Реагенты для HLA-генотипирования для in-vitro диагностики методом секвенирования — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 6 ---
IПЦР ампликонов (ExoSAP-IT)
I v H C T K a ПЦР ампликонов при помощи ExoSAP-lT расщепляет прай меры и гидролизует dNTPs.
1 ь т е 4 м к л ExoSAP-IT в амплификационные пробирки.
1 )и б о т е с набором В Locus Group kit добавьте ExoSAP-lT только в пробирки с позитивными треками (1250 п.н.)
б от е с набором DRB Group Kit, добавьте ExoSAP-lT только в пробирки с позитивными треками (300 п.н.)
Р раб от е с набором DPB1 локуса, добавьте ExoSAP-IT только в пробирки с позитивными треками (300 п.н.)
т е пробирки и центрифугируй те примерно 5 сек.
ат н о перемеш ай те реакционные смеси (примерно 5 сек.)
рифугируй те содержимое пробирок.
ст и т е пробирки или планшет в термоциклер и используй те следующ ий режим:_____________________
Шаг Кол-во циклов Температура Время
1 37°С 20 мин.
80°С 20 мин.
!ржка 1 4“С Неопр.
мечание: Очищенные при помощи ExoSAP-IT ампликоны могут храниться до I недели при -20°С.
[Реакция секвенирования
Л ок у с А, В, В
1 ^ 1 | н ескол ько
./ам пл иф икац ий , С
Локус DRBI Локус DRB
несколько
амплификаций
Локус DQB1 и
DQB1 2
амплификации
Локус DPB1
Экзон 2 прям ой
Экзон2 обратны й
ЭкзонЗ прям ой
Экзон 3 обратны й
Экзон 4 прям ой
Экзон 4 обратны й
Экзон 2
обратны й
Экзон 2
Прямой
Кодон 86 обратны й
Экзон 2 прямой
Экзон 2 обратны й
Кодон 86 обратны й
Экзон 2
прямой
Экзон 2
обратны й
Экзон 3
Прямой
Экзон 3 обратны й
Экзон 2 прямой
Экзон 2 обратны й
К ол-во В локус реакций секвенирования в наборе В Locus Group l< it будет варьировать в зависимости от кол-ва позитивных
реакц ий . Если обе амплификационные реакции (1250 п.н.) позитивны, ставьте прямую и обратную реакцию секвенирования
д л я экзонов 2 и 3 в обеих позитивных реакциях. Экзон 4 может бы ть секвенирован на этом этапе или после получения
результатов типирования экзонов 2 и 3, когда станет ясно, поможет ли экзон 4 в разрешении неоднозначностей. Только 1 из 2
экзон 4 продуктов (720 п.н.) необходимо секвенировать для любого образца.
Д л я каж дой позитивной локус DRB фуппо-специфической реакции, ставьте 2 реакции секвенирования. Минимальное число
реакц ий секвенирования 2, если образец имеет только одну позитивную амплификацию. Максимальное число реакций
секвенирования 8, когда образец имеет 2 позитивных амплификации DRB1 локуса и 2 позитивных амплификации DRB3/4/5
локуса. Реакцию кодон 86 в этом случае можно поставить по желанию (см. раздел 12).
Д ля каж дой позитивной DPB1 фупповой реакции ставьте 2 реакции секвенирования д л я каждой позитивной реакции.
Д ля набора локуса DQB1 2 Amp ставьте прямую и обратную реакцию секвенирования д л я экзонов 2 и 3 в обеих позитивных
амплификациях. Экзон 2 смесь д л я секвенирования используют с экзон 2 ампликоном, а экзон 3 смесь для секвенирования -
с экзон 3 ампликоном, что сводится в итоге к 4 реакциям секвенирования на 1 образец.
Очень важно убедиться, что подходящая смесь для секвенирования и ампликон помещены в нужную пробирку (лунку).
Внеш ний вид образца зависит от применяемого оборудования, например, от числа капилляров. См инструкцию к
программному обеспечению иТуре™ Sequencing Analysis.
