Набор реагентов для выявления и дифференциации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией "АмплигенCoccidioides-РВ" по ТУ 21.20.23-012-01898084-2016 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
х !5^<ь^|^’'Дирёктор ФКУЗ Волгоградский
,##А^*^йтут грспотребнадзора
исследовательский противочумный
7»Н ^ЕО аГд/;
Рч»1§11' Топорков А.в.
2 0 // г.
, —
ИНСТРУКЭД^ЙО:ПР1ШбШЕНИЮ*
«НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ
ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КОедедЙОИДОМИКОЗА
СОССШЮШЕ81ММ1Ш И СОССШЮШЕ8 Р08ЛВА8П МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
«АМПЛИГЕНС0ССЯ)/0/1)Е^5-РВ» по ту 21.20.23-012-01898084-2016»
1. назначение
«Набор реагентов для выявления и дифференциации ДНК возбудителей
кокцидиоидомикоза СоссШюШе^ ттШз и СоссШюШез розаёаш методом полимеразной
цепной реакции с флуоресцентной детекцией «АмплигенСосс/с/ш/й?е5-РВ» по ТУ 21.20.23-
012-01898084-2016», далее - набор реагентов «АмплигенСосс/2^/о/<Уе5-РВ» предназначен для
качественного обнаружения и дифференциации ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза в
пробах клинического материала (кровь, мокрота), секционного материала (биоптаты печени,
селезенки, легкого), биологического материала от животных (сердце, печень, легкие,
селезенка, почки, головной мозг, лимфатические узлы, кровь) и объектов окружаюгцей среды
(почва, воздух, смывы с поверхности), а также выделенных культур микромицетов или
подозрительных изолятов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Кокцидиоидомикоз - инфекционное заболевание, вызываемое особо опасными
диморфными грибами СоссШюМез штШз и СоссШюШез роаа(1аш, которые относят к
микроорганизмам П группы патогенности. С.ттШя эндемичен для Калифорнии (США), а
С.ро8а(^аш имеет значительно более широкое географическое распространение, включая
юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку. В почвах эндемичных регионов
в теплое и дождливое время года возбудители кокцидиоидомикоза растут в виде мицелия. По
мере повышения температуры и снижения влажности внутри мицелия образуются
артроконидии (артроспоры), которые при дальнейшем высыхании легко распыляются и в
большом количестве поступают вместе с пылью в воздух. Основным способом заражения
является аэрогенный. Развитие первичной легочной инфекции напрямую зависит от
заражаюшей дозы возбудителя. Инфицирование людей и многих видов млекопитаюш,их
происходит при ингаляции атроконидий (артроспор) во время обильной вегетации
микромицетов. Опасности заражения подвергаются люди, посещаюгцие эндемичные
территории и пациенты при пересадке органов от больных кокцидиоидомикозом.
Иммунодефицитное состояние макроорганизма увеличивает риск возникновения
заболевания. Аэрозоль микромицета чрезвычайно опасен при манипуляциях в лабораторных
условиях, что требует повышенного уровня безопасности при работе с возбудителями
кокцидиоидомикоза.
Набор реагентов «АмплигенСосс/^/о/^ел'-РВ» используется в клинической
лабораторной диагностике для исследования материала, полученного от лиц обоего пола,
любого возраста с подозрением на кокцидиоидомикоз вне зависимости от формы и наличия
манифестации заболевания (в анамнезе находившихся на эндемичных территориях по
кокцидиоидомикозу), а также в ходе эпидемиологического мониторинга.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ
Для проведения исследований могут быть использованы амплификаторы для ПЦР с
учетом результатов в режиме реального времени типа Ко1ог-Оепе.
Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора входят 7 реагентов:
I
* Введена впервые
Инструкция по применению «АмплигенСосс/<^/о/с/ез-РВ» Страница 1 из 25
--- стр. 2 ---
Реактив Описание Объем
(мл)
Количество
ПЦР-смесь-1
СоссШюШез
смесь праймеров, зондов, дНТФ — прозрачная
бесцветная жидкость
0,3 1 пробирка
ПЦР-буфер-2 прозрачная бесцветная жидкость 0,3 1 пробирка
Тад-Р-ДЖ-
полимераза
прозрачная бесцветная жидкость,
представляюшая собой фермент с
активностью 5 ед/мкл
0,025 1 пробирка
МёСЬ прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой 25 мМ водный
раствор магния хлорида
0,15 1 пробирка
ПКО ДНК
СоссШюШез
препарат ДНК С. розас1азИ — прозрачная
бесцветная жидкость
0,1 1 пробирка
ВКО прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой раствор ДНК
(фрагмент последовательности плазмиды
р11С19) в ТЕ-буфере
0,08 1 пробирка
ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость, содержащая
трис-НС1, На2-ЭДТА
1,0 1 пробирка
Набор реагентов «АмплигенСосс/(^/о/(^е5'-РВ» рассчитан на проведение 50
определений, включая положительные и отрицательные контроли.
