Наборы реагентов in vitro для проточной цитометрии — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 17 --- И нструкция MIGRATEST“ версия 09/08 С траница 4 из 9 G L Y C Р Е Biotechnology П Р О Ц Е Д У Р А 1. П риготовления: 1.1 Разбавьте исходные растворы с реагентом В; - реагентом С, в пропорции 1 : 200 (объем по мере необходимости, например, 5 мкл в 1 мл, 350 мкл на тест). - реагентом Е, в пропорции 1 : 50 (например, 5 мкл в 250 мкл, 20 мкл на тест). 1.2 Прогрейте водяную баню до температуры 37°С (необходим то ч н ы й контро л ь тем пературы !). 1.3 Подготовьте емкость со льдом. 1.4 Вкпючите и откалибруйте проточный цитометр. 2. Изоляция л е й ко ц и то в : Соберите для исследования 5 мл гепаринизированной цельной крови у каждого пациента и у контрольного испытуемого. При заборе крови соблюдайте обычные правила асептики. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ кр ов ь, в ко тор ую в качестве антикоагулянта добавлена EDTA или лим онная кислота! 2.1 Аккуратно наслоите 1 мл гепаринизированной цельной крови поверх реагента А. 2.2 Оставьте флакон неподвижным при комнатной температуре. Через 40 мин образуются следующие фазы: верхняя фаза, содержащая лейкоциты и тромбоциты (богатую лейкоцитам и плазму = БЛП), и нижняя фаза, содержащая эритроциты. При использовании более старых образцов крови оседание эритроцитов занимает больше времени. 2.3 Заберите прибл. 500 мкл богатой лейкоцитами плазмы (верхняя фаза), пипеттируйте клеточную взвесь в одну 1 мл или 2 мл тестовую пробирку. Для анализа хемотаксис изолированные клетки необходимо использовать в течение 1 часа. 3. Настройка MIGRATEST"“ : 3.1 Подготовьте следующие образцы для каждого пациента или контрольного испытуемого, пипеттируя рабочий раствор реагента В или реагента С на дно лунок многолуночного планшета: О трицательны й ко нтрол ьны й образец: 350 мкл реагента В П ол ож ительны й ко нтрольны й (тестируем ы й) образец: 350 м кл рабочего раствора реагента С 3.2 Поместите мембраны для клеточных культур в обе лунки. Добавьте 100 мкп богатой лейкоцитам и плазмы на каждую мембрану для клеточных культур. 3.3 Инкубация: Многолуночный планшет инкубируется в течение 30 м инут при температуре 37,0°С в водяной бане без встряхивания. 3.4 Точно в конце инкубационного периода удалите вручную вкпючения культуры клеток из многолуночного планшета. Добавьте клеточную взвесь из обеих лунок многолуночного планшета в две отдельные 5 мл пробирки (пробирка 1 и пробирка 2) и положите пробирки на лед. Кроме того, нестимулированные клетки богатой лейкоцитами плазмы служат контролем L -селектина. Для этого смешайте 20 мкл клеточной взвеси с м ем браны для клеточны х культур отрицательного контрольного образца со 180 мкл реагента В и переместите эту смесь в третью 5 мл проб ирку (про б и р ку 3). 3.5 1\/1аркировка реагентом D: Добавьте 20 мкл реагента D в каждую проб ирку (3 проб ирки на одного пациента). Перемешайте вихревым смесителем и инкубируйте пробирки в течение 10 м инут в ем кости со льдом , закры то й для предотвращ ения попадания света. 3.6 Прижизненное окрашивание: Добавьте 20 мкл 1-кратного реагента Е в пробирку, перемешайте и инкубируйте в течение 5 мин на л ь д у (в защищенной от света емкости со льдом). П роведите измерения в клеточной взвеси в течение последую щ их 120 минут. 