Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс® Streptococcus pyogenes-скрин/монитор-FL по ТУ 21.20.23-217-01897593-2017 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
V
I
I
\
\
%
«УТВЕРЖДАЮ»
Директор Федерального
бюджетного учреждения науки
«Центральный научно-
исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной
службы по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия
человека (ФБУН ЦНИИ
;потребнадзора)
В.Г. Акимкин
2019 г.
ИНСТРУКЦИЯ по ПРИМЕНЕНИЮ
набора реагентов для диагностики in vitro
АмплиСенс® Streptococcus pyogenes-
скрин/монитор-FL
\
АмплиСенс'
M il
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом ЗА IVD
--- стр. 2 ---
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................... 3
НАЗНАЧЕНИЕ.................................................................................... 3
ПРИНЦИП МЕТОДА............................................................................ 4
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ.......................................................................... 5
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ...................................... 6
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.............................................................................8
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ ... 10
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.................................................13
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА 15
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ ДНК ...........................17
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОБ
ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА ................................................ 19
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ................................. 19
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ .......................................................23
ФОРМА 1 («ПЦР-комплект» вариант FRT-100 FN) .............. 24
СОСТАВ............................................................................................................................','.^24
АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ...........24
A. Подготовка проб для амплификации ....................................................................24
Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени» ...25
B. Анализ и интерпретация результатов ..................................................................26
ФОРМА 2 («ПЦР-комплект» вариант FRT-L)............................... 30
СОСТАВ..................................................................................................................................30
АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ...........30
A. Подготовка проб для амплификации.....................................................................30
Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени» ...31
B. Анализ и интерпретация результатов...................................................... 32
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ ......................36
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ ......................................................36
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ .................. 38
стр 2
--- стр. 3 ---
список СОКРАЩЕНИЙ
BKO-FL - экзогенный внутренний контрольный образен
ГЭ - геномные эквиваленты
ДНК -дезоксирибонуклеиновая кислота
К1, К2 - ДНК-калибраторы
К- - отрицательный контроль ПЦР
ОК - отрицательный контроль экстракции
ОКО - отрицательный контрольный образец
ПК - положительный контроль экстракции
пко - положительный контрольный образец
по - программное обеспечение
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РУ - регистрационное удостоверение
УДГ - ypaцил-ДFIK-гликoзилaзa
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс®Sfrepfococcws pyogenes-
скрин/монитор-FL, далее - набор реагентов, предназначен для количественного
определения ДНК Streptococcus pyogenes в биологическом материале (мазки со
слизистой оболочки ротоглотки, цельная кровь, тканевой (биопсийный, операционный)
материал, синовиальная жидкость, отделяемое эрозивно-язвенных поражений кожи,
спинномозговая жидкость (ликвор), моча) методом ПЦР с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией продуктов амплификации.
Набор реагентов используется в клинической лабораторной диагностике.
Материалом для проведения ПЦР служат пробы ДНК, экстрагированной из
исследуемого материала.
В соответствии с федеральным законом от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об основах
охраны здоровья граждан в Российской Федерации» ПЦР-исследование является
одним из методов всестороннего обследования пациента, на основании которого
лечащий врач устанавливает диагноз и выбирает мероприятия по лечению пациента.
Показания и противопоказания к применению набора реагентов
Набор реагентов используется для исследования биологического материала,
полученного от лиц с подозрением на бактериальную инфекцию (инфекцию,
вызываемую Streptococcus pyogenes).
стр 3
--- стр. 5 ---
о
калибровочная прямая, по которой происходит определение концентрации ДНК-
мишени в исследуемых образцах.
Набор реагентов содержит систему защиты от контаминации ампликонами за счет
применения фермента урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ) и дезоксиуридинтрифосфата.
Фермент УДГ распознает и катализирует разрушение цепей ДНК, содержащих
дезоксиуридин, но не ДНК, содержащей дезокситимидин. Дезоксиуридин отсутствует в
природной ДНК, но всегда присутствует в ампликонах, поскольку
дезоксиуридинтрифосфат входит в состав смеси дНТФ в реагентах для амплификации.