При использовании ABI 3100 предполагается использование 96 луночного планшета следующего вида:
1 : 2 3 4 5 6 7 В 9 10 11 12
( к
П о л о с а
1
3
П о л о с а
2
А
и
D
F
G
Н ▼
К о н ф и г у р а ц и я п л а н ш е т а д л я к а ж д о г о
н а б о р а у к а з а н а в о п и с а н и и п р о ц е д у р ы
и с с л е д о в а н и я
.. 1 1
Подготовка реакций секвенирования:
Только д л я класса 1 1 реакций добавьте 40 м кл ультрачистой воды в очищенные при помощи ExoSAP-lT ампликоны и хорошо
перем еш ай те.
Д ля класса 1 и класса II реакций добавьте 2 м кл очищенных при помощи ExoSAP-IT ампликонов (или разведенных класс II
ампликонов в соответствующую пробирку или лунку.
Добавьте 8 м кл каждой локус-специфической смеси в соответствующую пробирку или лунку.
--- стр. 7 ---
[пробирки ил и планшет, и аккуратно центрифугируй те пробирки или планш ет.
; пробирки или планшет в термоциклер и выберите следующ ий режим секвенирования:
■ Ш аг Кол-во циклов Температура Время
25 95“С 20 Сек.
50“С 1 5 сек.
60°С 60 сек.
^к а 1 4“С Неопр.
le e врем я реакции ~ 1 .5 часа
дение продуктов секвенирования этанолом
л е проведения секвенирования необходимо провести в течение 24 часов осаждение продуктов секвенирования
1 а в л е н и е м этанола д л я удаления остатков оснований. Инструкции одинаковы д л я реакций секвенирования класса I и П .
ав ь т е 2 м кл РРТ буфера д л я секвенирования в каждую секвенирующую реакционную смесь.
|(н т ри ф уги руй т е.
авьте 40 м кл 100% этанола в каждую смесь.
С к р ой т е планшет и перемеш ивай те в течение минимум 60 секунд.
\к \1ечание: Предварительно убедитесь, что содержимое всех пробирок или лунок хорошо перемешано.
■ Ц ен три ф уги руй те планшет в течение 30 минут с ускорением не менее 2000 g.
[Сним ите крышку, прикрой те фильтровальным полотенцем и переверните. Центрифугируй те с фильтровальным полотенцем
f аккуратно (менее минуты при ускорении 500g) в перевернутой позиции для полного удаления жидкости.
Добавьте 100 м кл 70% этанола к осадку ДНК. Не двигай те планшет.
Ц ентрифугируй те планшет в течение минимум 5 минут при ускорении не менее 2000 g.
Удалите супернатант переворачиванием планшета.
Замечание: Если используются отдельные пробирки, центрифугируйте пробирки в течение минимум 15 минут для
начального осаждения и 5 минут для отмывки при 12000грт. Удалите супернатант быстрым переворотом пробирки или i
аспирацией.
Капиллярный электрофорез продуктов секвенирования
Добавьте 1 5 м кл Hi-Di Formamide (Applied Biosystems, артикул 4311320) к каждому осадку ДНК.
Замечание: Если на этом шаге используются отдельные пробирки, перенесите образцы в 96-луночный планшет
Закрой те планшет и аккуратно центрифугируй те.
Денатурируй те образцы при 95 °С в течение 2 минут в термоциклёре.
Центрифугируй те аккуратно д л я удаления возможных пузы рей воздуха в образцах.
Замечание: Если пузырьки воздуха проникнут в капилляры, это приведет к их разрушению.
Поместите планшет в секвенатор.
Параметры Установки
Dye Set F
Mobility File DT3100POP6{ET}36CM.MOB
Run Module Класс I RapidSeq36_POP6 (переименуй те
новы й модуль например
RapidSeq36_Class 1 и сохраните)
Измените время перенесения
образцов на 14 сек., время ошибки
запуска 2400 сек.
Класс II RapidSeq36_POP6 (переименуй те
н овы й модуль например
RapidSeq36_Class II и сохраните)
Измените время перенесения
образцов на 10 сек., время ошибки
запуска 1600 сек.
Analysis Module ВС-31 OOPOP6RR-SeqOffFtOff.saz
При первом запуске Dyenamic ЕТ Terminator, необходимо поставить
Dyenamic ЕТ Terminator (Amersham)
.матричные стандарты. Следуйте инструкции к
X. РАСЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ
А. Расчёт результатов
Рассчитай те результаты согласно инструкции к прибору и профаммному обеспечению.
