клеток по группам и суммарная вирусная нагрузка. В последнем  
столбце приводится возможная трактовка клинической значимости результата в  
соответствие со следующим:
Результат 1д  (копий ДНК ВПЧ на 
100 тыс клеток) Трактовка
<3 Клинически малозначимая
3-5 Клинически значимая. Нельзя исключить 
дисплазию, существует риск развития дисплазии
>5 Клинически значимая, повышенная. Высокая 
вероятность наличия дисплазии
стр. 51 из 60


--- стр. 54 ---
II. Обработанные данные
нормальные кривые после обработки, типичный S-образный вид, правильное  
расположение порогов (Режим отображения PCR Base Line Subtracted Curve Fit)
CTD. 54 из 60


--- стр. 55 ---
ПРИЛОЖЕНИЕ 6
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛЯ  
ПРИБОРА «МхЗОООР» («Stratagene», США)
Проведение реакции амплификации
1. Включите прибор, запустите программу Stratagene МхЗОООР.
2. В окне «New Experiment Options»  выберите пункт «Quantitative PCR (Multiple  
Standarts)»  и установите флажок «Turn lamp on for warm-up».
ВНИМАНИЕ! Лампа должна быть прогрета до запуска эксперимента не менее 15  
мин.
3. Установите пробирки в прибор, закройте крышку.
4. В меню «Options» выбрать пункт «Optics Configuration» и на вкладке «Dye  
Assignment» напротив пункта «HEX/JOE filter set» установить параметр JOE,  
напротив пункта «РАМ filter set» установить параметр РАМ.
5. В меню «Instrument» программы МхЗОООР выбрать пункт «Pilter Set Gain Settings...».
Су5 х4
ROX х1
HEX/JOE х4
РАМ х4
6. На вкладке «Plate Setup» задайте параметры съема флуоресценции с пробирок. Для  
этого:
-  выберите все ячейки, в которых установлены исследуемые пробирки (удерживая  
клавишу Ctrl и выделяя необходимый диапазон мышью);
-  в выпадающем меню «Well type» выберите тип «Unknown» и поле «Collect  
fluorescence data» установите все четыре флажка «РАМ», «НЕХ», «ROX», «Суб»;
-  далее дважды щелкая по каждой ячейке внесите подписи пробирок (Окно «Well  
Information»), положительный контроль обозначьте как «+», отрицательный как «-»  
(внести подписи образцов так же можно во время амплификации или после её  
окончания, вернувшись на эту вкладку).
7. Перейдите на вкладку «Thermal Profile Setup», задайте программу амплификации.
Для этого используйте один из следующих способов:
Использование шаблонного Файла для задания программы амплификации 
(рекомендуется).
Нажмите кнопку «Import...»  справа от изображения профиля термоциклирования.  
Перейдите в папку, содержащую прилагаемый к набору файл «AmpliSens FRT HR  
HPV Screen Мх.тхр»  и откройте его. В окне «Thermal Profile» появиться необходимый  
профиль термоциклирования
Самостоятельное программирование
Программа амплификации ДНК ВПЧ ВКР
16, 18, 31, 33, 35, 3SI, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов:
Этап Температура, °C Время Измерение флуор. Повторов
Segment 1 95 15 мин - 1
Segment 2 65 2 мин - 1
Segment 3  
(Cycling)
95 20 с —
5
64
Touchdown:
1 deg. per cycle
25 с -
65 55 с —
Segment 4  
(Cycling)
95 20 с -
4060 25 с —
65 55 с по Су5, РАМ, JOE, ROX
стр. 55 из 60


