Набор реагентов для выявления и дифференциации ДНК возбудителей сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkhoderia pseudomallei) методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией "АмплигенBurk-mallei/pseudomallei-РВ" по ТУ 21.20.23-013-01898084-2016 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
...........
^ ;^з
иссл|^|6вй^ , , "-
* ^ А.в.
гой’г.
Волгощадский научно-
ЖИЙ а-, противочумный
ИНСТРУКЦИЯПО ПРИМЕНЕНИЮ*
«НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ДНК
ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА (ВиККНОЮЕША МЛЫЕ1) И МЕЛИОИДОЗА
(ВЕККНОЕВЕША РБЕЕВОМАЕЕЕ!) МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ
^,р,ШПАШЕШЕКК-МАЕЕЕ1/Р8ЕЕВОМАЫЕ1-?Ъ» ПО ТУ 21.20.23-013-01898084-2016»
Шаб^^рт^генто™ выявления и дифференциации ДНК вдзбудителей сапа {ВигкНоШегш
таИеГ^ мелиоидоза (ВигкНоШеПа р.еиМ Ш ) методом мультиплексной
цепной реакции с флуоресцентной детекцией <<Амплиген5иг^-та//е./д5еы^ота/М^^^^
21 20 23-013-01898084-2016», далее по тексту - набор реагентов «Амплиген21п
таПеирзеиВотаИег-ВШ предназначен для качественного обнаружения и
ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза в пробах клинического материала (кровь, моча,
спинномозговая жидкость, содержимое абсцессов, мокрота, рвотные массы, отделяемое язв
экссудаты нунктаты из лимфатических узлов, мазок из носоглотки, иснражнения,
секционного материала (биоптаты печени, селезенки, легкого, сердца, почки, головной мозг)
б и о л о г и ™ материка от животных (сердце, печень, легкое, селезенка, почки, головной
мозг костный мозг, кровь), объектов окружающей среды (вода, почва), твердых пище
проектов (рис), а также выделенных культур микроорганизмов методом мультиплексной
п^имеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
^^^'’ оТбудетеГГ''^^^^^ {ВигкИоШепа таПег) и возбудитель мелиоидоза {ВигкНоШегш
рзеиВотаНег) - аэробные грамотрицательные неферментирующие бактерии, принадлежащие
к роду ВигкИоШепа, относятся к микроорганизмам II группы патогенности (опасност ).
Сапная и мелиоидозная инфекции у людей имеют сходные клинические проявления. ^
Сап - зоонозная инфекция, протекающая у человека в острой септической и
хронической формах со специфическими поражениями кожи, слизистых оболочек, мьппц,
Х а в о в и внутренних органов. Источником инфекции для людей служат животнью
окшно лощад^ ^Заражение происходит через выделения больного животного, носовой
секрет и отделяемое кожных язв, реже содержимое кищечника, моча, молоко. Основно
механизм заражения контактный, возбудитель попадает в организм человека через кожу,
значительно реже через слизистые оболочки верхних дыхательных путей и конъюнктиву
'""^Мелиоидоз - инфекционное заболевание людей и животных, протекающее с явлениями
сепсиса и образованием абсцессов в органах и тканях, эндемичен для ряда стран влажных
суб?роГков Инфицированные животные, выделяя возбудителя с естественными
ж С Г Г и 'и э Л « о м раневых поверхностей, обсеменяют
Основной механизм заражения человека - контактный, реализуется при контакте
поврежденной кожи или слизистых оболочек с инфицированными почвой и водой.
Набор реагентов «АмппяттВигк-та1Ш/рзеис1ота11е1-?В» используется в клиничес
лабораторной диагностике для исследования материала, полученного от лиц обоего пола
любого возраста с подозрением на сап и/или мелиоидоз вне зависимости от формы « «^ичия
манифестации заболевания (в анамнезе находивщихся на эндемичных территориях по сапу
ШструкциГпо'^прим^ «АмпяягенВигк-та1Ш/рзеис1ота1Ш-РВ>^ Страница 1 из 26
--- стр. 2 ---
мелиоидозу), а также в ходе эпидемиологического мониторинга.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ
Для проведения исследований могут быть использованы амплификаторы для ПЦР с
учетом результатов в режиме реального времени типа КоШг-Оепе. ^г
Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора входят 8 реагентов:
Таблица 1
Реактив Описание Объем
(мл)
Количество
ПЦР-смесь-1
В. таИег/рзеиВотаНег
смесь праймеров, зондов, дНТФ -
прозрачная жидкость с бледно-
розовым оттенком
0,3 1 пробирка
ПЦР-буфер-2 прозрачная бесцветная жидкость 0,3 1 пробирка
Та^'/^-ДИК-полимераза прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой фермент с
активностью 5 ед/мкл
0,03 1 пробирка
м§сь прозрачная бесцветная жидкоеть,
представляющая собой 25 мМ
водный раствор магния хлорида
0,15, 1 пробирка
ПКО ДНК
в. та1Ш
препарат ДНК В. таНег -
прозрачная бесцветная жидкость 0,1 1 пробирка
ПКО ДНК
В. рзеиВотаНег
препарат ДНК В. р8еис1ота11е1 —
прозрачная бесцветная жидкость 0,1 1 пробирка
ВКО прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой раствор
ДНК (фрагмент последовательности
плазмиды рПС19) в ТЕ-буфере
0,08 1 пробирка
ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая трис-НС1, Наг-ЭДТА 1,0 1 пробирка
Набор реагентов «АмпяитеяВигк-та11еИр5еис1ота11е1-РВ» рассчитан на проведение 50
определений с учетом контрольных образцов.
