Материалы расходные для проведения генотипирования вируса иммунодефицита человека ViroSeq HIV-1 с целью выявления мутаций лекарственной устойчивости — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 30 ---
Замечание: установите объем на термоциклере 50
мкл, если запрашивается__________
6. Работайте с пробами для терм оциклера в Области 3.
Не возвращ айтесь в О бласть 2 в конце дня.
7. П еренесите пробирки в терм оциклер и запустите
программу.
Когда программа заверш ена:
• П ереходите к стадии очистки или
• О становитесь и храните пробы в холодильнике при
тем пературе от -15°С до -25°С.
ВНИМАНИЕ! Не оставляйт'е пробирки на холоду
болсс 24 часов. О статочная активность UNG может
разруш ить ваш у а.\ш лиф ицированн\то ДНК. ________
Г . Ц и к л и ч е с к о е с е к в е н и р о в а н и е
В ы полняйте эту процедуру в постам плиф икационной Облас'ги 3,
Г1. Очистка
продуктов ПЦР
Д ля того, чтобы сконцентрировать и очистить
продукты ПЦР:
С оберите микрокопцентратор.
а. Для каж дой пробы пром аркируйте
одну 1.5 мл пробирку для концентрирования
одну колонку M icrocon Spin
б. В каж дую пробирку вставьте соответствую щ е
пром аркироваииую колонку M icrocon Spin белой
м ем браной кверху.
_______________________________
О сторож но перенесите пипеткой 300 мкл стерильной
деионизированной воды в резервуар каждого
м икроконцентратора.
ВНИМАНИЕ! Не трогайте м ем брану наконечником
пипетки.
П еренесите пипеткой 50 мкл П Ц Р-продукта каждой
пробы в резервуар, наполненны й водой
соответствую щ е пом еченного концентратора.
ВНИМАНИЕ! Не трогайте м ем брану наконечником
пипетки.
П лотно закройте каж дую пробирку с помощ ью
прикреплеш ю й крыш ки.
_______________________
Ц ентрифугируйте приготовленны е
м икроконцентраторы при 450-550х g 15 мин.
О ткройте крыш ки пробирок и осторож 1ю добавьте
35 мкл стерильной, деионизированной воды в центр
каж дого м икроконцентратора.
ВНИМАНИЕ! Не трогайте м ем брану наконечником
пипетки.
С лейте содерж имое м икроконцентраторов в новые,
пром аркированны е пробирки.
а. Вы тащ ите м икроконцентраторы из пробирки,
содерж ащ ей фильтрат.
б. П ереверните м икрокопцентратор на верх новой,
соответствую щ им образом пром аркированной 1.5 мл
30
--- стр. 31 ---
пробирки для каждой пробы.
в. Вы бросьте старую пробирку с фильтратом.
8. Ц ентрифугируйте приготовленны е
м икроконцентраторы при 450-550х g 5 мин.
9. В ы тащ ите и уберите м икроконпентраторы , оставляя
пробы в пробирках.
Замечание: Каждая пробирка содерж ит теперь
примерно 35-60 мкл очищ енного П Ц Р продукта.
10. Плотно закройте каж дую пробирку с помощ ью
прикрепленной крыш ки и ;
• П ереходите к постановке агарозного гель-
электроф ореза или
• О становитесь и храните пробы в холодильнике при
тем пературе от -15°С до -25°С, но не больш е двух
недель.
Г2. Количественная
оценка ДНК
Д ля того, чтобы провести агарозны й гель-
электроф орез:
1. Разм орозьте маркеры количества Д Н К при
комнатной тем пературе (1 5 -2 5 ° С). Это займет по
м еньш ей мере 30 мин.
П ерем ещ айте на вортексе 10-15 сек перед
использованием.
2. Разм орозьте буфер для нанесения образцов при
ком натной тем пературе. Это займет по меньпгей
мере 30 мин.
П ерем еш айте на вортексе 10-15 сек перед
использованием.
3. П риготовьте 1% агарозный гель,используя ТВЕ,
содерж ащ ий 0.5 м к г/мл этидиум бром ида (или
используйте купленны й 1% агарозны й гель).
4. П риготовьте IX ТВЕ буфер, содерж ащ ий 0.5 мкг/мл
этиди>7^1 бромида.
5. П ом естите приготовленны й гель в кам еру для геля.