Принцип метода — обнаружение специфических фрагментов ДНК микромицета
возбудителя кокцидиоидомикоза основано на использовании мультиплексной полимеразной
цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Метод полимеразной цепной реакции - ПЦР - представляет собой повторяющиеся циклы
синтеза - амплификации специфической области ДНК — мишени в присутствии ТадР
полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, буферного раствора, олигонуклеотидных
праймеров и зондов, распознающих ДНК-мишень. При постановке ПЦР применяется
«горячий старт», обеспечивающийся использованием химически модифицированной Тад-
полимеразы - ДНК-полимеразы, которая активируется при прогреве реакционной смеси
при 95 °С в течение 15 мин, что значительно снижает количество не специфических реакций.
Детекция результатов осуществляется путем измерения интенсивности
флуоресцентных сигналов непосредственно в процессе ПЦР в режиме реального времени.
По каналу РАМ/Огееп детектируется продукт амплификации ДНК С. гттШ з и С. роза^азИ,
соответствующего нуклеотидной последовательности гена МВР-1 (тасгорйа§е ЫпсИп§
рго1е1н), детерминирующего макрофагсвязывающийся белок обоих видов возбудителя
кокцидиоидомикоза По каналу КОХ/Огап§е детектируется продукт амплификации
фрагмента ДНК только одного возбудителя кокцидиоидомикоза С. розас1ази,
соответствующего гену 80Ж§р82 (зрйегик оШег \уа11 § 1усорго1е1п), кодирующего
иммунодоминантный гликопротеин внешней стенки сферул С. розас1азп. По каналу Су5/Кес1
детектируется продукт амплификации ВКО (внутреннего контрольного образца).
Проведение анализа включает два этапа: 1). выделение ДНК из проб клинического и
биологического материала, объектов окружающей среды 2). амплификация на приборах типа
Ко1ог-Оепе. Тип используемых зондов — «молекулярные маяки». Область «петли» зонда
комплементарна анализируемому продукту ПЦР. В ходе реакции происходит гибридизация
молекулярного маяка с ампликоном и расстояние между флуорофором и гасителем
увеличивается, что приводит к повышению флуоресценции, которую фиксирует
амплификатор. Учет результатов флуоресценции проводят по каждому каналу отдельно.
Ограничение метода. В инфицированном материале С. штгНз и С. розос1с1зИ может
быть не обнаружена по причине ингибирования ПЦР-РВ и/или недостаточной
эффективности выделения ДНК. Для достижения показателей аналитической
чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность
выделения нуклеиновых кислот на уровне не менее 20%. Ложноотрицательный результат
Инструкция по применению «АмплигенСосс/Ло/й'е^-РВ» Страница 2 из 25
--- стр. 3 ---
выявляется с помощью внутреннего контрольного образца (ВКО) (п. 7.4.4).
Причиной получения ложноположительного результата является контаминация на
этапе выделения ДНК или на этапе проведения реакции ПЦР в режиме реального времени.
Ложноположительный результат выявляется с помощью отрицательных контрольных
образцов вьщеления и ПЦР-РВ (ОКВ и К-) (ц. 7.4.4).
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗДЕЛИЯ
Аналитическая чувствительность.
Набор реагентов «АиипшшСоссШюШе8-?В» должен выявлять и дифференцировать
ДНК С. ттНА и С. розас^шп в суспензиях концентрацией не менее 1хЮ'*кл./мл.
Аналитическая специфичность.
Набор реагентов «Аыттт^^СоссШюШез-т» не должен давать положительных
результатов с ДНК гетерологичных видов микроорганизмов в суспензиях концентрацией
1х10^кл./мл.
Диагностические характеристики.
Диагностические характеристики набора установлены в лабораторных условиях с
применением 10 штаммов С. ттПА, 15 штаммов С. розааазп и 20 штаммов гетерологичных
микроорганизмов из лаборатории коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-
исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора на модельных образцах
материала: 176 проб суспензий возбудителей кокцидиоидомикоза С. ттШз и С. роза^азп в
концентрации 1x10'* кл/мл, 16 проб клинического материала, контаминированных
возбудителями кокцидиоидомикоза С. ттШз и С. розас1ази в концентрации 1x10'* кл/мл, 32
проб секционного материала, контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза
С. ттШз и С. розас1азИ в концентрации 1x10'* кл./мл, 64 проб биологического материала,
контаминированных возбудителями кокцидиоидомикоза С. штШз и С. розас1азИ в
концентрации 1x10'* кл/мл, 24 проб объектов окружающей среды, контаминированных
возбудителями кокцидиоидомикоза С. ттШз и С. розас1азИ в концентрации 1x10'* кл/мл; 168
проб, контаминированных гетерологичными микромицетами и гетерологичными
микроорганизмами {НШор1азта сарзиШит уаг сарзиШ Ш т, ШзШрЬзта сарзиШит уак
с1иЬ о1зИ , Шз1ор1азта сарзЫШит уаг. /агсштозит, В1аз1отусез Вегт аШ 1<И з, РагасоссШюШез
ЪгазгИепзгз, СгурГососсиз пео/огтапз, Азрег§Шиз /ит1§а(ез, Сапс1Ш а кгшзз1, РетсИИит
сИгеоуШае, РетсИИит сИгтит, ОеоМскит ттШз, Уегзта резНз, ВасШиз ап{Нтс1з,
РзеиАотопаз аегщтоза, ЕзскегШа соИ) в концентрации 1x10’ кл/мл (м.к./мл).