Дезоксиуридин делает контаминирующие ампликоны восприимчивыми к разрушению
ферментом УДГ до начала амплификации ДНК-мишени, и, следовательно, они не могут
быть в дальнейшем амплифицированы.
Фермент УДГ термолабилен и инактивируется при нагревании выше 50 °С и поэтому
не разрушает ампликоны мишени, нарабатываемые в процессе ПЦР.
На этапе амплификации одновременно в одной пробирке проводятся 2 реакции -
амплификация ДНК Streptococcus pyogenes, а также амплификация
последовательности ДНК BKO-FL. Результаты амплификации
Ц,НК Streptococcus pyogenes, а также последовательности ДНК BKO-FL регистрируются
по двум различным каналам флуоресцентной детекции:
Таблица 1
Канал для флуорофора FAM JOE
ДНК-мишень ДНК BKO-FL ДНК
Streptococcus pyogenes
Область амплификации Искусственная нуклеотидная
последовательность
ген эритрогенного токсина
В (speB)
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ
Форма 1: «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 FN
Форма 2; «ПЦР-комплект» вариант FRT-L
Формы 1 и 2 предназначены для проведения амплификации ДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и
позволяют выявлять ДНК в количественном формате. Для проведения полного ПЦР-
исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК,
рекомендованные Изготовителем.
Форма 1 рассчитана на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли.
Форма 2 рассчитана на проведение 96 реакций амплификации, включая контроли.
стр 5
--- стр. 6 ---
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Для данного набора реагентов применимы следующие характеристики:
Диапазон измерения и предел обнаружения
Таблица 2
Вид иссле
дуемого
материала
Транспортная
среда
Мазок со
слизистой
оболочки
ротоглотки
Транспортная
среда для хранения
и транспортировки
респираторных
мазков
Цельная кровь —
Тканевой
(биопсийный,
операционный)
материал
Транспортная
среда с
муколитиком (ТСМ)
Спинномозговая
жидкость (ликвор) -
Синовиальная
жидкость -
Отделяемое
эрозивно
язвенных
поражений кожи
Транспортная
среда с
муколитиком (ТСМ)
Моча -
Комплект
для
экстракци
и ДНК
Комплект
для
амплифИ’
кации
Предел
обнаружения,
ГЭ/мл
Диапазон
измерения,
ГЭ/мл
«РИБО-
преп»
«ПЦР-
комплект»
вариант
FRT-100 FN,
FRT-L
4x10^ 1x10^-
1x10^
Данные значения характеристик достигаются при соблюдении правил, указанных в
разделах «Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала» и
«Подготовка исследуемого материала к экстракции ДF^K».
Аналитическая специфичность
Н1абор реагентов обнаруживает фрагмент ДFIK Streptococcus pyogenes ~ в штамме
Streptococcus pyogenes АТСС® 19615™ из коллекции АТСС (American Туре Culture
Collection, США) в концентрации ^ 1*10^ ГЭ/мл. Аналитическая специфичность набора
реагентов доказана при исследовании ДНК/РНК следующих
микроорганизмов/штаммов, а также Цу\К человека:
- Штаммы Acinetobacter baumannii АТСС®19606™, Candida albicans АТСС® 14053™,
Enterococcus faecatis АТСС® 29212™, Escherichia coli ATCC®25922™, Haemophilus
Influenzae ATCC®33930™, Klebsiella oxytoca ATCC® 49131™, Klebsiella pneumoniae
ATCC®27736™, Listeria длау/ATCC®25401™, Listeria innocua ATCC®33090™, Listeria
monocytogenes ATCC‘^7644™, Moraxella catarrhalis ATCC'^25240‘'^, Neisseria
gonorrhoeae ATCC® 19424™, Neisseria meningitidis ATCC® 13102™, Neisseria
meningitidis ATCC® 13090™, Proteus mirabilis ATCC® 12453™, Pseudomonas
TM
стр 6
--- стр. 7 ---
е
aeruginosa АТСС®15442™, Staphylococcus aureus ATCC®6538P™, Staphylococcus
epidermidis ATCC®12228™, Staphylococcus haemolyticus ATCC®29970™,