6. Д обавьте достаточное количество IX ТВЕ буфера
так, чтобы покры ть гель.
7. Д ля каж дой пробы смеш айте:
• 5 мкл буфера для нанесения образцов
• 5 мкл очищ енного ПЦР продукта
8. Н анесите маркеры количества ДН К,
А. 6 мкл на дорож ку 1
Б . 3 м к л н а д о р о ж к у 2
Это дает следую щ ие результаты :
Полосы Дорожка 6
мкл (нг)
Дорожка
3 M K V I (нг)Положение Длина (кб)
Верхняя 2.0 100 50
Вторая 1.2 60 30
Третья 0.8 40 20
9. Н анесите на оставш иеся дорож ки по 10 мкл каждой
из проб.
--- стр. 32 ---
ВНИМАНИЕ! Будьте уверены в том .что отметили
где какая проба нанесена (на какой дорож ке).
10. П роводите электроф орез при 10 вольт/см до тех пор,
пока бромф еноловы й синий не пройдет по меньшей
мере 5 см геля.
11. Рассмотрите гель под У Ф светом.
12. С ф отограф ируйте гель, используя время экспозиции,
которое не насыщ ает пленку и дает различия в
интенсивности фрагм ентов м аркеров м ассы ДНК.
13. О цените количество ПЦ Р продуктов в каждой пробе
путем сравнения интенсивности каж дой полосы с
1 интенсивностью низком олекулярны х полос
м аркеров количества Д Н К (см. иллю страцию далее)
14.
1
Р азведите оставш ийся ПЦР продукт для каж дой
пробы деионизированной дистиллированной водой
: (ддНзО) согласно следую щ ей таблице.
Если
интенсивность
полосы
То
20-40 нг Д оведите объем пробы до 60 мкл
40-60 нг Разведите ваш у пробу 1:2 ,д.лН20 (1
часть пробы на 1 часть воды)
60-100 нг Разведите ваш у пробу 1:4 ддПоО (1
часть пробы на 3 части воды)
>100 нг Разведите ваш у пробу 1:10 ддН^О
(1 часть пробы на 9 частей воды)
Замечание: полоса О Т-П Ц Р продукта долж на иметь
интенсивность равн\то или больш е чем 20 нг полоса
м аркера для того, чтобы бы ть уверенны м в высоком
качестве последовательности.
И ллю страция;
6р1 DNA 3 р 1 DNA Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4
fitess Ladder tiV fess Ladder
■евй» V . Dilijte Dilute Dilute Aid water
1:1D 1:4 1:2 to eOjJ-
15. П ерем еш айте каж дую разведенную пробу на
вортексе 3-5 сек
16. Ц ентриф угируйте 1-2 сек при 2000х g чтобы собрать
содерж имое на дно пробирки.
17. К огда процедура закончена, переходите к
Ц иклическому С еквенированию .
--- стр. 67 ---
•Независимо от вирусной нагрузки, интенсивность полосы в агарозе РТ - ПЦР
продукта должна быть равна или больше чем интенсивность контрольной полосы в
20 нг для получения высококачественного сиквенса,
•Присутствие фермента AmpErase UNG в системе геночипирования ViroSeq HIV-
1 снижает риск контаминации только амплифицированным ранее продуктом. При
этом контаминация от образца к образцу или контаминация от позитикною
контроля к образцу всс же может происходить. Внимательное соблюдение
организации рабочих зон (областей) и методики снижает возможность
контаминации.
•В данном анализе могут быть использованы термоциклер и автоматический
секвенатор ДНК только от Applied Biosystems.
• В согласии с черновым руководящим документом ФДА для генотипирования
ВИЧ-1, аналитические исследования с использованием системы генотипирования
Viro-Scq HIV-1 не были завершены для предела детекции для следующих му таций:
Г ен
ОТ
Протеаз
а
М утация
E44D, S 68G, V75T, L100I, К101Е, V108I, Y181I, G190A, G190S.
Р225Н, M230L, P236L, G333D, G333E
L10F, L10V, К20М, L24I, V32I, L33F, M46L, I47V. F53L, I54L. А7П,
А71Т, A71L, G73A, G73S, V 771N88D
Программное обеспечение ViroSeq и Результаты:
• Только обученные пользователи допускаются к использованию программного
обеспечения ViroSeq
• Точность и надежность результатов зависят от хорошего качества секвенирования.