Используй те профаммное обеспечение д л я секвенирования д л я сбора первичных данных и создания фай лов по
секвенированию.
Используй те профаммное обеспечение д л я анализа секвенирования uTYPE SBT HLA для работы с данными фай лов по
секвенированию и создания отчёта по HLA-типированию.
Замечание: Рекомендуется устанавливать самую последнюю версию базы данных по специфичностям.
--- стр. 8 ---
т
г DR Codon 86 секвенирование
полученных результатах DRBl-типирования много неоднозначностей, необходимо проверить нуклеотиды
иированны е с кодон 86. 2 последовательные позиции с КК последовательностью (K=G/T) показывают связанную с
8 6 неоднозначность. Это может наблюдаться при работе с локус DRB1 набором для секвенирования ил и со
ощ ими группо-специфическими ампликонами: DRBI*03/11/13/14, DRB1*04, DRB1*08/12, DRB1*15/16, DRB3, DRB5
I с DRB Group набором для секвенирования. Гены DRBl могут бы ть разделены на 2 фуппы, основываясь на
едовательности кодона 86: 1 группа с последовательностью GTG и 2 фуппа с последовательностью GOT в эт ой
Ь ц и и . Использование GTG специфической смеси праймеров (TG Codon 86 Rev Seq Mix) позволяет вы делить одну из двух
л е й образца, д л я разрешения Codon 86 ассоциированной неоднозначности. Результатом будет служить вы явление одного
л я из пары в образце. DR Codon 86 секвенирование проводится одновременно или после DR секвенирования.
ищ енны е при помощи ExoSAP-IT ампликоны из наборов для секвенирования локус DRB1 и локус DRB3, 4&5
пьзуются д л я реакции секвенирования.
в д у й т е инструкциям раздела 7.2. д л я постановки реакции секвенирования.
в д у й т е инструкциям разделов 8-10 д л я завершения реакций секвенирования.
и н ы е следует анализировать совместно с данными, полученными при работе с наборами SeCore DRB1 Locus Sequencing
t и л и DRB Sequencing Kit, несколько амплификаций .
ISeCore DPBl Codon 8 и 85 секвенирование
[Группо-специфические прай меры для секвенирования (GSSPs) совместно с набором SeCore DPB1 Kit (codon 8 + 85)
[позволяют разрешить примерно 68.5% неоднозначностей при работе с реагентами DPB1 Locus (статистические данные).
[Ш ирокий спектр предлагаемых смесей группо-специфических праймеров для секвенирования (GSSP) служит ключом к
разрешению неоднозначностей в HLA-типировании. При помощи разработанного профаммного обеспечения uTYPE v 4.0
д л я анализа нужную смесь праймеров GSSP можно подобрать автоматически, исключая тем самым ручной подбор.
XL КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
До начала работы с наборами SeCore HLA Sequencing Kit в Ваш ей лаборатории выполните контроль качества для методов,
основанных на секвенировании, на образцах, прошедших молекулярное типирование.
В целях проверки всех смесей праймеров на молекулярно-типированных образцах ДНК. В силу труднодоступности
молекулярно-типированного референтного материала некоторые лунки не проверялись позитивным контролем ДНК.
Рекомендуется, чтобы все гомозиготные результаты типирований проверялись в дальней ш ем другими методами.
П улы сыворотки или гепаринизированной плазмы, а также супернатанты стимулированных клеточных культур, немедленно
собранные в аликвоты и замороженные, могут использоваться в качестве контролей . Повторное замораживание-
размораживание не допускаются.
Ведение записей : хорошим лабораторным правилом считается запись серии набора и дату растворения (разбавления)
используемых реагентов.
Контроли: рекомендуется использовать контроли рутинно при каждой постановке для оценки вариабельности анализа.
Рекомендуется вести контрольные карты качества д л я отслеживания характеристик наборов. Контрольные диапазоны
указаны на этикетках флаконов. Результаты вне контрольного диапазона означают, что анализ необходимо повторить.
Повторное измерение образцов также может бы ть использовано д л я оценки межсерий ной воспроизводимости.