4. А нализ ПРОТОЧНОЙ цитом етрии: Клетки анализируются с помощью проточной цитометрии с использованием сине-зеленого света (488 нм аргоновый лазер, например, FACSCalibur™, ПО CellQuest™). Измерения: Получите данные путем установления порога ф луоресценции в канале FL3, установите пе рвую область 1 на лейкоциты --- стр. 18 --- И нструкция MIGRATEST“ версия 09/08 С траница 5 из 9 I G L Y C Т Ф Р Е I Biotechnology Ф и гранулы подсчета (дот плот диаграмма SSC/FL3, см. рис. 1А, 1В). После активации гейта на области 1 установите вто рую область 2 во кр уг гранул подсчета (дот плот диаграммы SSC / FSC, см. рис 2А, 2В); начните получать данны е. О кончите получать д анны е ровно на подсчитанном 2 000-м со б ы ти и для того, чтобы количество гранулоцитов в контрольном образце можно было сопоставить с количеством гранулоцитов в положительном контрольном образце после стимуляции fMLP. Установите тр е тью о бласть 3 во кр уг популяции гранулоцито в (дот плот диаграммы SSC / FSC, см. рис. 2А, 2В). Оценка данных: После настройки логического гейта на гранулоциты в области 1 и 3, анализируются следующие два параметра для каждого отрицательного контрольного образца и положительного контрольного (тестируемого) образца: (1) Количество клеток (2) Среднее значение сигнала FSC (только для тестового образца, сигнал управления FSC получают из L-селектина ко нтрольного образца) Оценка экспрессии L-селектина производится в отдельной гистограмме FL1. Для этого используйте L-селектин контрольного образца для установки маркера флуоресценции-1 (FL1) таким образом, чтобы положительными были менее прим. 15% клеток (см. рис. ЗА). Затем определите процентное соотношение активированных гранулоцитов, показывающих снижение экспрессии L-селектина в исследуемом образце (см. рис. ЗВ). Также необходимо анализировать, управляющий сигнал FSC в L- селектине контрольного образца (участок точек диаграммы SSC / FSC). Для оценки данных воспользуйтесь следующей итоговой таблицей. ара- метр Пробирка №1 Пробирка №2 Пробирка № 3 1 Количеств 0 клеток Количество клеток - 2 - Среднее значение сигнала FSC Среднее значение сигнала FSC 3 - Процент ное соотноше ние активи- рованых клеток Процент ное соотноше ние активи рованных клеток РИСУНКИ Рекомендуется гейтирование при получении данных, данные получают с помощью установления порога флуоресценции в канале FL3 (красная флуоресценция > 630 нм). Область 1 настроена на лейкоциты и гранулы подсчета (см. рис. 1А и 1В). S S C H Рис. 1А Область 1 настроена на лейкоциты и гранулы подсчета, отрицательный контрольный образец --- стр. 19 --- И нструкция MIGRATEST“ версия 09/08 С траница 6 из 9 G L Y C Т ^ Р Е I B io t e c h n o lo g y Гранулы подсчета R 1 Лейкоцкггы Гранулоцкты 1023 SSCH Рис. 1В Область 1 настроена на лейкоциты и гранулы подсчета, гранулы положительного контрольного образца Типичный дот плот SSC/FSC, отображаемый при получении данных и анализе, гейт установлен на область 1. Область 2 настроена на гранулы подсчета, область 3 настроена на гранулоциты (см. Рис. 2А и 2В) Грлнулоциты Рис. 2А Область 2 установлена на гранулы подсчета, область 3 установлена на гранулоциты, отрицательный контрольный образец SSC-H Рис. 2В Область 2 установлена на гранулы подсчета, область 3 установлена на гранулоциты, положительный контрольный образец Примечание: Изменение формы гранулоцитов (FSG-H- сигнал)! Гистограммы FL1 при анализе данных, гейт установлен на сочетании областей 1 и 3 (см. рис ЗА и ЗВ) 10° 10’ 102 10^ 10* 1=«еле»аин-ГГГС Рис. ЗА Гистограмма FL1 популяции гранулоцитов в области 3, L-селектина контрольного образца 10’ 102 10^ 1-селектин-РГГС 10‘ Рис. ЗВ Гистограмма FL1 популяции гранулоцитов в области 3, тестовый образец Заметка: Увеличение процентного соотношения активированных клеток указывает на снижение экспрессии L-селектина --- стр. 20 --- И нструкция MIGRATEST” версия 09/08 С траница 7 из 9 I G L Y C Т Ф Р Е I B io t e c h n o lo g y З А М Е Ч А Н И Я 1. Гепаринизированная цельная кр ов ь должна быть обработана в течение 24 ч после отбора проб. О бразцы крови следует хранить при ком натной тем пературе до обработки. 