Определение возбудителей кокцидиоидомикоза С. ттШз, С. розас1азИ и
гетерологичных микроорганизмов подтверждено с использованием референтного метода -
микробиологический (микологический) метод исследования микроорганизмов.
Диагностическая чувствительность - не менее 98,0 % с доверительной
вероятностью 90% при анализе 312 положительных проб (176 проб суспензий
микроорганизмов, 16 проб клинического материала, 32 пробы секционного материала, 64
пробы биологического материала, 24 пробы объектов окружающей среды), содержащих
возбудителей кокцидиоидомикоза С. ттШз и С. розас^азИ в концентрации 1x10'* кл/мл
получен положителъный резулътат в 310 случаях.
Диагностическая специфичность - не менее 99,0 % с доверительной
вероятностью 90%; при исследовании 168 отрицательных проб (100 проб суспензий
микроорганизмов, 8 проб клинического материала, 16 проб секционного материала, 32
пробах биологического материала, 12 пробах объектов окружающей среды), содержащих
гетерологичные микромицеты и гетерологичные микроорганизмы (ШзЮрЬзта сарзиШит
уаг. сарзиШит, Шз1ор1азта сарзи1аШт уаг. ШЬогзп, Шз1ор1азта сарзи1а(ит уак /агсшшозит,
В1аз{отусез АвгтаШ Ш ьз, РагасоссШюШез ЪгазШ епз1з, Сгур(ососсиз пео/огтапз, Азрег^Шиз
/ит1§а1ез, СапАШ а кгшзз1, РетсИИит сЫ геоуггШ ае, РетсИИит сИгтит, Сео1г1скит штШз,
Уегзта резИз, ВасШиз аШкгасгз, РзеиИотопаз аеги§тоза, ЕзскегюЫа соИ) в концентрации
1x10’ кл/мл получен отрицательный ответ в 168 случаях.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ
4.1 Информация об инфекционных или микробных рисках
Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на
Инструкция по применению «АмплигенСосс/<//о/4е^'-РВ» Страница 3 из 25
--- стр. 4 ---
деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и
животных 1-1У групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеюгцих
санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами 1-1У
групп патогенности.
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-оцасные, поэтому этапы под
готовки образцов и проведение ПЦР-анализа проводят в соответствии с требованиями СП
1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности», МУ
1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы ИУ групп
патогенности».
4.2 Необходимость обучения персонала
Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высщим и средним
медицинским, биологическим или иным образованием, окончивщие соответствующие курсы
специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными
биологическими агентами (ПБА) 1-П групп патогенности.
4.3 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными, вредного
влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует соблюдать
обычные меры предосторожности для лабораторий:
- пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные халаты;
- не принимать пищу, пить или курить в лабораторных помещениях;
- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них
компонентов набора промыть больщим количеством воды. При приеме внутрь компонентов
набора реагентов за медицинской помощью следует обратиться немедленно.
4.4 Информация об экологических рисках
Уничтожение неиспользованных компонентов набора или наборов реагентов, не прощедщих
контроль, а также серий с истекщим сроком годности проводить в соответствии с СанПиН
2.1.7.2790-10.
4.5 Информация о физических рисках, в том числе возможность взрыва или
возгорания.
Набор реагентов следует применять по назначению в комбинации с приборами, прошедшими
надлежащее техническое обслуживание. Необходимо строгое соблюдение инструкций по
эксплуатации электрооборудования, безопасности при работе с электроприборами.
4.6 Информация о рисках применения, приводящих к ошибочному результату
исследования:
- Использование набора реагентов «АмплигенСосс/Ло/^е^'-РВ»
годности;
- Нарушение условий транспортирования, хранения набора реагентов;
- Нарушения упаковки и внешнего вида компонентов набора реагентов;
- Нарушение условий транспортирования, хранения и подготовки проб;
- Нарушение условий окружающей среды при эксплуатации набора реагентов;
- Нарушение процесса проведения анализа, регистрации и учета результатов.