Образцы: строго сл ед уй те инструкции пользователя при сборе и хранении образцов. Всегда используй те одноразовые
наконечники д л я исключения контаминации остатками реагентов.
XIL ДИАПАЗОН ОЖИДАЕМЫХ ЗНАЧЕНИЙ
Некоторые DR аллели амплифицируются при помощи других наборов для секвенирования для DRB1, DRB3, 4&5. Таблица
А ллели Амплифицированные при помощи Amp Mix
DRB 1*0820 DRB1*03/11/13/I4
DRBr*1122 DRB 1*04 ^
DRB1*1410
DRB1*1105 DRBl *08/12
DRB1*I317
DRB 1*1404
DRB1*1411
DRB1*1415
DRBl *1428
DRB1*1431
DRB1*1130 DRB3
DRBl *1446
Амплификационная смесь Amp Mix в наборе д л я секвенирования локуса DRB1 не амплифицирует аллели DRBP1130,
DRB1 *1446. Однако эти аллели могут бы ть амплифицированы при помощи смеси для амплификации Amp Mix из набора д л я
секвенирования DRB1, DRB3,4&5 Sequencing Kit.
Бледная полоса неправильного размера > 300 нуклеотидных пар может наблюдаться для некоторых продуктов амплификации
при работе с наборами локусов DRB1, DQB1. На результаты секвенирования не влияет наличие дублетных полос.
--- стр. 9 ---
|у л у ч ш ен и я качества работы наборов и реагентов д л я секвенирования следует придерживаться указанных вы ш е
д ац и й по материалам, реагентам и оборудованию,
к н ы е неоднозначности всех локусов можно н ай т и на ресурсе www.ebi.ac.iik/inial'hla ambiu'lulm. Перечень
| )и ч н ост ей помещен также на сай те компании http:/www.invitrogen.com.
JC H H e проблемных ситуаций
в(!лемы Возможные причины Решения
Щ бая и л и отсутствующая
Шлификация по всему планшету
FastStartT M Taq полимераза не
была добавлена в смесь д л я
амплификации, либо смесь не
была хорошо перемешана после
её добавления
Проведите повторную
амплификацию,
проконтролируйте при этом
добавление полимеразы и
последующее размешивание
смеси д л я амплификации
Неполадки в работе термоциклёраПроверьте протокол запуска
термоциклёра. Обратитесь в
службу технической поддержки
или проведите
перепрофаммирование прибора.
Концентрация ДНК не оптимальнаИспользуй те ДНК, разведенную
до концентрации 1 5- 25 нг/ м кл .
Замечание: В случае, если
концентрация ДНК низкая, а
амплификация слабая,
секвенируй те образец. Результаты
секвенирования и типирования
могут получиться хорошими.
ДНК низкого качества ил и
разложившаяся ДНК
Проводите электрофоретическое
разделение ДНК в 1% агарозном
геле для оценки качества ДНК.
Цельная геноманая ДНК должна
иметь ~ 3000 п.н.
Гелевая картинка очень яркая Повторите электрофорез в
агарозном геле, используя другой
буфер. Например, можно
рекомендовать ClearBand Sample
Loading Buffer, MTRScientific
артикул CB5
Избыток продуктов
амплификации (за исключением
DRB1 продукта амплификации)
Бы ла использована неверная
профамма работы термоциклёра
Повторите амплификацию с
правильной профаммой
Контаминация смеси д л я
амплификации, образца ДНК ил и
рабочей области в лаборатории
Выделите ДНК из свежего
образца. Повторите
амплификацию.
Флуктуационный ш ум ExoSap-IT не добавлена д л я
очистки ампликонов перед
секвенированием
Добавьте смесь ExoSap-lT в ПЦР
продукт
ExoSap-lT не перемешана с ПЦР
продуктомй
Аккуратно перемешай те после
добавления к ампликонам ExoSap-
1 Т ^
Сигнал очень сил ьны й См раздел ниже “ Очень сильны й
сигнал”
Слабая или неправильная матрицаАВ1 3100: Проведите
спектральную перекалибровку
прибора или попробуйте внести
образцы заново
Неправильное перенесение
образцов из планшета на гелевы е
треки (ABI 3100)
Зафузите образцы заново