Высокий фон и данные шума могут мешать т’ очному определению
последовательности оснований.
• Понимание и использование редакционных указаний в руководстве по
программному обеспечению ViroSeq H1V-1 Genotyping System Software v . 2.5
software Manual, поможет в получении более точных данных по
последовательностям и выявить мутации, которые в противном случае могут быть
пропущены.
• Для образования некоторых мутаций, таких как V82T, V82S, 'i'2l5Y и др..
необходимы множественные замены нуклеотидов в пределах кодона дикого типа. В
этих случаях, когда присутствуют смеси вируса дикого типа и мутаЕ 1тной формы,
отчет программы сообщает о наличии двух аминокислот, и также приводит
аминокислоты, относящиеся к другим возможным комбинациям кодона. Например,
для смеси Val (GTC) и Ser (ТСС) в кодоне 82, программа информирует о наличии
Val, Ser, Ala (GCC) и Phe (ТТС) - V, S, A, и F. Это является ограничением всех
методологий секвенирования популяций, заключающееся в том, что они не
определяют связь (соединение) нуклеотидов из единичного шаблона (образца).
М утации: Вставки
С Т!1 ^ редких случаях вставки могут приводить к неточному
отчету по устойчивости к препаратам.
1. Программное обеспечение ViroSeq не предназначено для разреш ения с т у а ц и й
когда присутствую т два доминантных вида вируса и один не имеет вставок,
тогда как другой имеет. Эта ситуация легко выявляется при использовании
программного обеспечения ViroSeq и описывается на стр.3-15 руководства по
программному обеспечению (ViroSeq Software Manual) ___________________
67
--- стр. 68 ---
2. Использование секвенирования гена при гепотипировании вирусов со
вставками может дать неединствеппые решения для локализаций вставок и
существования мутаций в неносредственной близости от вставки. Это
ограничение проиллюстрировано и обсуждено в разделе «Мутации вставки» на стр. i
3-15 руководства по программному обеспечению (ViroSeq Software Manual) j
___________________________________________________________ _________________________________________ ______I
Программное обеспечение ViroScq не может интерпретировать пробу со смесью двух или
более популяций вируса, где одна популяпия содержит вставку, а другие нет (для
дальнейшей информации, см. «Мутации вставки» на стр.3-15 руководства по
программному обеспечению).
Мутации в генах протеазы и обратной транскриптазы ВИЧ-1, вызывающие устойчивость к
антиретровирусным препаратам, наиболее часто возникают из-за не синонимичных замен
нуклеотидов, приводящих к изменениям в аминокислотном составе, и. следовательно,
выявляются рутинно. Недавно, был описан новый класс инсерционных мутаций, со
вставками аминокислот в районе кодона 69 гена Обратной Транскриптазы (КГ).
Программное обеспечение ViroSeq может выявлять мутации вставки, когда мутация
присутствует в гомогенной популяции. Однако программа ViroSeq не в состоянии
интерпретировать результаты, если в пробе присутствуют две и более популяций вируса,
где одна популяция содержит вставку, а другая нет. Это ограничение существует для всех
методо.’ югий секвенирования. Мутации вставки в смеси приводят к различной длине
последовательности для разных популяций вируса, приводящим к секвенирующим
«лесенкам», которые не выравниваются по направлению вниз от вставки. Этот феномен
ясно виден при использовании программного обеспечения ViroSeq в виде серий
многочисленных смесей, начинающихся в конце вставки и продолжаЕощихся до конца
последовательности пробы для данного праймера.
Если наблюдается такое рассогласование, для идентификации мутаций вставки следует
применять другие методы (такие как анализ пробы или клонирование).
Вставка в кодоне 69 встречается с очень низкой частотой, менее 1%, у пациентов с
пролонгированной терапией ([31]). В недавних сообщениях показывают, что
исследователям не удавалось выявить мутацию в смесях (дикий тип и мутант) у пациентов
имеющих вирус со вставкой в кодоне 69 ([32]). Этот результат дает основание думать, что
мутация вставки быстро замещала дикий тип, и смеси, если есть таковые, нрисутствова.чи
бы с очень низкой частотой.