--- стр. 56 ---
ВНИМАНИЕ! Можно также использовать универсальную программу амплификации и 
детекции «АмплиСенс-1 Мх». С использованием этой программы можно одновременно  
проводить в одном приборе любое сочетание тестов по единой программе (например,  
совместно с тестами для выявления ДНК возбудителей ИППП).
Аналитические характеристики данного набора реагентов при использовании  
универсальной программы амплификации не изменяются.
Программа амплис)икации «АмплиСенс-1 Мх»
Этап Температура, "С Время Измерение
флуор. Повторов
Segment 1 95 15 мин - 1
Segment 2  
(Cycling)
95 5с -
560 20 с -
72 15 с —
Segment 3  
(Cycling)
95 5с —
4060 30 с FAM, JOE, ROX, 
Су5
72 15с -
Примечание. Каналы ROX и Су5 включаются при необходимости, если проводятся  
тесты в формате «мультиплекс», для которых используются эти каналы.
8. Запустите амплификацию, выбрав кнопку «Run», затем «Start»n присвоив имя файлу  
эксперимента.
ОБРАБОТКА И АНАЛИЗ ДАННЫХ
Обработка данных
1. В программе МхЗОООР  перейдите в раздел «Analysis» выбрав соответствующую  
кнопку на панели инструментов.
2. На открывшейся вкладке «Analysis Selection/Setup» убедитесь, что все исследуемые  
образцы активны (ячейки соответствующие образцам должны иметь другой оттенок).  
В противном случае выберите все исследуемые образцы, удерживая клавишу Ctrl и  
выделяя необходимый диапазон мышью.
3. Перейдите на вкладку «Results».
4. В нижней панели «Dyes shown» активируйте отображение флуоресцентного канала  
Суб и отключите отображение других каналов. В поле «Threshold fluorescence»  
установите значение порога для Суб равным 160. Далее последовательно  
включайте отображение следующего флуоресцентного канала, отключая
Суб 150
ROX 150
HEX/JOE 150
FAM 150
б. Далее активируйте отображение всех четырех флуоресцентных каналов (кнопки  
«Суб» «ROX» «НЕХ» «РАМ» нажаты в поле «Dyes Shown» внизу окна программы).
6. В поле «Threshold fluorescence» убедитесь, что галочки стоят напротив всех четырех  
флуоресцентных каналов.
7. В поле «Area to analyze» выберите пункт «Text Report». Визуально удостоверьтесь,  
что все данные сортированы по имени красителя (колонка «Dye»). Для этого  
однократно нажмите на имя колонки «Dye» (рис. 9).
8. Перейдите в меню «File», далее к пункту «Export Text Report» и далее к пункту  
«Export Text Report to Excel». Откроется окно Microsoft Excel.
9. Откройте прилагающийся к набору реагентов файл Microsoft® Excel «AmpliSens FRT  
HR HPV SCREEN Quant 96 Results Matrix.xls» (программа автоматической  
интерпретации результатов), согласитесь на включение макроса.
Примечание: если при открытии документа Excel макрос не активируется (выдается  
соответствующее сообщение, кнопка «Результаты» неактивна) необходимо изменить
стр. 56 из 60


--- стр. 57 ---
уровень безопасности Microsoff Excel. Для этого выберите в меню пункт  
«Сервис»><(Макрос»>«Безопасность...» и установите средний уровень безопасности.
10. Скопируйте из открывшегося окна «Text Report» имена образцов в колонку  
«Обозначение» программы автоматического учета результатов.
11. Скопируйте из открывшегося окна «Text Report» имена образцов в колонку  
«Обозначение» программы автоматического учета результатов. В случае, если  
исследовалось более 36 образцов, сначала проанализируйте данные первых 36,  
затем откройте новую копию программы и проанализируйте оставшиеся образцы.
12. Далее скопируйте значения пороговых циклов для всех четырех каналов в  
соответствующие ячейки программы автоматического учета результатов.
13. Установите режим «Количественный анализ», внутренняя калибровка.
14. Внесите данные концентраций калибраторов в таблицу «Знач. калибр.»  в  
соответствие с вкладышем к данной серии набора реагентов.
15. В столбце «Обозначение» проверьте, что калибратор К1 имеет имя «К1»,  
калибратор К2 имеет имя «К2», калибратор КЗ имеет имя «КЗ» (без пробела между  
буквой К и цифрой).
16. Сохраните файл Microsoft® Excel под другим именем.
17. Нажмите кнопку «Результаты».
Анализ данных
Анализ данных осуществляется автоматически. После внесения всех данных в матрицу  
данных Excel, нажмите кнопку результаты. В колонке «результаты» появятся  
выявленные в образцах филогенетические группы ВПЧ, результат: положительный  
(pos), отрицательный (пед),  слабоположительный {weak),  невалидный (Л/Л/). Далее в  
таблице отображается количество клеток человека на реакцию, используется для  
оценки валидности образца. Далее приводятся расчеты концентрации ДНК ВПЧ,  
выраженной в 1д на 10^ клеток по группам и суммарная вирусная нагрузка. В последнем  
столбце приводится возможная трактовка клинической значимости результата в  
соответствие со следующим:
Результат 1д  (копий ДНК ВПЧ на 
100 тыс клеток) Трактовка
<3 Клинически малозначимая
3-5 Клинически значимая. Нельзя исключить 
дисплазию, существует риск развития дисплазии
>5 Клинически значимая, повышенная. Высокая 
вероятность наличия дисплазии
ВОЗМОЖНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ОШИБКИ
Перед использованием набора реагентов рекомендуется изучить этот раздел.
Возможные
проблемы Причина Как выявить? Способы
устранения
Снижение 
чувствительности 
из-за разрушения 
зондов
Неправильное хранение 
или эксплуатация 
реагентов комплекта 
(повышенная 
температура, 
многократное открывание 
пробирок со смесями, 
работа в загрязненных 
условиях) могут приводить 
к разрушению 
олигонуклеотидов
Разрушение зондов 
может быть выявлено 
только при сравнении 
данных экспериментов в 
начале и по прошествии 
определенного времени 
использования 
реагентов или при 
сравнении с адекватно 
хранящимися 
реагентами той же 
серии. Выявляется по 
увеличению значения 
фоновой флуоресценции 
(флуоресценция в 
начале эксперимента, 
оценивается в режиме
Использовать смеси, 
хранившиеся в 
адекватных условиях 
с неистекшим сроком 
годности (см. 
Хранение)
стр. 57 из 60