- Применение по назначению МИ в комбинации со средствами измерения, не прошедшими
поверку и/или калибровку.
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, необходимые при работе с изделием*:
с истекшим сроком
Наименование Основные характеристики или обозначения
документации, производитель
Амплификатор типа Ко1огОепе Амплификатор «К.о1огОепе 6000» (СогЬей
КезеагсЬ, Австралия), «Ко1огОепе ^»,
«^^а§еп», Германия
Бокс биологической безопасности III
класса
Бокс биологической безопасности III класса
“БАВ - Ламинар-С”Рго1ес1 тоЫ1е-1,8,
«Ламинарные системы», Россия
Инструкция по применению «АмплигенСосс/с//о/й?е 5-РВ» Страница 4 из 25
--- стр. 5 ---
ПЦР-бокс Бокс абактериальной воздушной среды для
работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при
проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР-
"Ламинар-С" «Ламинарные системы», Россия
Весы аналитические «А&В ВЬ-1200» Мах 1220§ ё=0, 01§,
напряжение 220 В, «А& П Сотрапу
Ыт11её», Япония
Микроцентрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-вортекс «М1сгозр1п РУ-
2400», НПФ ООО «В1о8ап», Латвия
Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга на 13400 об/мин «М1ш8рт»
«ЕррепбоП», Германия
Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С,
«ТЕРМО 48», «Биоком», Россия.
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения от 4 до 120 °С, «Биоком», Россия
рН-метр рН-метр анализатор воды рН211 в комплекте с
электродом Н1 1131, НАША кЛитеШз,
Румыния
Холодильник «МРК-214Р» рабочий диапазон температур -
основная камера от +2 до +14 °С, морозильная
камера -20-30 °С, 220В, 155 Вт, «8апуо»,
Япония
Отсасыватель вакуумный медицинский с
колбой-ловушкой
Отсасыватель медицинский «В-40», «Висма
Планар» Беларусь
Дозатор 0,5-10 мкл 1Е8 (САРР), Дания
Дозатор 5-50 мкл 1Т8 (САРР), Дания
Дозатор 20 - 200 мкл__________________ 1Е8 (САРР), Дания
Дозатор 100 - 1000 мкл 1Е8 (САРР), Дания
Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов
универсальная на 5 дозаторов, «Хеликон»,
Россия
96-ти луночный алюминиевый штатив
(для пробирок 0,2 мл)
«СогЬеП ВезеагсЬ», Австралия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 1,5 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок
на 1,5 мл, 5x10 мест с увеличенным
расстоянием между лунками,
«Интерлабсервис», Россия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 0,6 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок
на 0,6 мл, 10x20 мест, «Хеликон», Россия
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объема с
аэрозольным барьером до 10 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
1 Наконечники универсальные для
1 дозаторов переменного объема с
И аэрозольным барьером до 100 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
1 Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объема с
аэрозольным баръером до 200 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еш>, США
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объема с
аэрозольным барьером до 1000 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еш>, США
Микроцентрифужные пробирки объемом
1,5 мл ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Микроцентрифужные пробирки для ПЦР
объемом 0,6 мл. ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с
плоской крышкой
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Инструкция по применению «АмплигенСосс/Ло/с/е^-РВ» Страница 5 из 25
--- стр. 6 ---
Пестик для пробирок типа ЕррепёогТ 1,5-
2,0 мл ФСЗ 2011/10287, «881», США
Ступка фарфоровая (№ 1) ГОСТ 9147-80
Пестик фарфоровый (№ 1) ГОСТ 9147-80
Порошок стеклянный марки ПСЗО ГОСТ Р 52233-2004
идежда одноразовая медицинская из
нетканого и полимерного материалов РЗН 2013/668 ~ -----------------■
Перчатки медицинские диагностические
одноразовые. Часть 1. Спецификация на
перчатки из каучукового латекса или
раствора
ГОСТ Р 52239-2004 ---------------
Хлороформ ГОСТ 20015-88
Спирт изопропиловый ГОСТ 9805-84
Спирт этиловый ректификованный из
пищевого сырья ГОСТ 5962-2013
Фенол ГОСТ 6417-72
Натрий уксуснокислый 3-водный, хч ГОСТ 199-78
Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77 -------------------
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Перекись водорода ГОСТ 177-88 ^ ~
1 рис(гидроксиметил)аминометан
Ш18ЕАВ Свидетельство о государственной регистрации
продукции № Ш.77.99.32.008.Е.003285.04.13
МегскКОаА, Германия
Комплект реагентов для выделения ДНК
из клинического материала «ДНК-сорб -
В»
ФСР 2009/05220, ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия
Комплект реагентов для выделения
РНКУДНК из клинического материала
«Рибо-сорб»
* _______ „ __
ФСР 2008/03993, ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия
1
характеристикам не уступающего рекомендуемому.