Тактико-технические данные
Тактико-технические данные системы генотипирования ViroSeq HIV-1 были оценены при
использовании вирусных и клинических проб, содержащих определенные мутации,
которые дают вирусную устойчивость при антиретровирусной терапии. Клинические
пробы, использованные в анализе, было получены про- и ретроспективно от взрослых и
детей и педиатрических пациентов (в возрасте от 4-х месяцев до 17 лет), принимающих
антиретровирусную терапию. Представленные результаты определяю'т чувствите.чьность
анализа, специфичность, воспроизводимость и точность относительно правильного
определения специфических мутаций в гепах ОТ и протеазы ВИЧ-1, которые дают
устойчивость к одобренным медицинским препаратам. Клинические образцы также бы .т
ис1Юльзованы в исследованиях для определения доли успешных секвенирований и
способности определять мутации в смесях и для определения клинической пригодности.
Были оценены способность системы генотипирования ViroSeq HIV-1 определять
специфические мутации, которые дают вирусную устойчивость в пробе пациента,
оценивать определение лекарственной устойчивости и генерировать конечный Отчет по
Антиретровирусной Лекарственной Устойчивости, который точно следует основанному на
правилах интерпретационному алгоритму. Использование системы генотипирования
ViroSeq HIV-1 увеличит способность врачей оценивать эффективность лекарства и
68
--- стр. 69 ---
создавать индивидуальные терапевтические стратегии в сочетании с другими
клиническими результатами, такими как клиническая картина, лабораторные показатели и
антиретровирусная история.
Таблица 3 представляет собой список мутаций, которые полностью проверены при 2000
копий РНК на мл в согласии с документом ФДА «Draft Guidance Document on IIIV Drug
Resistance Genotype Assays»
Таблица 4 представляет собой список мутаций, которые полностью проверены при 1000
копий РНК на мл в согласии с документо.м ФДА «Draft Guidance Document on HIV Drug
Resistance Genotype Assays»
Таблица 5 представляет собой список мутаций, которые использованы в осиовапном E ia
правилах интерпретационном а 1П'оритме ViroSeq.
Таблица 6 представляет собой список лекарств для которых лекарственная устойчивость
оценена в Отчете по Антиретровирусной Лекарственной Устойчивости ViroScq.
Полностью верифицированный список характеристик
Согласно требованиям ФДА в «Draft Guidance Document on HIV Drug Resistance Genotype
Assays» ниже перечислены мутации, которые определяются с чувс'гви гельносчъю более
чем 90% согласно спецификации в случаях:
• аналитических испытаний на пределе детекции (2000 копий/мл) с 40% мутантных
образцов
• испытаний по клинической валидации с панелью 50 клинических изолятов (вирусная
нагрузка от 1800 до 10500)
Мутации M l841, V82F и V82S были определены в клинических пробах, которые являлись
частью исследования по клинической валидации с высокой вирусной нагрузкой (более чем
10500). Они не включены в верифицированный список, данный в Таблице 3.
Таблица 3. Полностью верифицированный синеок характеристик на пределе
детекции (LOD) 2000 копий/мл.
В обратной транскриптазе
M41L A62V K65R T69D K70R L74V F77L K103N
F116Y V118I Q151M Y181C M184V L210W T215Y T215F
К219Е K219Q
В протеазе
L ] { ) \ K20R D30N M 36I M 46I G48V i I54V L63P
A71V V82T V82A I84V L90M
Таблица 4. Полностью верифицированный список характеристик на пределе
детекции (LOD) 1000 коппй/мл.
В обратной транскриптазе
M41L A62V K65R L74V F77L K103N F116Y V118I
Y181C M184V L210W T215F K219Q
В протеазе
L 10I D30N М 361 M46I G48V I54V L63P A71V
V82T I84V L90M
69
--- стр. 70 ---
Таблица 5. Мутации, цроанализпровапиые в наших исследованиях п нснользовапные
в основанном на правилах интернретацнонном алгоритме для оценки вирусной
устойчивости включаю г:
В обратной транскриптазе
M41L B44D A62V K65R D67N S68G T69D K70R
L74V V75I V75T* F77L L100I К101Е K103N V106A*
V1081 Y115F F116Y V118I Q151M Y181C V181I M184V
Ml 8 4 1 * Y188C* V188L* G190A G190S L210W T215Y T215F
K219Q К219Е Р225Н* M230L* P236L* G333D+ G333E* Мута 1д и я
в ставк и
в кодоне
69*(69
в ставк а)
В мротеазе
L 10I L10F L10R L10V К20М K20R L24I* D30N
V32I L33F M 36I М 461 M46L I47V G48V 150V *
F53L 154V I54L* I54T L63P А71! A71L А71Т
A71V G73A G73S V77I V82A V82F V82S V82T
184V N88D L90M
*- Эти мутации не были определены ни в одной из биологических проб, протестированных
в наших исследованиях.
