Набор реагентов для выявления и дифференциации буркхольдерий группы "pseudomallei" в формате мультиплексной полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией "Амплиген Буркхольдерии группы "pseudomallei" βL В/D - EPh" по ТУ 21.20.23-014-01898084-2016 — инструкция и характеристики

РУ: РЗН 2018/7785 от 07.11.2018 · класс риска 3

Производитель: ГУ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Россия)

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 1 ---
«УТВЕРЖДАЮ» 
Директор ФКУ^ 
исследовательс 
институт Pocni
1 м
« »
ИНСТРУКЦИЯ п о  ПРИМЕНЕНИЮ*
«НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ 
БУРКХОЛЬДЕРИЙ ГРУППЫ «PSEUDOMALLEI»  В ФОРМАТЕМУЛЬТИПЛЕКСНОЙ 
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ 
«АМПЛИГЕН БУРКХОЛЬДЕРИИ ГРУППЫ «PSEUDOMALLEI»  BL B/D - ЕРИ» ПО ТУ
21.20.23-014-01898084-2016»
1. НАЗНАЧЕНИЕ
«Набор реагентов для выявления и дифференциации буркхольдерий группы 
« p se u d o m a lle i» в формате мультиплексной полимеразной цепной реакции с
электрофоретической детекцией «Амплиген Буркхольдерий группы « p se u d o m a lle i» РЬ B/D - 
ЕРЬ» по ТУ 21.20.23-014-01898084-2016», далее - набор реагентов «Амплиген 
Буркхольдерий группы « p s e u d o m a lle i» РТ B/D - ЕРЬ», предназначен для обнаружения ДНК и 
одновременной дифференциации 3-х видов буркхольдерий группы « p se u d o m a lle i» - 
возбудителя мелиоидоза (Я p se u d o m a lle i), возбудителя сапа (Я m a lle i) и Я th a ila n d e n sis по 
набору генов Р-лактамаз молекулярных классов В и D в пробах выделенных культур 
микроорганизмов, клинического материала (кровь, моча, мокрота, спинномозговая жидкость, 
отделяемое язв, пунктаты из лимфатических узлов, экссудаты, абсцессы, рвотные массы, 
испражнения), секционного материала (биоптаты печени, селезенки, легкого, сердца, почки, 
головной мозг) методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с
электрофоретическим способом детекции.
Возбудитель мелиоидоза (B u rk h o ld e ria  p s e u d o m a lle i) и возбудитель сапа
(B u rk h o ld e ria  m a lle i) -  аэробные грамотрицательные неферментирующие бактерии, 
принадлежащие к роду B u rk h o ld e ria , относятся к микроорганизмам II группы патогенности 
(опасности). Мелиоидозная и сапная инфекции у людей имеют сходные клинические 
проявления.
Мелиоидоз - инфекционное заболевание людей и животных, не имеющее 
специфических симптомов и протекающее с явлениями сепсиса и образованием абсцессов в 
органах и тканях, эндемичен для широкого ряда стран влажных тропиков и субтропиков. 
Инфицированные животные, выделяя возбудителя с естественными жидкостями и экссудатом 
раневых поверхностей, обсеменяют объекты окружающей среды. Основной механизм 
заражения человека - контактный, реализуется при контакте поврежденной кожи или 
слизистых оболочек с инфицированными почвой и водой. Встречается алиментарный путь 
заражения, в том числе с грудным молоком; наиболее опасно аэрогенное заражение, которое 
ведет, как правило, к летальному исходу.
Сап - зоонозная инфекция, протекающая у человека в острой септической и 
хронической формах со специфическими поражениями кожи, слизистых оболочек, мышц, 
суставов и внутренних органов. Источником инфекции для людей служат животные, обычно
♦Введена впервые
Инструкция по применению «Амплиген Буркхольдерий группы « p se u d o m a llei» рь B/D - ЕРЬ» Страница 1 из 13