2. При настройке тестирования полезно двойные определения. 3. Предлагаемая схема испытаний позволяет исследовать процесс хемотаксиса после инкубационного периода от 30 мин. Для получения более высоких значений параметра «количество мигрировавших через включения клеточной культуры» необходимо увеличить время инкубации. 4. При тестировании воздействия препаратов на усиление или ингибирование хемотаксической функции, полезно сначала инкубировать клеточную взвесь с тестируемым препаратом. После этого клетки стимулируются хемоаттрактантом fMLP. Т О Ч Н О С Т Ь М Е Т О Д И К И Внутрианалитическая точ н о сть данного анализа была определена на трех тестовых образцах (стимулированных fMLP), взятых от здоровых добровольцев. Количество клеток после миграции Среднее значение сигнала FSC % активиров анных фанулоци- тов Диапазон значений 3 002- 14 162 615-713 97,01- 99,44 Средний KB (%) 9,1 1.9 0,2 n 15 10 10 О Ж И Д А Е М Ы Е Р Е З У Л Ь Т А Т Ы ■Нормальный диапазон хемотаксической активности гранулоцитов и моноцитов определяется на образцах свежей гепаринизированной цельной крови здоровых людей. Количество клеток после миграции Среднее значение сигнала FSC % активиров анных клеток L-селектин контроль - 250-450 <10% Контрольн ый образец 100-1 500 - - Тести руемый образец 2 500-15 000 500-750 > 90% . О Г Р А Н И Ч Е Н И Я ? ; - 1. Лаборатории должны создавать собственные диапазоны нормальных значений, используя свои условия испытаний. 2. Образцы должны содержать более 95% жизнеспособных клеток и к ним должна быть добавлена полная доза антикоагулянта. 3. Готовые для измерения образцы стабильны в течение 2 часов на льду после добавления реагента Е (прижизненный раствор для окраски ДНК). С С Ы Л К И (1) Roitt 1М, Brostoff J, Male DK. 1996. Immu nology, 4th ИЗД Gower Medical Publishing Ltd., London. (2) Sawyer DW, Donowitz GR, Mandell, GL. 1989. Polymorphonuclear neutrophils: An ef fective antimicrobial force. Обз. Infect. Dis. 11: S1532-SI 544. (3) Donadebian HD, 1989. Congenital and ac quired neutrophil abnormalities. In: Klemp- ner, M.S. et al. (ред) Phagocytes and Dis ease. Kluwer, Dordrecht Boston New York, pp 103-118. (4) Robinson JP, Carter WO. 1993. Flow cy tometric analysis of granulocytes. In: Bauer, K.D. et al. (ред) Clinical Flow Cytometry, Principles and Applications. Williams & W il kins, Baltimore, pp 405-433. --- стр. 21 --- И нструкция MIGRATEST" версия 09/08 С траница 8 из 9 (5) Anderson DC, Springer ТА. 1987. Leukocyte adhesion deficiency: an inherited defect in the Mac-1, LFA-1 and p i 50, 95 glycopro teins. Annu Rev IVled 38: 175-194. (6) Gallin Jl, W right DG, Malech HL, Davis JIVI, Klempner MS, Kirkpatrick CH. 1980. Disor ders of phagocyte chemotaxis. Анн Intern Med 92: 520-538. (7) Ottonello L, Dapino P, Pastorino G, Dallegri F, Sacchetti C. 1995. Neutrophil dysfunction and increased susceptibility to infection. Eur J Clin Invest 25:687-92. (8) Ward PA, Berenberg JL. 1974. Defective regulation of inflammatory mediators in Hodgkin’s disease. Supernormal levels of chemotactic-factor inactivator. N Engl J Med 290: 76-80. (9) DeMeo AN, Anderson BR. 1972. Defective chemotaxis associated with a serum inhibitor in cirrhotic patients. N Engl J Med 286: 735- 740. (10) Attia WM, Clark HW, Brown TM. 1982. Inhi bition of polymorphonuclear leukocyte migra tion by sera of patients with rheumatoid ar thritis. Анн Allergy 48: 21-24. (11) Kishimoto TK, Jutila MA, Butcher EC. 1990. Identification of a human peripheral lymph node homing receptor: a rapidly down- regulated adhesion molecule. Proc Natl Acad Sci, USA 87: 2244-2248 G L Y C P E Biotechnology