Принцип метода - обнаружение специфических фрагментов ДНК сапного и
мелиоидозного микробов основано на использовании мультиплексной полимеразной цепной
реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Метод
полимеразной цепной реакции (ПЦР) - представляет собой повторяющиеся циклы синтеза -
амплификации специфической области ДНК-мишени в присутствии Тац-Р полимеразы,
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, буферного раствора и олигонуклеотидных праймеров,
распознающих ДНК-мишень. При постановке ПЦР применяется «горячий старт»,
обеспечивающийся использованием химически модифицированной 7п^-полимеразы — Та^Р-
ДНК-полимеразы, которая активируется при прогреве реакционной смеси при 95 °С в
течение 15 мин, что значительно снижает количество не специфических реакций.
Детекция результатов осуществляется путем измерения интенсивности
флуоресцентных сигналов непосредственно в процессе ПЦР в режиме реального времени
(ПЦР-РВ). По каналу РАМ/Сгееп детектируется продукт амплификации ДНК В. та1Ш,
соответствующий нуклеотидной последовательности гена ^ИР В. таНег, кодирующего белок
биосинтеза флагеллина - /1а§е11аг Ыозуп1кеНс рго1ет /ИР, имеющий вставку,
фланкированную 15407А. По каналу АОЕ/Уе11ом> детектируется продукт амплификации
фрагмента ДНК возбудителя мелиоидоза В. рзеийотаНег, соответствующего нуклеотидной
последовательности гена, кодирующей белок §р6^ и входящий в состав ШтВ региона
(ацетилтрансферазы, включающие П-ацетилазы рибосомальных белков). По каналу СуЗ/Кеё
Инструкция по применению <(.АмпяягенВигк-та11е1/рзеис1ота11е1-РВ'» Страница 2 из 26
--- стр. 3 ---
детектируется продукт амплификации ВКО (внутреннего контрольного образца).
Проведение анализа включает два этапа: 1. выделение ДНК из проб клиничеекого и
биологического материала, объектов окружающей среды 2. амплификация на приборах типа
КоЮг-Оепе. Тип используемых зондов - «молекулярные маяки». Область «петли» зон^; 1а
комплементарна анализируемому продукту ПЦР. В ходе реакции происходит гибридизация
молекулярного маяка с ампликоном и расстояние между флуорофором и гасителем
увеличивается, что приводит к повышению флуоресценции, которую фиксирует
амплификатор. Учет результатов флуоресценции проводят по каждому каналу отдельно.
Ограничение метода. В инфицированном материале В. таНег и В. р^еийотаНег может
быть не обнаружена по причине ингибирования ПЦР-РВ и/или недостаточной
эффективности выделения ДНК. Для достижения показателей аналитической
чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность
выделения нуклеиновых кислот на уровне не менее 20%. Ложноотрицательный результат
выявляется с помощью внутреннего контрольного образца (ВКО) (п. 7.4.5).
Причиной получения ложноположительного результата является контаминация на
этапе выделения ДНК или на этапе проведения реакции ПЦР в режиме реального времени.
Ложноположительный результат выявляется с помощью отрицательных контрольных
образцов выделения и ПЦР-РВ (ОКВ и Кпцр-) (п. 7.4.5).
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗДЕЛИЯ
Аналитическая чувствительность.
Набор должен выявлять и дифференцировать ДНК В. та11е1 и В. р5еис{ота11е1 в
суспензиях с концентрацией не менее 1x10^ м.к./мл
Аналитическая специфичность.
Набор не должен давать положительных результатов с ДНК гетерологичных видов
микроорганизмов в суспензиях с концентрацией 1x10’ м.к./мл.
Диагностические характеристики.
Диагностические характеристики набора установлены в лабораторных условиях с
применением 14 штаммов В. таИег, 16 штаммов В. р5еис1ота11е1 и 20 штаммов
гетерологичных микроорганизмов из лаборатории коллекционных штаммов
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
на модельных образцах материала: 160 проб бактериальных суспензий возбудителей сапа
(В.та1Ш) и мелиоидоза (В. рзеЫотаНег) в концентрации 1x10^ м.к./мл, 72 пробы
клинического материала, искусственно контаминированных В. т па11в1, В. р$еис1отпа11е1 в
концентрации 1хЮ^ м.к./мл, 12 проб секционного материала, искусственно
контаминированных В. таПе!, В. р5еис1ота11ег в концентрации 1x10^ м.к./мл, 44 пробы
биологического материала, контаминированных В. таНег, В. р5еис1ота1Ш в концентрации
1x10^ м.к./мл, 16 проб объектов окружающей среды (почва, вода), контаминированных
В. таНег, В. р8еи(Лота11е1 в концентрации 1x10^ м.к./мл, 8 проб твердых пищевых продуктов
(рис), контаминированных В. та1Ш, В. р^еис^отаНег в концентрации 1x10^ м.к./мл; 184
пробы, контаминированных близкородственными и гетерологичными микроорганизмами
{ВигккоШепа 1каИапс!еп515, ВигккоШепа серааа, ПЬпо скокгае, РгапсшИа Ш1агетк, Уешта
резИз, ВасШш апГкгаск, Рзеис1отопа5 аеги^тош, Рзеиёотопаз рШШа, 5Шрку1ососсш аигеиз,
Е^скегкЫа сок) в концентрации 1x10’ м.к./мл.