Staphylococcus saprophyticus ATCC®49907™, Streptococcus agalactiae ATCC®12386™
из коллекции ATCC (American Type Culture Collection, США)
В концентрации > 1*10^ ГЭ/мл;
- Штаммы Human gammaherpesvirus 4 NIBSC №09/260 в концентрации = 5*10®МЕ/мл,
Human polyomavirus 1 NIBSC №14/212 в концентрации = 2*10^ МЕ/мл,
Human polyomavirus 2 NIBSC №14/114 в концентрации = 1*10^МЕ/мл,
Primate erythropan/ovirus NIBSC № 99/802 в концентрации = 5*10^ МЕ/мл,
Human betaherpesvirus 5 NIBSC № 09/162 в концентрации = 5*10® МЕ/мл из коллекции
NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control, UK);
- Клинические изоляты панели штаммов и изолятов, находящейся в распоряжении
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора: Candida glabrata, Candida
parapsilosis, Enterovirus spp., Human alphaherpesvirus 1, Human alphaherpesvirus 2,
Human alphaherpesvirus 3, Human betaherpesvirus 6A, Human betaherpesvirus 6B,
Human betaherpesvirus 7, Pneumocystis jirovecii, Streptococcus mitis,
Streptococcus sanguis, Toxoplasma gondii в концентрации >1*10'’ ГЭ/мл;
- ДНК человека, производства Sigma Aldrich, США в концентрации > Г10® ГЭ/мл.
При тестировании образцов ДНК/РНК вышеперечисленных микроорганизмов и ДНК
человека неспецифических реакций выявлено не было.
Информация об известных интерферирующих соединениях указана в разделе
«Интерферирующие вещества и ограничения по использованию проб исследуемого
материала».
Воспроизводимость, повторяемость и правильность
Воспроизводимость и повторяемость были определены путем тестирования
стандартного образца предприятия (СОП ПКО ДНК Streptococcus pyogenes) с
концентрациями 1x10®, 1x10® и IxlO'* ГЭ/мл, находящимися в пределах диапазона
измерения.
стр 7
--- стр. 8 ---
Таблица 3
Воспроизводимость
Комплект для
амплификации
Исходное
значение
концентрации,
ГЭ/мл
Количество
повторов
Среднее
значение
концентрации,
1д
Стандартное
отклонение
(SD)
Коэффициент
вариации (CV),
%
ПЦР-
комплект»
вариант FRT-
100 FN
1x10® 80 6,07 0,05 0,83
1x10® 80 5,12 0,05 1,01
1x10'’ 80 4,12 0,06 1,45
«ПЦР-
комплект»
вариант FRT-L
1x10® 80 6,11 0,08 1,29
1x10® 80 5,16 0,09 1,71
1x10^ 80 4,13 0,09 2,21
1
Таблица 4
Повторяемость
Ком плект для
ам плиф икации
Исходное
значение
концентрации,
ГЭ/мл
Количество
повторов
Среднее значение
концентрации,
■ д
Стандартное
отклонение (SD)
Коэффициент
вариации (CV),
%
ПЦР-комплект»
вариант FRT-
100 FN
1x10® 40 6,05 0,03 0,48
1x10® 40 5,03 0,04 0,84
1x10" 40 4,05 0,05 1,14
«ПЦР-
комплект»
вариант FRT-L
1x10® 40 6,07 0,03 0,54
1x10® 40 5,07 0,05 0,89
1x10'’ 40 4,09 0,06 1,39
г
правильность была определена путем тестирования стандартного образца предприятия
(СОП ПКО ДНК Streptococcus pyogenes) с известной концентрацией.
Таблица 5
Правильность
К ом плект для
ам плиф икации
Количество
повторов
среднее значение
измерения, 1д
Установленное
значение, 1д
Систематическая
погрешность (В), %
ПЦР-комплект»
вариант FRT-100 FN 100 6,78 6,78 0,00
«ПЦР-комплект»
вариант FRT-L 100 6,72 6,78 0,91
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Для подтверждения диагностической чувствительности и специфичности набора
реагентов АмплиСенс® Streptococcus руоделез-скрин/монитор-П были использованы
образцы биологического материала (мазки со слизистой оболочки ротоглотки, цельная
кровь, тканевой материал, синовиальная жидкость, отделяемое эрозивно-язвенных
поражений кожи, спинномозговая жидкость (ликвор), моча), полученные от 550
стр 8
--- стр. 9 ---
пациентов со стрептококковой инфекцией и от 210 пациентов без стрептококковой
инфекции.