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ
Материалом для исследования служат:
пробы из суспензий вьщеленных культур возбудителей кокцидиоидомикоза или
подозрительных изолятов;
пробы клинического материала: пробы крови, мокроты,
пробы секционного материала: биоптаты печени, селезенки, легкого,
пробы биологического материтала: суспензии сердца, печени, легкого, селезенки, почек,
головного мозга, лимфатических узлов, кровь;
пробы объектов окружающей среды: почвы, воздуха, смывов с поверхностей.
Каждый образец исследуемой пробы должен быть объемом не менее 0,5 мл.
Все пробы до проведения исследования должны храниться при температуре минус
18 °С.
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично
завинчивающимися крышками в соответствии с требованиями СП 1.3.3118 - 13
«Безопасность работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности», МУ 4.2.2039-05
«Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории»,
МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У групп
патогенности».
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при
температуре от плюс 2 до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036 - 95
«Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-1У групп
патогенности». После проведения предварительной обработки проб допускается их
Инструкция по применению «АмплигенСосс/й'/о/й?ел'-РВ» Страница 6 из 25
--- стр. 7 ---
транспортировка при температуре от минуе 16 до минус 20 °С в течение 7 суток или в сосуде
Дьюара с жидким азотом - длительно.
7. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
7.1. Подготовка исследуемых образцов.
7.1.1. Подготовка проб выделенных культур микромицетов
Исследуемые культуры микроскопических грибов, подозрительные на возбудителей
кокцидиоидомикоза, суспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида, рН (7,2±0,1),
в микропробирке объемом 1,5 мл. Из чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза
готовят суспензии в 2 мл 0,9 % стерильного раствора натрия хлорида, рН (7,2±0,1) по
отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздрава
России (ОСО 42-28-85-П (ЮМЕ)), что соответствует концентрации кл/мл С. ттШз,
С.ротёаш. Затем проводят 10-кратные разведения подготовленных суспензий в 0,9%
растворе натрия хлористого до конечной концентрации кл./мл. Для исследования в
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают суспезии клеток чистой кулътуры в
количестве 1 мл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пп
7.2. 7.3).
7.1.2. Подготовка проб клинического (биологического) материала
Кровь
Кровь у людей берут из локтевой вены в объеме 1 мл и для предотвращения
свертывания сразу добавляют 6 % раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или с помощъю
одноразовой иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специалъной вакуумной системы типа «Уасией» с
ЭДТА или цитратом натрия, или стерилъным шприцем в стерильные стеклянные или
пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1:9).
Аккуратно перемешивают покачиванием до полного смешивания с антикоагулянтом. После
центрифугирования отбирают лейкоцитарное кольцо вместе с плазмой. Хранят при
температуре от 2 °С до 8 °С не более 3 сут при температуре не выше минус 16 °С - в течение
1 месяца, при температуре не выше минус 68 °С - в течение 1 года. Допускается только
однократное замораживание-оттаивание материала. При замораживании клинического
материала его транспортировка должна проводиться также в замороженном состоянии. Для
исследования в отдельную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают пробу в количестве 100
мкл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пн. 7.2, 7.3).
Мокрота
Мокроту забирают в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные
стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее
50 мл. Для разжижения мокроты применяют либо приготовленную ех (етроге смесь ПАЕС
(М-ацетил-Е-цистеина 0,25 г, 25 мл 4 % раствора ПаОН, 25 мл 0,1 М тризамещенного натрия
цитрата), либо раствор «Муколизин» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) (Па2НР04
0,0774 М, МаН2Р04 0,0226 М, бетаМЭ 0,094 М, 5 % азид натрия в конечной концентрации
0,05 %). Пробу объемом 1-2 мл смешивают либо с равным объемом смеси ПАЕС, либо с
пятикратным объемом раствора «Муколизин». Пробы со смесью МАЕС перемешивают
покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 15 мин, периодически встряхивая.
Затем разводят 0,067 М фосфатным буфером (рН 6,8) до конечного объема 50 мл. Пробу
центрифугируют в течение 10 мин при 9000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 %
раствора натрия хлорида. Пробы с раствором «Муколизин» перемешивают покачиванием в
течение 20-30 с и инкубируют в течение 20-30 мин, периодически встряхивая. Затем
отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в микроцентрифужную пробирку объемом
1 ,5 мл с завинчивающейся крышкой и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 10 мин.
Оеадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы
обеззараживания материала и выделения ДНК (пп. 7.2, 7.3).