Определение возбудителей сапа (В. та11е1) и мелиоидоза (В. рзеикотаНеГ),
близкородственных и гетерологичных микроорганизмов подтверждено с использованием
референтного метода — молекулярно-генетического с использованием МИ «Набор реагентов
для выявления и идентификации ДНК возбудителей бруцеллеза, сапа и мелиоидоза методом
полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Бру/сап/мелиоидоз-РВ) по
ТУ 939816-017-46395995-2013», производства ЗАО «Синтол», Россия.
Диагностическая чувствительность - не менее 98 % с доверительной вероятностью
90% при анализе 312 положительных проб (160 проб суспензий микроорганизмов, 72 пробы
Инструкция по применению «АмплигенбмгА:-/иа//е//р.?еи(/оота//е/-РВ» Страница 3 из 26
--- стр. 4 ---
♦ к
клинического материала, 12 проб секциондого материала, 44 пробы биологического
материала, 16 проб объектов окружаюпдей среды, 8 проб твердых пищевых продуктов),
содержащих возбудителей сапа (В. таНег) и мелиоидоза (В. риеис1ота11е1) в концентрации
1x10^ м.к./мл получен положительный результат в 309 случаях.
Диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90%
при исследовании 184 отрицательных проб (108 проб суспензий микроорганизмов, 36 проб
клинического материала, 6 проб секционного материала, 22 проб биологического материала,
8 проб объектов окружающей среды, 4 проб твердых пищевых продуктов), содержащих
близкородственные и гетерологичные микроорганизмы {ВигкНоЫепа ^На^^апс^епш,
ВигкИоЫепа сераЫа, УгЪпо сШегае, РгапазеИа Ш1агеп818, Уегзша резИз, ВасШш аШкгааз,
Р8еис1отопа8 аеги§то8а, Р8еис1отопа8 риМа, 81арку1ососст аигеы8, Е8скепсЫа соИ) в
концентрации 1хЮ’ м.к./мл получен отрицательный ответ в 184 случаях.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ
4.1. Информация об инфекционных или микробных рщ^ках
Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на
деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и
животных ЫУ групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеющих
санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами 1-1У
групп патогенности.
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, поэтому
этапы подготовки образцов и проведение ПЦР-анализа проводят в соответствии с
требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп
патогенности», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы
МУ групп патогенности», МУ 4.2.2831-11 «Лабораторная диагностика сапа», МУ 4.2.2787-10
«Лабораторная диагностика мелиоидоза».
4.2. Необходимость обучения персонала
Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним
медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие соответствующие курсы
специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными
биологическими агентами (ПБА) 1-11 групп патогенности.
4.3. Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными,
вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует
соблюдать обычные меры предосторожности для лабораторий:
- пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные халаты;
- не принимать пищу, пить или курить в лабораторных помещениях;
- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них
компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов
набора реагентов за медицинской помощью следует обратиться немедленно.
4.4. Информация об экологических рисках
Уничтожение неиспользованных компонентов набора или серий с истекшим сроком
годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10.
4.5. Информация о физических рисках, в том числе возможность взрыва или
возгорания.
Набор реагентов следует применять по назначению в комбинации с приборами,
прошедшими надлежащее техническое обслуживание. Необходимо строгое соблюдение
инструкций по эксплуатации электрооборудования, безопасности при работе с
электроприборами.
Инструкция по применению «.АмпшгенВигк-та11е1/р5еис1ота11е1-РВ» Страница 4 из 26
--- стр. 5 ---
4.6. Информация о рисках применения^ приводящих к ошибочному результату
исследования:
- Использование набора реагентов «Аиш^ш'тВи^к-та^^е^/рзеис^ота^^е^-VВ» с истекшим
сроком годности;
- Нарушение условий транспортирования, хранения набора реагентов;
- Нарушения упаковки и внешнего вида компонентов набора реагентов;
- Нарушение условий транспортирования, хранения и подготовки проб;
- Нарушение условий окружаюшей среды при эксплуатации набора реагентов;
- Нарушение процесса проведения анализа, регистрации и учета результатов.
- Применение по назначению МИ в комбинации со средствами измерения, не прошедшими
поверку и/или калибровку.