Таблица 6
Результаты тестирования набора реагентов для диагностики in vitro
АмплиСенс® Streptococcus руодепея-скрин/монитор-ри
Тип образцов
Результаты применения
АмплиСенс® Streptococcus
руоделеа-скрин/монитор-РЬ
Результаты применения
метода сравнения^
Положительных Отрицательных
Мазок со
слизистой
оболочки
ротоглотки
Всего
исследовано
230 образцов
положительных 134 0
отрицательных 0 96
Цельная кровь
Всего
исследовано
80 образцов
положительных 31 0
отрицательных 0 49
Тканевой
{биопсийный,
операционный)
материал
Всего
исследовано
80 образцов
положительных 29 0
отрицательных 0 51
Синовиальная
жидкость
Всего
исследовано
80 образцов
положительных 33 0
отрицательных 0 47
Отделяемое
эрозивно
язвенных
поражений кожи
Всего
исследовано
80 образцов
положительных 28 0
отрицательных 0 52
Спинномозговая
жидкость
(ликвор)
Всего
исследовано
80 образцов
положительных 26 0
отрицательных 0 54
Моча
Всего
исследовано
130 образцов
положительных 63 0
отрицательных 0 67
т
щ
Бактериологический посев на питательную среду «PYR агар для выделения и идентификации
S.pyogenes (PYR Agar)», РУ № ФСЗ 2009/03709,
стр 9
--- стр. 15 ---
24. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,1 мл (например, Axygen, Inc.
(«Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
25. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-
С», ЗАО «Ламинарные системы», Россия, или аналогичный).
26. Вортекс (например, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
27. Автоматические дозаторы переменного объема (например. ООО «Биохит», Россия,
или аналогичные).
28. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в
режиме «реального времени», имеющий 2 или более независимых каналов
флуоресцентной детекции (например, Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH («Киаген
ГмбХ»), Германия), CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc. («Био-Рад Лабораториз, Инк.»),
США) и другие, рекомендованные Изготовителем).
29. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.
30.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
31. Емкость для сброса наконечников.
32. ПО для автоматической обработки результатов, зарегистрированное в
установленном порядке.
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Материалом для исследования служат:
- мазки со слизистой оболочки ротоглотки,
- цельная кровь,
- тканевой (биопсийный, операционный) материал,
- синовиальная жидкость,
- отделяемое эрозивно-язвенных поражений кожи,
- спинномозговая жидкость (ликвор),
- моча.
Мазки со слизистой оболочки ротоглотки
Взятие мазков производят при помощи сухого стерильного зонда-тампона
вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки
ротоглотки.
После взятия мазка рабочую часть зонда помещают в стерильную одноразовую
пробирку с 500 мкл транспортной среды для хранения и транспортировки
респираторных мазков. Аккуратно обламывают пластиковый стержень на расстоянии
не более 0,5 см от рабочей части и оставляют рабочую часть зонда с материалом в
стр 15
--- стр. 16 ---
J
пробирке. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают, маркируют.
Цельная кровь
Взятие крови следует производить натощак или через 3 часа после приема пищи
одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в пробирку (специальная вакуумная система
типа «Vacuette®» (сиреневые крышки - 6% EDTA)) с раствором ЭДТА а качестве
антикоагулянта. После взятия крови пробирку следует плавно несколько раз
перевернуть вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с
антикоагулянтом. (В противном случае кровь свернется, и экстракция ДНК станет
невозможной!). После плавного перемешивания пробирку поместить в штатив.
Тканевой (биопсийный, операционный) материал
Материал следует забирать из зоны предполагаемого местонахождения
возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или из пограничного с повреждением
участка.
Кусочки ткани диаметром не более 5 мм следует поместить в одноразовые
пробирки объемом 2,0 мл с 500 мкл Транспортной среды с муколитиком (ТСМ),
Кусочки ткани диаметром более 5 мм помещают в одноразовые пластиковые
контейнеры с широким горлом объемом не менее 50 мл.