--- стр. 2 ---
лошади. Заражение происходит через выделения больного животного; носовой секрет и 
отделяемое кожных язв, реже содержимое кишечника, моча, молоко. Основной механизм 
заражения контактный, возбудитель попадает в организм человека через кожу, значительно 
реже через слизистые оболочки верхних дыхательных путей и конъюнктиву глаз.
В. th a ila n d e n sis —  представитель комплекса «5. p s e u d o m a lle i» , относится к 
микроорганизмам III группы патогенности (опасности), способен вызывать инфекции 
различной степени тяжести с неспецифическими клиническими проявлениями, что в 
значительной мере затрудняет его дифференциальную диагностику с мелиоидозом. 
В. th a ila n d e n sis разделяет с В. p s e u d o m a lle i естественные среды обитания. Заражение 
человека чаще всего происходит через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки 
путем попадания В. th a ila n d e n sis с инфицированной почвой или водой. В большинстве 
обычных диагностических тестов В. th a ila n d e n sis идентичен В. p s e u d o m a lle i, что затрудняет 
его дифференциацию с возбудителями сапа и мелиоидоза рутинными лабораторными 
методами. В связи с чем решающую роль в лабораторной диагностике трех перечисленных 
инфекций играют молекулярно-генетические методы (ПЦР).
Набор реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a lle i» РЬ B/D - ЕРЬ» 
используется в клинической лабораторной диагностике для исследования материала, по­
лученного от лиц обоего пола, любого возраста с подозрением на мелиоидоз и/или сап, 
В. th a ila n d e n sis вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания (в анамнезе 
находившихся на эндемичных территориях по мелиоидозу, сапу и В. th a ila n d e n sis).
2 . ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ
Для проведения исследований могут быть использованы амплификаторы для ПЦР 
типа С1000.
Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора реагентов «Амплиген 
Буркхольдерии группы « p s e u d o m a lle i» pL B/D - ЕРЬ» входят 7 реагентов:
Таблица 1
№
п/п
Реактив Описание Объем
(мл)
Количество
1 ПЦР - смесь № 1 Прозрачная жидкость красного цвета, 
содержащая ПЦР-буфер, магния 
хлорид и смесь дНТФ
0,5 1 пробирка
2 ПЦР - смесь № 2 Прозрачная бесцветная жидкость, 
содержащая смесь праймеров
0,1 1 пробирка
3 Га^-ДНК-
полимераза
Прозрачная бесцветная жидкость, 
представляющая собой фермент с 
активностью 5 ед/мкл
0,02 1 пробирка
4 ПКО Прозрачная бесцветная жидкость, 
водный раствор геномной ДНК 
В. p se u d o m a lle i С-141
0,4 1 пробирка
5 ОКО Прозрачная бесцветная жидкость 0,4 1 пробирка
6 Вода
деионизованная
Прозрачная бесцветная жидкость 0,4 1 пробирка
7 Масло
минеральное
Прозрачная вязкая жидкость 1,0 2 пробирки
Набор реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a lle i» РЬ B/D - ЕРЬ» 
рассчитан на проведение 50 определений, включая положительные и отрицательные 
контроли.
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у п п ы  « p se u d o m a llei» р Ь  B / D  -  Е Р Ь »  С т р а н и ц а  2  и з  1 3
1


--- стр. 3 ---
Принцип метода - обнаружение специфических фрагментов ДНК у В. p se u d o m a lle i, 
В. m a lle i и В. th a ila n d e n sis основан на использовании мультиплексной полимеразной цепной 
реакции с электрофоретическим способом детекции. Метод полимеразной цепной реакции 
(ПЦР) представляет собой повторяющиеся циклы синтеза —  амплификации, специфической 
области ДНК-мишени в присутствии полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, 
буферного раствора и олигонуклеотидных праймеров, распознающих ДНК-мишень. Одна 
пара группоспецифических праймеров обеспечивает амплификацию фрагмента гена Р- 
лактамазы класса В у 5. p se u d o m a lle i, В. m a lle i  и В. th a ila n d e n sis.  Вторая пара 
группоспецифических праймеров обеспечивает амплификацию фрагмента гена Р-лактамазы 
класса В у Я p s e u d o m a lle i и Я m a lle i. Третья пара группоспецифических праймеров 
обеспечивает амплификацию фрагмента гена Р-лактамазы класса D у В. p s e u d o m a lle i и 
Я th a ila n d e n sis. Детекцию продуктов амплификации осуществляют с помощью 
электрофореза в агарозном геле. Метод мультиплексной ПЦР является качественным 
анализом.
Проведение анализа включает следующие этапы: 1. вьщеление ДНК из проб 
вьщеленных культур микроорганизмов, клинического и секционного материала; 2. 
проведение ПЦР - амплификация ДНК на приборах типа С1000; 3. поста-новка гель- 
электрофореза; 4. учёт и интерпретация результатов ПЦР-анализа проводят по наличию или 
отсутствию на электрофореграмме специфических фрагментов ДНК в срав-нение с 
«положительным контролем».
Ограничение метода. В инфицированном материале Я. p s e u d o m a lle i, В. m a lle i  и 
Я th a ila n d e n sis может быть не обнаружена вследствие содержания инфекционного агента в 
образце ниже заявленной чувствительности или по причине некачественного выделения 
ДНК. Гепарин, цитрат натрия являются ингибиторами ПЦР, поэтому в качестве антикоа­
гулянта можно использовать только ЭДТА в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация 
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе 
с материалом, содержащим микроорганизмы 1-IV групп патогенности». Также ингибитором 
ПЦР являются следовые количества гемоглобина в препарате вьщеленной ДНК. Для 
избегания ощибок на этапе вьщеления ДНК следует использовать рекомендуемый метод 
вьщеления ДНК в строгом соответствии с инструкцией производителя по применению 
набора для выделения ДНК. Причиной получения ложноположительного результата может 
служить контаминация на этапе постановки реакции ПЦР. Ошибки проведения ис­
следования выявляются с помощью положительного и отрицательного контрольных об­
разцов и ПЦР (п.п. 7.2.3, 7.2.5).
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗДЕЛИЯ
Аналитическая чувствительность
Набор реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы « p s e u d o m a lle i» РЬ B/D - ЕРЬ» 
должен выявлять ДНК В. p s e u d o m a lle i, В. m a lle i  и В. th a ila n d e n sis в суспензиях 
концентрацией не менее I xIO '^m.k./m h и дифференцировать виды буркхольдерий группы 
« p se u d o m a lle i»  (В. p s e u d o m a lle i, В. m a llei, В. th a ila n d e n sis)  по набору генов р-лактамаз 
молекулярных классов В и D.
Аналитическая специфичность
Набор не должен давать положительных результатов с ДНК микроорганизмов других 
родов в суспензиях концентрацией 1x10^ м.к./мл.
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у п п ы  « p se u d o m a llei» p L  B / D  -  E P h »  С т р а н и ц а  3  и з  1 3