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, необходимые при работе с изделием
Таблица 2
Наименование Основные характеристики или обозначения
документации, производитель
Амплификатор типа КоШг-Оепе Амплификаторы «Ко1ог-Оепе 6000» (СогЬей
Кезеагсй, Австралия), «Ко1огОепе ^»,
(«01АОЕХ», Германия)
Ламинарный-потоковый шкаф II класса
биологической безопасности
Ламинарно-потоковый шкаф II класса
биологической безопасности Вхошгагё 81ап(1аг(1
ОГ- 130, Кр]а1г, Финляндия
ПЦР-бокс Бокс абактериальной воздушной среды для
работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при
проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С» «Ламинарные системы», Россия
Микроцентрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-вортекс «М1сго8р1п РУ-2400»,
НПФ ООО «В1о8ап», Латвия
Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С,
«ТЕРМО 48», «Биоком», Россия
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения от 4 до 120 °С, «Биоком», Россия
Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга «М1п1-8рш», «ЕррепбогР»,
Германия
Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский «В-40», «Висма
Планар» Беларусь
Холодильник «МРК.-214Р» рабочий диапазон температур
основная камера от +2 до +14 °С, морозильная
камера -20-30 °С, 220В, 155 Вт, «8апуо», Япония
Дозатор 0,5-10 мкл 1Е8 (САРР), Дания
Дозатор 5-50 мкл 1Е8 (САРР), Дания
Дозатор 20-200 мкл 1Г8 (САРР), Дания
Дозатор 100-1000 мкл 1Е8 (САРР), Дания
Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов универсальная
на 5 дозаторов, «Хеликон», Россия
96-ти луночный алюминиевый штатив
(для пробирок 0,2 мл)
«СогЬей КезеагсЬ», Австралия;
«01АОЕП», Германия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 1,5 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок на
1,5 мл, 5x10 мест с увеличенным расстоянием
между лунками, «Интерлабсервис», Россия
Инструкция по применению «АмпшгенВигк-та11еИр^еис1ота11е1-РВ» Страница 5 из 26
--- стр. 6 ---
Одноразовые наконечники с фильтром
до 10 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 20 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху@еп», США
С
Одноразовые наконечники с фильтром
до 100 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еш>, США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 200 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Ахуё'еп», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 1000 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Микроцентрифужные пробирки
объемом 1,5 мл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Микроцентрифужные пробирки для
ПЦР объемом 0,6 мл.
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с
плоской крышкой
ФСЗ 2012/11892 <^Ахуёеп», США
Пестик для пробирок типа ЕррепбогГ
1,5-2,0 мл
ФСЗ 2011/10287, «881», США
Ступка фарфоровая (№1) ГОСТ 9147-80
Пестик фарфоровый (№1) ГОСТ 9147-80
Порошок стеклянный марки ПСЗО ГОСТ Р 52233-2004
Комплект реагентов для экстракции
РНК/ДНК из клинического материала
«РИБО-преп» по ТУ 9398-071-1897593-
2008
ФСР 2008/03147, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора, Росеия
Комплект реагентов для выделения ДНК
из клинического материала «ДНК-сорб-
В»
ФСР 2009/05220, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора, Росеия
Одежда одноразовая медицинская из
нетканого и полимерного материалов
РЗН 2013/668
Перчатки медицинекие диагностические
одноразовые. Частъ 1. Спецификация на
перчатки из каучукового латекса или
раствора
ГОСТ Р 52239-2004
Спирт этиловый ректификованный из
пишевого сырья
ГОСТ 5962-2013
Натрий хлористый ГОСТ 4233-77
* Примечание; допускается применение оборудования другого типа, по своим
характеристикам не уступающего рекомендуемому
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ
Материалом для исследований в соответствии с МУ 4.2.2831-11 «Лабораторная
диагностика сапа», МУ 4.2.2787-10 «Лабораторная диагностика мелиоидоза» служат:
- пробы из суспензий выделенных культур возбудителей сапа и мелиоидоза или
подозрительных изолятов;
клинического (биологического) материала:
- на мелиоидоз - кровь, моча, спинномозговая жидкость, содержимое абсцессов, мокрота,
рвотные массы, отделяемое язв, экссудаты, пунктаты из лимфатических узлов, мазок из
носоглотки, испражнения, секционный материал (биоптаты печени, селезенки, легкого,
сердца, почек, головного мозга), биологический материал от животных - кусочки органов
трупов - сердце, печень, легкое, селезенка, почки, головной мозг, а также костный мозг.
Инструкция по применению (.<Кыпшт\Вигк-та11е1/рзеиёота11е1-?Ъ'» Страница 6 из 26
--- стр. 7 ---
кровь. > * -
- на сап - кровь, моча, спинномозговая жидкость, содержимое абсцессов, мокрота, рвотные
массы, отделяемое язв, экссудаты, пунктаты из лимфатических узлов, мазок из
носоглотки, испражнения, секционный материал (биоптаты печени, селезенки, легкорр,
сердца, почек, головного мозга), биологический материал от животных - кусочки органов
трупов - сердце, цечень, легкое, селезенка, почки, головной мозг, костный мозг, кровь.
- пробы из объектов окружающей среды: вода, почва.
- пробы пищевых продуктов: твердые пищевые продукты (рис).
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично
завинчивающимися крышками в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность
работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и
транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09
«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых
кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1V групп патогенности».