Синовиальная жидкость
Синовиальную жидкость следует забирать с помощью одноразовых игл в
количестве не менее 1,0 мл в одноразовые пробирки объемом 2,0 мл.
Отделяемое эрозивно-язвенных поражений кожи
Образцы отделяемого эрозивно-язвенных поражений кожи получают при помощи
сухого стерильного зонда-тампона вращательными движениями с эрозивно-язвенного
поражения кожи.
После взятия мазка рабочую часть зонда помещают в стерильную одноразовую
пробирку с 500 мкл транспортной среды с муколитиком (ТСМ). Аккуратно обламывают
пластиковый стержень на расстоянии не более 0,5 см от рабочей части и оставляют
рабочую часть зонда с материалом в пробирке. Пробирку с раствором и рабочей
частью зонда закрывают, маркируют.
Спинномозговая жидкость (ликвор)
Спинномозговую жидкость (ликвор) получают путем прокола поясничной,
субокципитальной области или мозговых желудочков одноразовыми пункционными
иглами. Забор спинномозговой жидкости (ликвора) в количестве не менее 1 мл
проводят в одноразовые стерильные пластиковые пробирки объемом 2,0 мл.
стр 16
--- стр. 17 ---
4
Моча
Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не более 15 мл
в вакуумную пробирку с помощью набора Вакутейнер. Допускается забор мочи в
пластиковые стерильный контейнеры объемом 60 мл.
Допускается хранение образцов вышеперечисленного материала до проведения
предобработки/ПЦР-исследования:
- при температуре от 18 до 25 °С - не более 8 часов;
- при температуре от 2 до 8 '"С - не более 2 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С — в течение года {кроме образцов
цельной крови и мочи). Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание
материала.
ВНИМАНИЕ! Недопустимо замораживание образцов цельной крови и мочи!
Допускается транспортирование вышеперечисленного материала при температуре
от 2 до 8 °С в течение 1 суток.
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ ДНК
Образцы мазков со слизистой оболочки ротоглотки и отделяемого эрозивно
язвенных поражений кожи не требуют предварительной подготовки.
Цельная кровь, тканевой (биопсийный, операционный) материал, синовиальная
жидкость, отделяемое эрозивно-язвенных поражений кожи, спинномозговая жидкость
(ликвор), моча требуют предварительной подготовки.
Образцы цельной крови
Отобрать 1,0 мл цельной крови в одноразовую пробирку объемом 1,5 мл.
Центрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 8-9 тыс g (например,
12-13 тыс об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation).
Отобрать плазму. К осадку добавить 1 мл «Гемолитика». Аккуратно перемешать
содержимое пробирки на вортексе и оставить на 15 мин при комнатной температуре (от
18 до 25°С), периодически перемешивая на вортексе. Центрифугировать пробирки на
микроцентрифуге при 4 тыс g (8 тыс об/мин) в течение 5 мин. Надосадочную жидкость
отобрать с помощью вакуумного отсасывателя, оставив 100 мкл осадка. После
отмывки осадок клеток должен быть белым, допускается наличие только небольшого
налета розоватого цвета над осадком (остатки разрушенных эритроцитов). При
необходимости можно повторить отмывку «Гемолитиком». Полученный осадок должен
быть немедленно лизирован (в случае экстракции комплектом «РИБО-преп» добавить
300 мкл раствора для лизиса и в последующем экстрагировать ДНК в соответствии с
стр 17
--- стр. 18 ---
инструкцией к комплекту реагентов «РИБО-преп», не добавляя раствор для лизиса
повторно).
Допускается хранение предобработанных с помощью раствора для лизиса образцов
цельной крови до проведения ПЦР-исследования:
- при температуре от 18 до 25 °С - не более 6 часов;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С — в течение года;
- при температуре не выше 68 °С - длительно.
Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.
Образцы тканевого материала (биопсийный, операционный)
Тканевой материал (биопсийный, операционный) диаметром 5-10 мм поместить в
стерильную фарфоровую ступу и измельчить пестиком. В полученный гомогенат
добавить 1 мл транспортной среды с муколитиком (ТСМ) и тщательно перемешать
пестиком. 100 мкл полученной суспензии используют для экстракции ДНК.