Таблица 6. Отчет по Антиретровирусной Лекарственной Устойчивости ViroSeq
сообщает данные но вирусной устойчивости к следующим лекарствам:
Нуклеозидные
ингибиторы ОТ*
Не-нуклеозидные
нигибиторы ОТ
Ингибиторы протеазы
Epivir®/Lamivudine/3TC Rescriptor®/delavirdine/DL
V
Agenerase®/amprena\'ir/APV
IlIVID®/Zalcitabine/ddC Sustiva®/efavirenz/EFV Crixivan®/Indinavir/IDV
Retrovir®/zidovudine/AZT V iram une® /N evirapine;'T sIV P Fortovase®/saquinavir/lDV
V idex®/didanosine/d4T Kaletra®/Iopinavir/ABT3 78/r
Zcrit®/stavudine/d4T Norvir®/ritonavir/RTV
Ziagen®/abacavir/ABC Viracept®/nelfinavir/NFV
*- отчет также дает оценку мультинуклеозидной устойчивости благодаря присутствию
комплекса Q151M или вставки 69 ([И ]). Устойчивость к Combovir® и Trizivir® может
быть выведена из отчета.
Аналитическая чувствительность
Два параметра были использованы для определения аналитической чувствительности.
• Определение минимальной вирусной нагрузки ВИЧ-1 для надежной детекции мутации
• Определение наименьшего количества мутантного вируса в смеси, которое позволяет
надежную детекцию мутации.
Предел детекции
Детекция мутаций
Система ViroSeq была способна правильно определить мутации специфической
лекарственной устойчивости, перечисленные ниже при 1000 копий/мл в 100%
мутантных проб и при 2000 коиии/мл в 40Уо мутантных ироб.
70
--- стр. 71 ---
Описание исследования. Для этих исследований предел детекции определен как
наименьшая вирусная нагрузка с чувствительностью 100%. Это исследование использует
единичный набор реагентов. Двенадцать рекомбинантных вирусов были онрсделсЕпл в
отрицательной плазме со 100% чистотой и 40/60 мутантный/дикий тип при следующих
вирусных нагрузках:
1 0 0 6000
2 0 0 20 О О О
600 60 О О О
1 0 0 0 200 О О О
2 0 0 0 750 О О О I
Каждая проба была протестирована в дупликате. Некоторые мутации появлялись в более
чем одном рекомбинантном клоне.
Результаты
• Когда мутация присутствовала в 100% вирусной популяции, пределе детекции для всех
мутаций был 100 копий/мл - это означает, что 100% чувствительность и 100%
специфичность была получена при 1000 копий/мл для всех следующих мутаций.
• В последующих исследованиях при 2000 копий/мл в смеси 40/60, чувствительность для
D67N и T69D была 83% > и 50% соответственно для одного из трех наборов реагентов.
Таблица 7. Мутации оиреде*г1еиные со 100% чувствительностью в 100% му гантных
проб при 1000 копий/мл
В обратной транскриптазе
M41L A62V K65R D67N T69D K70R
L74V V75I F77L K103N V106A VI 1 5 F
F116Y V118I Q151M Y181C M184I/V Y188C/L
L210W T215F/Y K219E/Q S69SSS
[(мутация
вставки в
кодоне 69
(69 вставка)]
В протеазе
L 101/R K20R D30N M 36I M46I G48V
150V 154V L63P A71V V82A/F/S/
Т
I84V
L90M
• Когда мутация присутствует в смеси 40/60 мутантный/дикий тип, совокупная
чувствительность была больше чем 97% и совокупная специфичность детекции была
больше чем 99.9% для всех мутаций при всех вирусных нагрузках больше чем 1000
коний/мл.
• Только при вирусной нагрузке 2000 копий/мл и в смеси 40/60 му'гантный/дикий тип.
совокупная чувствительность была 98.1% (4 ложно негативных (FN)/206) и совокугшая
специфичность была 99.9%) (1 ложно положительный (FP)/1422).