Транспортирование материала в лабораторию для, исследований проводят при
температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036-95
«Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-1У групп
патогенности». После проведения предварительной обработки проб допускается их
транспортировка при температуре от минус 16 °С до минус 20 °С в течение 7 суток или в
сосуде Дьюара с жидким азотом - длительно.
7. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
7Л. Подготовка исследуемых образцов
7ЛЛ. Подготовка проб выделенных культур микроорганизмов
Колонии с плотной питательной среды, подозрительные на возбудителей сапа и
мелиоидоза (не более 1-2 колоний), суспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида в
микропробирке объемом 1,5 мл. Из чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза готовят
суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу
мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (ЮМЕ)), что соответствует
м.к./мл для В. та11е1, В. рзеиВотаИег. Затем проводят 10-кратные разведения подготовленных
суспензий в 0,9 % растворе натрия хлористого до конечной концентрации 1x10^ м.к./мл. Для
исследования в отдельную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают суспезии клеток чистой
культуры в количестве 100 мкл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и
выделения ДНК (пп. 7.2, 7.3).
7.1.2. Подготовка проб клинического (биологического) материала
Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл с помощью одноразовой
иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специальной вакуумной системы типа «Уасией» с ЭДТА или
цитратом натрия, или стерильным шприцем в стерильные стеклянные или пластиковые
пробирки с цитратом натрия (3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Аккуратно
перемешивают покачиванием до полного смешивания с антикоагулянтом. После
центрифугирования отбирают лейкоцитарное кольцо вместе с плазмой. Хранят плазму крови
при температуре от 2 °С до 8 °С не более 3 сут при температуре не выше минус 16 °С - в
течение 1 месяца, при температуре не выше минус 68 °С — в течение 1 года. Допускается
только однократное замораживание-оттаивание материала. При замораживании клинического
материала его транспортировка должна проводиться также в замороженном состоянии. Для
исследования в отдельную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают пробу в количестве 100
мкл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пп. 7.2, 7.3).
Моча. При исследовании мочи собирают ее среднюю порцию (10-20 мл) в
специальный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой. Переносят 1 мл мочи,
используя наконечник с фильтром, в стерильные одноразовые пробирки объемом 1,5 мл.
Центрифугируют в течение!0 мин при 10000 об/мин, полностью удаляют супернатант, не
Инструкция по применению <<АмплигенВигк-та11е1/р5еис1ота11е1-РВ» Страница 7 из 26
--- стр. 8 ---
захватывая осадок. Осадок ресуспендируют ь 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида,
тщательно перемешивают содержимое на вортексе. Затем выполняют этапы обеззараживания
материала и выделения ДНК (пн. 7.2, 7.3).
Спинномозговую жидкость отбирают после пункции поясничной, субокципитальн(»)й
области или мозговых желудочков с помощью одноразовых игл, в одноразовые пластиковые
сухие пробирки объемом 2,0 мл в количестве не менее 1,0 мл. Пробирку плотно закрывают
крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части крышки. Для исследования в
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают 100 мкл клинического материала. Для
концентрирования клеток 1,0 мл спинномозговой жидкости центрифугируют в течение 10
мин при 10000 об/мин и исследуют осадок и 100 мкл надосадочной жидкости. Затем
выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пн. 7.2, 7.3).
Для взятия содержимого абсцессов с поверхности раны удаляют поверхностный
экссудат салфеткой, смоченной стерильным физиологическим раствором или 70 % спиртом.
После дезинфекции поверхности раны и высыхания дезинфектанта с помощью шприца
отбирают аспират из глубины раны. Если первоначально аспират взять не удалось, подкожно
вводят стерильный физиологический раствор и повторно пытаются взять аспират.
Отсасывают содержимое и переносят в стерильную пробирку объемом 1,5 мл с крышкой.
Для исследования в отделъную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают 100 мкл
клинического материала. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения
ДНК (пп. 7.2, 7.3).
Мокроту забирают в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные
стерильные флаконы с широким горлом и завинчиваюшимися крышками объемом не менее
50 мл. Для разжижения мокроты применяют либо приготовленную ех Щтроге смесъ НАЕС
(Н-ацетил-Е-цистеина 0,25 г, 25 мл 4 % раствора КаОН, 25 мл 0,1 М тризамещенного натрия
цитрата), либо раствор «Муколизин» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия), (Ма2НР04
0,0774 М, МаН2Р04 0,0226 М, бетаМЭ 0,094 М, 5 % азид натрия в конечной концентрации
0,05 %). Пробу объемом 1-2 мл смешивают либо с равным объемом смеси МАЕС, либо с
пятикратным объемом раствора «Муколизин». Пробы со смесъю ЫАЕС перемешивают
покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 15 мин, периодически встряхивая.
Затем разводят 0,067 М фосфатным буфером (рН 6,8) до конечного объема 50 мл. Пробу
центрифугируют в течение 10 мин при 9000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 %
раствора натрия хлорида. Пробы с раствором «Муколизин» перемешивают покачиванием в
течение 20-30 с и инкубируют в течение 20-30 мин, периодически встряхивая. Затем
отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в микроцентрифужную пробирку объемом
1,5 мл с завинчивающейся крышкой и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 10 мин.
Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы
обеззараживания материала и выделения ДНК (пп. 7.2, 7.3).
Рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в стерилъную посуду ложками или
автоматической пипеткой переменного объема. Дальнейшую подготовку проводят так же как
при исследовании жидких испражнений. Затем выполняют этапы обеззараживания материала
и выделения ДНК (пп. 7.2, 7.3).
Отделяемое язв, экссудаты, пунктаты из лимфатических узлов, берут шприцем
емкостью не менее 5 мл. Кожу на участке, намеченном для прокола, обрабатывают 70 %
спиртом, а затем смазывают 5 % раствором йода и вновь протирают 70 % спиртом. У язв
пунктируют плотный край. Материал переносят в отдельную микропробирку объемом 1,5
мл. Для исследования в отделъную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают 100 мкл
клинического материала. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения
ДНК.Для концентрирования клеток 1,0 мл экссудата центрифугируют в течение 10 мин при
10000 об/мин и исследуют осадок и 100 мкл надосадочной жидкости. Затем выполняют
этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пп. 7.2, 7.3).
Взятие мазка из носоглотки проводят натощак или не ранее, чем через 2-4 часа
Инструкция по применению «АмппттВигк-та11е1/р8еи(1ота11е1-?Ъу> Страница 8 из 26
--- стр. 13 ---
^ К о Ь г -СеТе 6 000 5ег!« КоЙшаге - Тест 2016 -0 9 -27 (1)
Файл Анализ Стзрт/стоп Увосень сигнала Пвосмстр Окне >.пр.
/ У ^
Новый Откр. Сохр Старт П
Справка
; Просмотр #
Установки
Каналы
2. В открывшемся окне выбирают меню «Ас1уапсес1»/«Детальный мастер» Нажимают
кнопку «Мет>/«Новый».
быстрый мастер ^1етальный мастер |
Г Пустой шаблон
I ! Т рехшаговый цикл и плавление
; : Двухшаговы^ цикл
'4 ^нвм'"
'1 .-^\ I ^ Д ругие файлы
I Т ехническое обслужиеание прибора
Г.к ч[ В ш к Ь П
! С е Н Р У -П .
С С Н Р V
Е В 0 У 2 в 1 г е -Р 1 2 0 1 6 -0 5 -0 4
Импортирует
циклирование н
аетектирое. сигнала
и опреаелекие
обраацов из
послеанего
откры того теста.
ы ® ы й Н |;
Отменить
С п р .
15' П о ка за ть э та гэкр а н п р и за п у с ке п р о гр а м м ы
3. Выбирают тип ротора «З6-Ше11 Ко^ог»!«36-луночный ротор». Ставят отметку в окне
рядом с надписью «Мо ОотесЗ 0.2 т1 ТиЪез»!«Ьоскт^ пп^ аРасНесЫ«Кольцо закреплено».
4. Нажимают кнопку «МехЫ«Далее».
Мастер Нового Теста
Добро пожаловать в детальный мастер тестов!
Т и п ротора .......
72*лумоиный р отор
С е пе -Э (« ” ' 72
С « теО |$ с'’ ' 1 0 0
\>/ Кольцо закреплено.
* К , ТЛ Т1Ш ,
5. Выбирают объем реакционной смеси: «КеасРоп уо1ите»1 «Объем реакции» - 25 мкл.
Инструкция по применению «Ампт\генВигк-та11е1/рзеийота11е1-РВ» Страница 13 из 26
--- стр. 14 ---
Для прибора «К.о1ог-Оепе» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «75 /// оИ 1ауег
уо1ите»/«15 {лЬ объем масла/воска».
Мастер Нового Теста
Этот э к р а н отображ ает см еш анны е опции д л я э то го т е с та Заполните
поля, н а ж м и те След., ко гд а вы го то вы перейти на след, стр.
Выход
] О бъём
реа кц ии (иС):
К ом по но вка
р ' 15ц1 с добав. в о с ка
<< Н а за д ] Д а л е е »
Д а н н а я о бласть
предназначена для
отображ ения
спр а вки
эл ем ен то в
мастера. Д ля
с п р а в ки по это й
тем е проведите
мы ш ь над это й
темсиЧ В ы м ож ете
т а к ж е на ж ать на
раскр ы ва ю щ и йся
с п и с о к для
отображ ения
с п р а в ки о
возм о ж ны х
установках.
6. Нажимают кнопку «МехЫ«Далее».
У -^
Мастер Н(»ого Теаа
Проф иль
Р едактор п р о ф и л я ..
У с т а н о в ка к а н а л а ;
И м я 1 И сточ ни к 1 Д е те кт о р У р ов ен ь сигнала |
Сгееп 4 7 0 п т 51 О пт 8
УеНом бЗОпгл 5 5 5 п т 6,67
0 га1эде 5 8 5 п т б Ю п т 5
В еб 6 2 5 п т БбО пт 5
СГ1ГП$0П 680пгп 710Ир 7
В1ие 3 6 5 п т 40О пт 7
Оггт. уровня сигн.