Секционный материал (биоптаты печени, селезенки, легкого) отбирают при
вскрытии, соблюдая регламентированные меры безопасности. Для растирания кусочков
органов исполъзуют либо стерилъную ступку со стеклянным порошком либо микропробирки
объемом 1,5 мл с пестиком для пробирок типа ЕррепёогЕ
В стерилъной ступке со стеклянным порошком кусочки органов массой до 10 г
Инструкция по применению «АмплигенСоса'4/о/й?е5-РВ» Страница 7 из 25
--- стр. 8 ---
растирают до гомогенного состояния, после чего добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в
соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки через
ватный тампон в отдельную пробирку. Переносят по 1 мл пробы в микроцентрифужные
пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающими крышками, используя наконечник с фильтром.
Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин. Оеадок ресуспендируют в 100 мкл
0,9 ^ раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и
выделения ДНК (пн. 7.2, 7.3).
В микропробирках объемом 1,5 мл кусочки органов массой 0,1-1 г растирают
пестиками до гомогенного состояния, затем добавляют равный объем (не менее 100 мкл)
стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Суспензию
отстаивают при комнатной температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу переносят в
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл, используя наконечник с фильтром. Затем
выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пн. 7.2, 7.3).
Пробы органов лабораторных и диких животных
Органы лабораторных и диких животных отбирают при вскрытии, соблюдая
регламентированные меры безопасности. Кусочки органов (сердце, печень, легкие, селезенка,
почки, головной мозг), лимфотические узлы растирают с использованием либо стерильной
ступки со стеклянным порошком либо микропробирки объемом 1,5 мл с пестиком для
пробирок типа Еррепс1огГ.
В стерильной ступке со стеклянным порошком кусочки органов (сердце, печень,
легкие, селезенка, почки, головной мозг) массой до 10 г, лимфотические узлы целиком
растирают до гомогенного состояния, после чего добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в
соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкости отбирают с помощью пипетки через
ватный тампон в отдельную пробирку. Переносят по 1 мл пробы в микроцентрифужные
пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающими крышками, используя наконечник с фильтром.
Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл
0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и
вьщеления ДНК (пн. 7.2, 7.3).
В микропробирках объемом 1,5 мл кусочки органов и лимфотические узлы массой
0,1-1 г растирают пестиками до гомогенного состояния, затем добавляют равный объем (не
менее 100 мкл) стерилъного 0,9 % раствора натрия хлорида и тщателъно перемешивают.
Суспензию отстаивают при комнатной температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу
переносят в отдельную микропробирку объемом 1,5 мл, исполъзуя наконечник с фильтром.
Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пн. 7.2, 7.3).
7.1.3. Подготовка проб из объектов окружающей среды
Почва
Пробы почвы с мест вероятного обсеменения берут в количестве 20-30 г на глубине до
15 см. Отобранные пробы почвы помещают в стерильные пробирки или в банки. К
исследуемому материалу добавляют 0,9 %-ный раствор натрия хлористого 1:10, тщательно
перемешивают в течение 15 мин, отстаивают в течение 10 мин для оседания крупных частиц.
Надосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в течение 2-3 мин при
5000 об/мин, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Осадок
ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы
обеззараживания материала и выделения ДНК (пп. 7.2, 7.3).
Воздух
Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов (импакторов или
импинжеров), снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами. Объем исследуемого
воздуха должен составлять не менее 3-5 м^.
После окончания отбора пробы воздуха фильтры переносят обожженным
анатомическим пинцетом в стерильный флакон (чашку Петри) или стерильный пластиковый
пакет типа «Вихрь» объемом 100 мл, содержащих 5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Для
десорбции микроорганизмов с филътра флакон встряхивают в течение 10 мин с помощью
шейкера, фильтр внутри пакета типа «Вихрь» растирают вручную в течение 1 мин, фильтр,
помещенный в чашку Петри, разрезают на мелкие куски ножницами инкубируют при
Инструкция по применению «АмплигенСосс/о'/о/с/е^-РВ» Страница 8 из 25
--- стр. 12 ---
Добро пожаловать в детальный мастер тестов!
Тип ротора
7 2 *л >Т10ч м ы й ротор
Сепе-О^зс"** 72
<3епе-015с’” 100
V Кольцо закреплено.
5. Выбирают объем реакционной емеси: Кеаейоп Уо1ите/Объем реакции - 25 мкл. Для
прибора «КоШг-Оепе» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 р1 оИ 1ауег
уо1ите»/«15 рЬ объем маела/воска».
6. Нажимают кнопку «Мех1»/«Далее».
Инструкция по применению «АмплигенСосс/й^/о/й?е5-РВ» Страница 12 из 25
--- стр. 13 ---
Мастер Нового Теста
Профиль
т » № г
Редактор профиля...
Установка канала;
Огееп
УеИоет
I Огапде
В е(^
1 Сг1пп$оп
В1ие
Нажмите эту
кнопку, чтобы
перейти на след,
стр. мастера. Если
это
заблокировано, вы
должны ВЬ]ПОЛНИТЬ
некот. действия на
этой странице
перед
продолжением.