71
--- стр. 77 ---
Результаты показы ваю т, что ни один из перечисленных ниже организмов не мешал
нп не был детектпровап в анализе ViroSeq
Р о д с т в е н н ы е в и р у с ы С о п у т с т в у ю щ и е и н ф е к ц и и
H1V-2 Цитомегаловирус
HTLV-1 Вирус Эпштейна-Барра
HTLV-2 Гепатит В
Гепатит С
И н т е р ф е р и р у ю щ и е с у б с т а н ц и и
Обычно встречающиеся биологические субстанции и ингибиторы обратной траискрии газы
и лекарства против нее, которые присутствуют в плазме крови пациентов были
протестированы системой ViroSeq на их возможность препятствовать определсЕпно
мутаций, которые дают вирусную устойчивость. В этом исследовании любая субстанция,
которая вызывала конкордантность менее чем 90% между генотипом тестируемой пробы и
ожидаемым reHOTHnOiM , считатась мешающей выполнению анализа.
Результаты свидетельствуют, что обычно встречающиеся биологические субстанции и
ингибиторы обратной транскриптазы и лекарства против нее, находимые у ВИЧ-1
инфицированных пациентов, не мешают анализу. Они включают:
• Антиретровирусные препараты AZT, ddl, ЗТС, d4T, абакавир, невирапин, эфавиренц.
Замечание: Мутации обратной транскриптазы V I 181 и Q 151М были определены в 14 из 16
пробах ( 88% чувствительности). Все другие мутации имели чувствительность выше чем
94%.
• Жиры (30 мг/мл), билирубин (0,6 мг/мл) и гемоглобин (5 мг/мл)
Точность и воспроизводимость
Система ViroSeq способна воспроизводимо определять мутации специфической
лекарственной устойчивости в различны х местах определения и с раз 1п,1ми
операторами, с разны ми партиям и, в пределах разных повторов в анализе и в
пределах разны х постановок.
Это утверждение подкреплено исследованиями по аналитической неточности и
клинической воспроизводимости. Исследование по неточности показывает, что уровень
для вариабельности между анализами (%CV) составлял 0.1 - 1.4 % и что уровень
вариабельности в пределах анштиза составлял 0.1 - 5.3 %. Исследование по клинической
воспроизводимости показывает, что система ViroSeq может воспроизводимо определять
специфические мутации, которые дают лекарственн\то устойчивость в пробах ВИЧ-1
инфицированных пациентов с низкой вирусной нагрузкой (1800 - 10 500 копий/мл), когда
мутации составляли 40% или более квазивидов с CV <0.1%, что гораздо ниже уровня
значимости (> 5%).
Исследование неточности
В исследование неточности проверяли шесть смесей мутант/дикий тип при вир\сной
нагрузке 2000 копий/мл и уровне смеси 40% в дупликатах в десяти постановках для
оценки вариабельности в системе генотипирования ViroSeq H1V-1 между постановками
(см результаты в таблице 12 ниже).
77
--- стр. 78 ---
Таблица 12. О ценка коэффициента варцацнн по рекомбнцантном> вирусу и гену
М у т а н т н ы й в и р у с Г е н
%СУ1
О т о п ы т а к о п ы т ув п р е д е л а х о п ы т а
GT-4 ОТ <0.1 2 ,6
Протеаза <0.1 < 0.1
М С-1 ОТ < 0.1 3.7
Протеаза <0.1 1 ,8
МС-2 ОТ <0.1 2,3
Протеаза <0.1 2 2
МС-5 ОТ 1 .4 1 .6
Протеаза <0.1 < 0,1
МС-6 ОТ <0.1 10.9*
Протеаза < 0.1 лJ . J
МС-7 ОТ <0.1 5 ,3
Протеаза < 0.1 2 .2
*Это значение является результатом одной пробы, в которой только 3 из 13 мутаций бь!ли
определены. Для этой пробы, выход ОТ-ПЦР не отвечал требованиям спецификации - он
был примерно 10 нг, что меньше чем требуемый минимум выхода в ОТ-ПЦР в 20 нг.
необходимый для реакций секвенироваыия.
Данные таблицы 12 показывают, что %CV от опыта к опыту находится в пределах <0.1-
1.4. Пять из 6%CV составляют менее 0.1, и один - 1.4. %CV в пределах опыта находится в
рамках <0.1-5.3.
Результаты этого исследования подтверждают заявленпс Селеры о том, что система
генотипироварня ViroSeq HIV-1 имеет пс значимую вариабельность от опыта к
онытл^ (< 5Уо).