Выход 1 « Н а за д 1 Д а л е е » |
Новый...
П р а в ка ..
Удалить
О тм енить
Д а н н а я область
предназначена для
отображ ения
спр а вки
элем ентов
м а с т е р а Д л я
спр а вки по это й
те м е проведите
мы ш ь над это й
тем ой. В ы м ож ете
т а к ж е на ж ать на
р аскры ваю щ ийся
:СПИСОКДЛЯ
отображ ения
с пр а вки о
возм ож ны х
установках.
У р о в е н ь Сигн.
7. В верхней чаети окна нажимают кнопку «ЕМ рго/г1е»/«Редактор профшя».
Редактор Профиля
€ ■ '7 Ы #
Новый Откр. Сохранить как Справка
Тест продолжится около 38 мин.График внизу представляет тест, который должен быть выполнен :
Нажмите на цикл ниже, чтобы изменить его ;
ГЦиклирование
Циклирование 2
Температура:
Время;
Град,
мин. о
^ Вст. после...
Вставить до... I
Удалить I
8. Задают следующие параметры эксперимента (Таблица 4):
Инструкция по применению «кмпшге\\Вигк-та1Ш/р8еиёота1Ш-?Ш Страница 14 из 26
--- стр. 15 ---
Таблица 4
Цикл Температура, °С Время Измерение
флуоресценции
Количество
циклов
1 95 15 мин - 1
2 95 Юс - 5
62 35 с -
3
95 Юс -
40
62 35 с
РАМ/Сгееп,
^ОЕ/Vе11о\V,
Су5/Ке(1
1
Флуоресценцию измеряют при 62°С (во втором блоке циклирования) по каналам
РАМ/Сгееп, ЛОЕ/Уе11олу, Суб/КеЛ
Редактор Про4«<л«
Н о в ы й О т к р . С о х р в н и т ь г л к С п р а в к а
Т е ст п ро д ол ж и тся о ко л о 9 8 м и м Т р а Ф и к в н и з у п р е д с твв л яе т т е с т , к о т о р ы й д о л ж е н б ы ть в ы п о л н е н :
111
; Н а ж м ит е н а ц и к л н и ж е, тго б ы и з м е н и т ь е го
■ У д е р ж т е м п ры
Ц икл и ро еа ни е
■ :
б е т п о с л е .
В с т а в и т ь до..
У д ал ить
Ц и к л п ов тор и ть 40 ^ р а з
Н а ж м и т е н а ш а г в н и зу д л я е го и з м е н е н и я и л и н а ж м и т е ♦ ш а г и.I ■ ш « ', чтобы д о б а в и т ь и л и уд ал ить ш а г и з т о г о ц икл а.
ы ч н ы й ш аг
6 2 град.
35 с ек.
Д е т е к на Сус11пд А
н а б тее п. Неб. Уево>л
’ У длин. Ш аг.
С н иж а ть т е м п-р у ш ага
95 гра д , н а 10 сек.
\
6 2 гра д , н а 35 сек.
ТП!
/
/ I
Нажимают кнопку «ОК»/«Да».
9. В нижней части
ОрИтгшИоп... »/«Опт.уровня сигн.».
окна нажимают кнопку «СаНЬга{е»/«Сат
Мастер Нового
р е д а кт о р п ро ф ил я ...
У ста н о в ка к а н а л а :
И м я И сточ н и к Д е т е кт о р У р о ве н ь с ы п а л а 1 Ц оеый... {
Ссееп 4 7 0 п т 51 О пт 8 П г т п г т 1
У е Ь ч 5 3 0 п т 5 5 5 п т 6.67
Отапде 5 8 5 п т 61 О пт 5 У р о ве н ь С и т .
В еб 625ГШТ б $ 0 п т 5
С|1т$оп 680УП 7101тр 7 У д ал ить 1
В1ие 3 $ 5 п т 4 6 0 п т 7 О тм е ни ть 1
■Данная область
'Предназначена д л я
(Отображения
] справки
эл ем ентов
.м астера. Д л я
^справки по этой
Н е м в проведите
■ м ы ш ь н ш это й
т е м о й , б ы м ожете
т а к ж е на ж ать на
■ раскрываю щ ийся
(СЛИСОК д л я
отображения
с пр ав ки о
в озм ож ны х
установках.
йгтг. д а ю внясип 1 ..(
В открывшемся окне нажимают кнопку «СаИЬга(е Асдшгш§»/«Ор{1п718е Асди1гш§»/
«Опт. детек-мых».
Инструкция по применению «АмитгенВигк-та11е1/р5еис1ота11е1-РВ» Страница 15 из 26
--- стр. 16 ---
Авто-огттимиглци.» ур овня сигнала
О птимизация:
При авто-оптимизации доовня сигнала будет считываться Флуоресцентный сигнал
выбранной проб|фжн при различных уровнях усиления сигнала, пока не найпется
#
уровень, при котором сигнал попадает в нужный диапазон-Уровень сигнала
зависит от используемых реагентов.
Установить температуру |’*< ^ “ Н градусов.