470пт 51 Опт 10
ВЗОпгп 555пт 10
585пт 61 Опт 10
625пт ВВОпт 10
ВВОпт 710Нр 7
365пт 460пт 7
Новый...
Правка...
Уровень Сигн.
Удалить
Отменить
□ пт. уровня сигн..
Выход << Назад Далее»
7. В верхней части окна нажимают кнопку «ЕсИ 1: ргой1е»/«Редактор профиля».
Редактор Профиля
, Ы #
Новый Откр. Сохранить как Справка
Тест продолжится около 132 мин.График внизу представляет тест, который должен бьть выполнен :
Нажмите на цикл ниже, чтобы изменить его ;
1 5 Ш .Ж 1 Й Ж .
Г'.Ч11Я |Г1С .« ^.г
Циклирование
Циклирование 2
Т емпература: 95 1 град.
Время: 15 мин. 0 сек.
Вставить до..
Удалить
8. Задают следующие параметры эксперимента:
Программа амплификации для «АмплигенСосс/<7/ог<7еб'-РВ»
Таблица 3
Номер
этапа Температура, °С Время
экспозиции
Кол-во
циклов
1 95,0 15 мин 1
2 95,0 20 с 555,0 60 с
3
95,0 20 с
4055,0* 60 с детекция
флуоресц. сигнала*
4 10,0 Режим хранения
♦Примечание: детекция флуоресцентного сигнала назначается по каналам для
флуорофоров РАМ/Огееп, КОХ/Огап§е и Су5/Кес1 на втором этапе циклирования.
Инструкция по применению «АмплигенСосс/о'/о/с/е^-РВ» Страница 13 из 25
--- стр. 14 ---
т Редактор Профиля 1 ^ 1 ■ '
н #
Новый Откр. Сохранить как Справка
Тест продолжится около 132 мим. График внизу представляет тест, который должен быть выполнен;
IОбычный шаг
55 град.
60 сек.
Детек на СусНлд А
на бгееп, Огапде, Яеб
Г~ Удлин. Шаг.
Р Снижать темп-ру шага
35 град, на 20 сек.
Нажимают кнопку «ОК»/«Да».
55 град, на 60 сек.
О К
9. В нижней части
0рйгп18аНоп.. .»/«Опт.уровня сигн.».
окна нажимают кнопку «СаИЬга!е»/«Оа1п
Мзстер Нового Теста
Профиль
1ШШИ
Редактор профиля. . . 1
Установка канала;
Имя
Огееп 470пт 51 Опт 10
Уе11о\м 530п|Г| 555пт 10
Огапде 585пт 61 Опт 10
Вес! 625ппт ббОпт 10
Спт$оп бВОпт 710Ир 7
В1ие 365пт 460пт 7
Новый..
Правка...
Уровень Сигн.
^алт’ь
Нажмите эту
кнопку, чтобы
перейти на след,
стр. мастера. Если
■это
заблокировано, вы
должны выполнить
нексгт. действия на
этой странице
перед
продолжением.
Отменить
Опт. уровня сигн..
Выход << Назад Далее»
в открывшемся окне нажимают кнопку «СаИЬга^е Асяи1п炙/«Орйт15е
Ас^и^^^炙/«Опт. детек-мых».
Инструкция по применению «АмплигенСосс/о'/о/^е^'-РВ» Страница 14 из 25
--- стр. 15 ---
Авто-оптимизащ»в уровня сигнала
Оптимизация: ........
При авто-оптимизации уровня сигнала будет считываться Флуоресцектный сигнал
,' выбранной пробирки при различных уровнях усиления сигнала, пока не найдется
Д уровень, при котором сигнал попадает в нужный диапазокУровень сигнала
V зависит от используемых реагентов.
Установитьтемпературу |5ь градусов.
Оптим. всех I Опт. Детек-мых |
\ Выполнить оптимизацию при 1 -м шаге детекции
Г* Выполнить оптимизацию при 56 градусах перед началом теста
Установки канала:
▼ ( Добавить.,
|‘*‘*"****"™"*Р‘— ‘'''"‘1 ^*1 ’П 'Л '‘Гг'“Ут“ГГТ"11"'Г'Т~ГГга"Г.Т-М Т-И "|ГГЖ Г|ТГ"Г7‘М |ГГ - ; , Л | Ч ‘ ‘ У > ‘ Г У — у — I I 111Г I I
Имя I Позиция Пробирки 1 Миним Сигнал | Ма 1;хим. Сигнал ^ Мин. у р о Е Правка..