Исслсдованне клинической воспроизводимости
Клиническая воспроизводимость системы генотипирования ViroSeq HIV-1 была оценена в
мульти-центровом исследовании для определения вариабельности аиа,тиза в зависимости
от места проведения и разных лотов. В трех местах тестировали 11 проб пациентов с
вирусной нагрузкой в пределах 1800 - 10 500 копий/мл. Каждая из этих 11 проб была
протестирована в дупликате с тремя разными лотами (наборами), что давало 18 значений
да1П1ых на образец (3 места х 3 лота х 2 реплики). Определение всех мутаций
присутствующих в образце было оценено и сравнено для установления вариабельности
(%CV). Результаты в таблице 13 показывают, что вариации в зависимости от места
проведения и номера партии пренебрежимо малы для системы ViroSeq.
Таблица 13. Результаты по клниичсской воспроизводимости
Д и а п а з о н % C V
И с т о ч н и к в а р и а ц и йО Т П р о т е а з а
От места к месту <0.1 <0.1
От лота к лоту < 0.1 <0.1
Внутри анализа < 0.1 <0.1 -4.7*
Итого < 0.1 < 0.1
* Для большинства проанализированных проб, %CV внутри анализа был <0.1. Две пробы
имели значения 1.3 и 4.7.
78
--- стр. 79 ---
Результаты этого исследования подтвер/кдают заявление Селсры о том, что сисгема
генотипировання ViroSeq H1V-1 демонстрирует не значимую (<5%) варнабельиосгь
от места к мест\ н от лота к л от\.
Степени успеха секвенирования и ОТ-ПЦР
Система ViroSeq способна успешно генотиппровать значительную часть (> 98%)
проб популяции - мишени, если дост>пны достаточные количества продукта ОТ-
ПЦР.
Это заявление подтверждается исследованием по успешности секвенирования, которое
дает степень успеха 100% для получения адекватного продукта ОТ-ПЦР (> 20 нг/5 мкл) и
степень успеха 99% для генерации генотипа в пробах 100 взрослых инфицированных
ВИЧ-1 пациентов. К тому же, педиатрическое исследование ACTG 377 демонстрирует
степень успеха 98% для получения адекватного ОТ-ПЦР продукта и генерацию генотипа в
196 пробах из педиатрической популяции, инфицированной ВИЧ-1 ([16]).
Проанализированные пробы имели вирусную нагрузку в пределах от 1084 до > 750 О О О
копий/мл.
Сто образцов от взрослых ВИЧ-1 инфицированных пациентов были нроскринированы для
получения проб, дающих представление о географической кросс секции, состоящей из
различных вирусных нагрузок и мутаций устойчивости. Пятьдесят из этих проб были
сгруппированы в категорию с низкой вирусной нагрузкой (1800-10 500 коний/мл) и
пятьдесят - в категорию с высокой вирусной нагрузкой (свыше 10 500 копий/мл).
Для исследования PACTG 377, три лаборатории (Johns Hopkins, UCLA и New Jersey
Medical & Denial School) и три оператора протестировали 196 проб, которые имели
вирусную нагрузку > 1084 копий/мл. Результаты исследования опубликованы в Journal of
Clinical Microbiology ([16]) выборочные данные представлены ниже в таблицах 14 и 15.
Таблица 14. Пробы PACTCG 377, использованные для анализа (педиатрические)
Лаборатория 1 2 3 Сумма
Число проб 65 6 6 65 1 9 6
Пределы
объема(мл)
0.1-0.5 0 .1 -0.1 0.05-0.5 0.05-0.5
Средний объем
(мл)
0.42 0.4 0.43 0.42
Число проб
<0.5 м л
29/65 (45% ) 30/66 (45% ) 24/65 (37% ) 84/196(43%)
Диапазон
вирусной
нагрузки
(копий/мл)
1084-1 794 664 1205-750 000 1370-3 484 991 1084-3 484 99 1
Таблица 15. Степень успеха для ОТ-ПЦР и секвепироваиия
Низкая вирусная
нагрузка
Высокая вирусная
нагрузка
PACTG 377
Успех ПЦР 50/50 (100%) 50/50 (100%) 192/196 (98% )
Успех
секвенированя
49/50 (98% ) 50/50 (100%) 192/192 (100% )
79