Тканевой материал (биопсийный, операционный) диаметром менее 5 мм поместить
в стерильную фарфоровую ступу и измельчить пестиком. В полученный гомогенат
добавить 0,5 мл транспортной среды с муколитиком (ТСМ) и тщательно перемешать
пестиком. 100 мкл полученной суспензии используют для экстракции ДНК.
Образцы синовиальной жидкости
В одноразовую пробирку объемом 1,5 мл отобрать 1 мл синовиальной жидкости.
Центрифугировать в течение 5 мин при 8-9 тыс g (например, 12-13 тыс об/мин для
микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation). Отобрать
надосадочную жидкость, оставив 100 мкл осадка для последующей экстракции ДНК.
Образиь[ спинномозговой жидкости (ликвора)
В одноразовую пробирку объемом 1,5 мл отобрать 1 мл спинномозговой жидкости
(ликвора). Центрифугировать в течение 5 мин при 8-9 тыс g (например, 12-13 тыс
об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation). Отобрать
надосадочную жидкость, оставив 100 мкл осадка для последующей экстракции ДНК.
Образцы мочи
В одноразовую пробирку объемом 1,5 мл отобрать 1 мл мочи. Центрифугировать в
течение 5 мин при 8-9 тыс g (например, 12-13 тыс об/мин для микроцентрифуги
MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation). Отобрать надосадочную жидкость,
оставив 100 мкл осадка. Добавить к осадку 100 мкл транспортной среды с муколитиком
(ТСМ) и тщательно перемешать на вортексе. Экстракцию проводить из 100 мкл
образца.
Допускается хранение предобработанных образцов вышеперечисленного
стр 18
--- стр. 19 ---
материала (кроме образцов крови) до проведения ПЦР-исследования:
- при температуре от 18 до 25 °С - не более 6 часов;
- при температуре от 2 до 8 ‘'С - не более 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение года;
- при температуре не выше 68 °С - длительно.
Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОБ
ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Непригодными для исследования являются:
- образцы биологического материала собранные более чем за 48 часов до момента
доставки в лабораторию;
- образцы цельной крови, взятые в пробирки с гепарином в качестве антикоагулянта;
- образцы цельной крови, содержащие кровяной сгусток или подвергшиеся
заморозке.
Для контроля эффективности экстракции ДНК и реакции амплификации в наборе
реагентов предусмотрено использование внутреннего контрольного образца (BKO-FL),
который добавляется в каждый биологический образец на этапе экстракции
нуклеиновых кислот. По окончании реакции амплификации наличие сигнала,
свидетельствующего о накоплении фрагментов ДНК BKO-FL, говорит о достаточной
эффективности экстракции нуклеиновых кислот и отсутствии ингибиторов ПЦР.
Потенциально интерферирующие вещества
Для оценки потенциальной интерференции были выбраны эндогенные и/или
экзогенные вещества, которые могут присутствовать в биологическом материале
(мазки со слизистой оболочки ротоглотки, цельная кровь, тканевой (биопсийный,
операционный) материал, синовиальная жидкость, отделяемое эрозивно-язвенных
поражений кожи, спинномозговая жидкость (ликвор), моча), используемом для
исследования.
Цельная кровь
Были протестированы образцы цельной венозной крови, взятые в пробирки с ЭДТА
в качестве антикоагулянта без добавления и с добавлением эндогенных потенциально
интерферирующих веществ в концентрациях, превышающих верхнюю границу
нормальной концентрации этих веществ в цельной крови (см.табл. 8).
Для оценки влияния экзогенных веществ (антикоагулянтов), были протестированы
образцы цельной венозной крови, взятые в пробирки с гепарином и в пробирки с ЭДТА
стр 19
--- стр. 28 ---
ФОРМА 1. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
результата, необходимо развести реагентом К - экстрагированный
образец ДНК (например, в 100 раз) и повторить тестирование с
этапа амплификации. Полученный при повторном тестировании
результат необходимо умножить на коэффициент разведения
образца.