Удалить ^
I [!= !дзл^ь1[сет
- для красителя РАМ/Сгееп указывают в графе Мт Кеас1т§/Мтгш. Сигнал значение 5, а
в графе Мах КеасИп^/Максим. Сигнал значение 10,
- для красителя КОХ/Огап§е указывают в графе Мт КеасМп^/Миним. Сигнал значение 5,
а в графе Мах КеасМп§/Максим. Сигнал значение 10,
- для красителя Су5/Ке(1 указывают в графе Мт Кеа(Ип§/Миним. Сигнал значение 5, а в
графе Мах КеасИп§/Максим. Сигнал значение 10.
А вто -о п т и м и2 3 Ц 4 * :я уровня сигналэ
Оптимизация:
При авто-оптимизации уровня сигнала будет считываться Флуоресцентный сигнал
выбранной пробирки при различных уровнях усиления сигнала, пока не найдется
^ уровень, при котором сигнал попадает в нужный диапазон. У ровень сигнала
зависит от используемых реагентов.
Установитьтемпературу рВ градусов.
Г
Ус
I И |
Установки Авто-оптимизации уровня сигнала
Установки канала:
Канал; Сгееп Позиция Пробирки:
Нужный диапазон стартового сигнала : |5 Р1 до
Диапазон уровней сигнала; гЮ * до
И
То"
ок Отменить Справка
Закрыть Спр.
В графе ТиЬе розШоп/Позиция Пробирки указан номер пробирки, по которой будет
автоматически выбран параметр «^аш»/«усиление сигнала», по умолчанию это 1-я пробирка в
роторе. Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с какой-либо
исследуемой пробиркой с реакционной смесью.
Помечают галочкой бокс в строке «Рефгт СаИЬгаНоп Ве/оге Г‘ Ас^иш{^оп»/«Реф^т
ОрИтВаНоп Ве/оге Г‘ АсдишВоп»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Закрыть
окно Аи!о Сат СаИЬгаНоп 8еШр/Авто-оптимизация уровня сигнала, нажимают кнопку
«С1о8е»/«Закрыть».
Инструкция по применению «АмплигенСосс/й'/о/с/е^-РВ» Страница 15 из 25
--- стр. 16 ---
Ав*о-оптимизация уровня сигнала
Оптимизация:
При авто-огггимизации уровня сигнала буает считываться Флуоресцентный сигнал
выбранной пробирки при различных уровнях усиления сигнала, пока не найдется
уровень, при котором сигнал попадает в нужный диапазон. Уровень сигнала
зависит от используемых реагентов..1^
Установить температуру |тй градусов.
Оптим. всех 1 Опт, Детек-мых !
V Выполнить оптимизацию при 1 -м шаге детекции
Выполнить оптимизацию при 60 градусах перед началом теста
Установки канала:
Имя Позиция Пробирки ! Миним СигналМаксим. Сигнал1 Мин. чс
Егееп 1 5Р1 10Р1 •10ВеЗ 1 5Р1 10Р1 •10
Огапде 1 5Р1 10Р1 ■10
Добавить,,.
Правка...
валить
Удалить Все :
□ Закрыть Спр.
Нажимают кнопку «МехЪ>/«Далее».
Мастер Н ового Теста
Профиль
Ш |1п|
Редактор профиля,,, |
Установка канала:
(Нажмите эту
(кнопку, чтобы
перейти на след,
стр мастера. Если
это
заблокировано, вы
должны выполнить
некот. действия на
этой странице
перед
продолжением.
ГЙмя ....... Источник 1 Детектор | Уровень сигнала 1 Новый... 1 ^
1 бгееп 470пт 51 Опт 10
— --------1
1 Уе11о1Л' 530пт 555пт 10 Правка... 1
1 Огапде 585пт 61 Опт 10
1 Веб Ьц:!Ьпт ббОпт 10
1 С11т50п 680пт 710Ьр 7 ^алигь
1 В1ие 365пт 460пт 7 -----
! Отменить 1 1
!|^|ГгЕ уровня сигн..
1 1 1
Выход 1 << Назад 1 Далее» |
10. Запускают амплификацию кнопкой « 81аг1 шп»/«Старт». При необходимости
введенные значения термоциклирования могут быть сохранены в качестве шаблона,
используя кнопку « 8ауе 1етр1а1е/ «Сохр. шаблон».
М астер Н о в о го Теста
Установка Значение
Сгееп Уровень сигнала 10> 5 »■ Ш г Огапде Уровень сигнала 10
Уе11о1Л1 Уровень сигнала 10
Оптимизация автоуровня сигнала До первого детектир. данных
Ротор 36-луночный ротор
Компоновка образцов 1,2, 3, ...
Объём реакции (в микролитрах) 25
Проверив правильность установок, нажмите Старт для начала выполнения
Теста. Нажмите Сохр.Шаблон, чтобы сохранить шаблон с программой и
установками этого теста.
С та р т
Сохр. шаблони\
Выход « Назад
Инструкция по применению «АмплигенСосс/с//о/с/е5-РВ» Страница 16 из 25