Оптим. всех I Опт. Детек-мых 1
^ Выполнить оптим из^ш ю при 1-м шаге детекции
Г * Выполнить оптимизацию при 56 градусах перед началом теста
Установки кан ал а :
Добавить...
Имя I Позиция Пробирки [ М инин Сигнал | М а кси м Снгмая | Мим, доое Правка...
Удалить I
Закрыть
- для красителя РАМ/Сгееп указывают в графе «Мш КеасИщ»/ «Митт. Сигнал»
значение 5, а в графе «Мах Кеа(И炙/«Максим. Сигнал» значение 10,
- для красителя ^ОЕ/Vе11о\V указывают в графе «Мт КеасИ炙/ «Миним. Сигнал»
значение 5, а в графе «Мах КеасИ炙/«Максим. Сигнал» значение 10,
- для красителя Су5/Ке0 указывают в графе «Мш КсасИ炙/ «Миним. Сигнал»гятшш 5,
а в графе «Мах Кса(И炙/«Максим. Сигнал» значение 10.
Авто-оп-тмизвция уровня сигнала '1 2 '
О птимизация
При авто-оптимизации уровня с и гн а л а будет счи ты ваться ф луоресцентны й сигнал
вы бранной п р об ирки при различны х уровнях усилегм я си гна ла , п о ка не найдется
уровень, при ко то р о м с и гн а л попадает в нуж ны й д и ап азон .У ро ве нь сигнала
зави сит от и спол ьзуем ы х реагентов.
У стано вить тем пературу | ■ градусов.
Г
У ^
[ Р е
Г * “
Г и|с1
У с т а н о в ки А в'^о -о пти м и ззи > ^и у р о в н я с и гн а л а
У стано в ки канала
К а н а л : Реб П о зи ц и я П р о б и р ки ; |1 ‘ }
Н уж ны й ди ап азон с тар то во го с и гн а л а : 1 ^ ^ * "
рш д о |Т о "т!
I О тм енить ! С правка
Д и а па зон уровней сигнала:
ОК
Р
З акр ы ть Спр.
В графе «ТиЪс ро8Шоп»/«Позиция Пробирки» указан номер пробирки, по которой будет
автоматически выбран параметр «^а/п»/«усиление сигнала», по умолчанию это 1-я пробирка в
роторе. Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с какой-либо
исследуемой пробиркой с реакционной смесью.
Помечают галочкой бокс в строке «Рсг/огт СаИЬгаНоп Вс/огс Г‘ Ас^иш^юп»/«Рс^/о^т
ОрйтгшНоп Вс/огс Г‘ Ас^иш{^оп»/«Выполнить оптимизацию при 1-м илагс детекции». Закрыть
окно «Аи(о Оат СаИЬгаВоп 8еШр»/«Авто-оптимизация уровня сигнала», нажимают кнопку
«С1озе»/«Закрыть».
Инструкция по применению (.{/КиплшенВигк-та11е1/р5еис1ота1Ш-?Ъ» Страница 16 из 26
--- стр. 17 ---
Авто-оптимизация уровня сигнала
Оптимизация: -------------
При авто-оптимизации уровня сигнала будет считываться флуоресцентный сигнал
выбранной пробирки при различных уровнях усиления сигнала, пока не найдется
V ^ уровень, при котором сигнал попадает в нужный диапазон.Уровень сигнала
зависит от используемых реагентов.
Установить температуру рЖ ^ градусов.
Опгим. всех Опт. Детек-мых ;
V Выполн^•п■ь оптимизацию при 1 -м шаге детекции
Г ” Выполнить оптимизацию при 56 градусах перед началом теста
Установки канала:
Имя Позиция Пробирки Миним Сигнал Максим. Сигнал Мин. 9р<;
Сгееп 1 5Р1 10Р1 ■10
Уе11о'/|/ 1 5Р1 10Р1 ■10
Ней 1 5Р1 10Р1 ■10
1
Правка... !
Удалить ^
Удалить Все
Закрыть Спр.
Нажимают кнопку «ЫехЫ«Далее».
Мастер Нового Теста
Профиль
!Р^ёдактрр профиля.
Установка канала:
Имя Источник I Детектор 1 Уровень сигнала
Сгееп 470пгг1 51 Опт 8
Уе11ои 530пт 555пт 6,67
Огапде 535пт 61 Опт 5
Ней 625пт ббОпт 5
Сг1т50п 680пт 710Ьр 7
В1ие 365пт 460пт 7
Новый...
Правка..
Удалить
Отменить
Опт. уровня сигн...
Выход << Назад Далее>>
Уровень Сигн.
Данная область
предназначена для
отображения
справки
элементов
мастера.Для
справки по этой
теме проведите
мышь над этой
темой. Вы можете
также нажать на
раскрывающийся
список для
сугображения
справки о
возможных
установках.
10. Запускают амплификацию кнопкой «8Шг1 гип»/«Старт». При необходимости
введенные значения термоциклирования могут быть сохранены в качестве шаблона,
используя кнопку «8а\е 1етрШе/«Сохр.шаблон».
Инструкция по применению аАмплнгенВигк-та11е1/р5еис1ота11е1-РВ'» Страница 17 из 26