ВНИМАНИЕ! Граничные значения Cf указаны во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Результат считается достоверным, если получены правильные результаты
для контролей этапов экстракции и амплификации ДНК в соответствии с табл.
12 и вкладышем, прилагаемым к набору реагентов.
Таблица 12
Контроль
Контролируемый
этап ПЦР-
исследования
Результаты амплификации по каналу для флуорофора
РАМ JOE
ОК Экстракция ДНК опоеделено значение Ct
меньше граничного значение Ct отсутствует
ПК Экстракция ДНК опоеделено значение Ct
меньше граничного
опоеделено значение Ct
меньше граничного;
значение концентрации
укладывается в диапазон
к- ПЦР значение Ct отсутствует значение Ct отсутствует
К1 ПЦР опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
К2 ПЦР опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct и диапазон концентрации
ПКО Streptococcus pyogenes указаны во вкладыше, прилагаемом к набору реагентов.
Возможные ошибки:
1. Для положительного контроля экстракции (ПК) значение порогового цикла {Ct) по
каналам для флуорофоров РАМ и/или JOE отсутствует или превышает граничное
значение. Необходимо повторить ПЦР-исследование, начиная с этапа экстракции
ДНК, для всех образцов.
2. Рассчитанная концентрация ПКО Streptococcus pyogenes не укладывается в
диапазон, указанный во вкладыше, необходимо повторить ПЦР-исследование
для всех образцов, начиная с этапа экстракции ДНК.
3. Для отрицательного контроля экстракции (ОК) по каналу для флуорофора JOE
определено значение порогового цикла (Cf). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
стр 28
--- стр. 29 ---
ФОРМА 1. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая ДНК. начиная с этапа экстракции ДНК.
4. Для отрицательного контроля ПЦР (К-) по каналам для флуорофоров РАМ и/или
JOE определено значение порогового цикла {Ct). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая ДНК.
5. Для ДНК-калибраторов К1 и К2 отсутствует значение порогового цикла (Cf) и
расчетная концентрация по какому-либо из указанных каналов для флуорофоров
(см. табл. 12). Необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех
образцов.
6. Коэффициент корреляции при построении калибровочной прямой менее 0,98.
Необходимо проверить правильность заданных концентраций ДНК-калибраторов
в соответствии с вкладышем к набору реагентов. При повторном получении
неудовлетворительного результата необходимо повторить амплификацию и
детекцию для всех образцов.
7. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на
графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального
подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию).
Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или
параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном
уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести
амплификацию и детекцию для этого образца.
i
стр 29
--- стр. 30 ---
ФОРМА 2 («ПЦР-комплект» вариант FRT-L)
СОСТАВ
ФОРМА 2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
«ПЦР-комплект» вариант FRT-L - комплект реагентов для амплификации
фрагмента ДНК Streptococcus pyogenes с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени» - позволяет проводить ПЦР-
Реагент Описание Объем, мл Количество
ПЦР-смесь Streptococcus
pyogenes-Lyo Порошок белого цвета -
96 пробирок
объемом 0,2 мл
для ПЦР
К1 SP Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
K2SP Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
К- Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
BKO-FL Прозрачная бесцветная
жидкость 1,0 1 пробирка
ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 2 пробирки
ПКО Streptococcus pyogenes Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 1 пробирка
Комплект реагентов рассчитан на проведение 96 реакций амплификации, включая
контроли.
I
АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
А. Подготовка проб для амплификации
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы ДНК - 25 мкл.
1. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации с готовой
лиофилизированной реакционной ПЦР-смесью Streptococcus pyogenes-Lyo для
амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов (количество
контрольных образцов см. в п. 3).
2. В подготовленные пробирки внести по 25 мкл проб ДНК, полученных в
результате экстракции из исследуемых образцов.
ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
3. Поставить контрольные реакции:
а) ДНК-калибратор К1 - в две пробирки с реакционной смесью внести по 25 мкл
стр 30
--- стр. 34 ---
ФОРМА 2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
Таблица 16
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контроль
Контролируемый
этап ПЦР-
исследования
Результаты амплификации по каналу для
ФлуороФооа
РАМ JOE
ОК Экстракция ДНК опоеделено значение Ct
меньше граничного значение Ct отсутствует
ПК Экстракция ДНК опоеделено значение Ct
меньше граничного
опоеделено значение Ct
меньше граничного;
значение концентрации
укладывается в диапазон
к- ПЦР значение Ct отсутствует значение Ct отсутствует
К1 ПЦР опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
К2 ПЦР опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
опоеделено значение Ct и
расчетная концентрация
ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct и диапазон концентрации ПКО Streptococcus
pyogenes указаны во вкладыше, прилагаемом к набору реагентов.
Возможные ошибки:
1. Для положительного контроля экстракции (ПК) значение порогового цикла {Ct) по
каналам для флуорофоров РАМ и/или JOE отсутствует или превышает граничное
значение. Необходимо повторить ПЦР-исследование, начиная с этапа экстракции
ДНК, для всех образцов.
2. Рассчитанная концентрация ПКО Streptococcus pyogenes не укладываются в
диапазон, указанный во вкладыше, необходимо повторить ПЦР-исследование
для всех образцов, начиная с этапа экстракции ДНК.
3. Для отрицательного контроля экстракции (ОК) по каналу для флуорофора JOE
определено значение порогового цикла (Cf). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая ДНК, начиная с этапа экстракции ДНК.
4. Для отрицательного контроля ПЦР (К-) по каналам для флуорофоров РАМ и/или
JOE определено значение порогового цикла (Cf). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых обнаружена
стр 34
--- стр. 35 ---
ФОРМА 2. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
специфическая ДНК.
5. Для ДНК-калибраторов К1 и К2 отсутствует значение порогового цикла (СО и
расчетная концентрация по какому-либо из указанных каналов для флуорофоров
(см. табл. 16). Необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех
образцов.
6. Коэффициент корреляции при построении калибровочной прямой менее 0,98.
Необходимо проверить правильность заданных концентраций ДНК-калибраторов
в соответствии с вкладышем к набору реагентов. При повторном получении
неудовлетворительного результата необходимо повторить амплификацию и
детекцию для всех образцов.
7. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на
графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального
подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию).
Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или
параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном
уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести
амплификацию и детекцию для этого образца.
стр 35
--- стр. 36 ---
СРОК годности. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не
подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,
указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано
иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре
от 2 до 8 °С не более 5 сут в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, всеми
видами крытых транспортных средств. Допускается транспортирование при
температуре от 2 до 25 °С не более 3 сут.
«ПЦР-комплект» вариант FRT-100 FN при получении разукомплектовать в
соответствии с указанными температурами хранения.
Хранение.
Форма 1. «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 FN хранить в холодильной камере при
температуре от 2 до 8 °С, кроме ПЦР-смеси-FL Streptococcus pyogenes и ПЦР-
буфера-Н. ПЦР-смесь-FL Streptococcus pyogenes и ПЦР-буфер-Н хранить в
морозильной камере при температуре от минус 24 до минус 16 °С. ПЦР-смесь-FL
Streptococcus pyogenes хранить в защищенном от света месте.
Форма 2, «ПЦР-комплект» вариант FRT-L хранить в холодильной камере при
температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь Streptococcus pyogenes-Lyo хранить в пакетах
с влагопоглотителем в защищенном от света месте.
Холодильные и морозильные камеры должны обеспечивать
регламентированный температурный режим.
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ
Изготовитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик
набора реагентов требованиям, указанным в технической и эксплуатационной
документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий
транспортирования, хранения и применения.
Медицинское изделие техническому обслуживанию и ремонту не подлежит.
Рекламации на качество набора реагентов направлять по адресу 111123,
г. Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, e-mail; cs@pcr.ru
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению
набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и
обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских
работников при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется
10
Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте: www.amDlisens.ru .
стр 36
--- стр. 37 ---
направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную
государственную регулирующую организацию (в РФ - Федеральная служба по
надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим
законодательством.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора
Е.Н. Родионова
Главный врач ФГБУ «Поликлиника N21»
Управления делами Президента
Российской Федерации
Е.В. Ржевская
стр 37