--- стр. 4 ---
Диагностические характеристики
Диагностические характеристики набора установлены в лабораторных условиях с 
применением 15 штаммов В. p se u d o m a lle i, 13 штаммов В. m a lle i,  5 штаммов В. th a ila n d e n sis и 
24 штаммов гетерологичных микроорганизмов из лаборатории коллекционных штаммов 
ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 
на модельных образцах материала: 162 пробы бактериальных суспензий буркхольдерий 
группы « p se u d o m a lle i»  (В. p se u d o m a lle i, В. m a lle i  и В. th a ila n d e n sis)  в концентрации 
1х10'*м.к./мл, 108 проб клинического материала, искусственно контаминированных
буркхольдериями группы « p se u d o m a lle i»  {В. p s e u d o m a lle i, В. m a lle i  и В. th a ila n d e n sis) в 
концентрации 1х10‘*м.к./мл, 66 проб секционного материала, искусственно
контаминированных буркхольдериями группы « p se u d o m a lle i»  (В. p s e u d o m a lle i, В. m a lle i  и 
В. th a ila n d e n sis) в концентрации 1хЮ'’м.к./мл; 156 проб, контаминированных
близкородственными и гетерологичными микроорганизмами {В. c e p a c ia , Е. соИ,  
К. p n e u m o n ia e , Р  a e ru g in o sa , Р  m ira b ilis, S. a u reu s, S. e p id e rm id is, V. c h o le ra e )  в концентрации 
IxlO’ м.к./мл.
Определение буркхольдериями группы « p se u d o m a lle i»  (В. p s e u d o m a lle i, В. m a lle i  и 
В. th a ila n d e n sis), близкородственных и гетерологичных микроорганизмов подтверждено с 
использованием референтного метода - микробиологический метод исследования 
микроорганизмов рода B u rk h o ld e ria с идентификацией буркхольдерий группы « p se u d o m a lle i» 
на основании роста на дифференциально-диагностических средах (агар Эшдауна, 
триптиказо-соевый агар с 4 % глицерина, минимальный агар с L-арабинозой).
Диагностическая чувствительность - не менее 99.0 % с доверительной 
вероятностью 90% при анализе 336 положительных проб (162 пробы суспензий 
микроорганизмов, 108 проб клинического материала и 66 проб секционного материала, 
искусственно контаминированных бактериальными агентами), содержащих буркхольдерий 
группы « p se u d o m a lle i»  {В. p s e u d o m a lle i, В. m a lle i  и В. th a ila n d e n sis)  в концентрации 
IxlO'* м.к./мл получен положительный результат в 306 случаях.
Диагностическая специфичность - не менее 99.0 % с доверительной вероятностью 
90%; при исследовании 156 отрицательных проб (98 проб суспензий микроорганизмов, 36 
проб клинического материала и 22 пробы секционного материала, искусственно 
контаминированных бактериальными агентами), содержащих близкородственные и 
гетерологичные микроорганизмы {B u rk h o ld e ria  c e p a c ia , E sc h e ric h ia  coli,
K leb siella  p n e u m o n ia e . P se u d o m o n a s a eru g in o sa , P roteus m ira b ilis. Staphylococcus a u reu s.
Staphylococcus ep id e rm id is. V ibrio c h o le ra e )  в концентрации Ixio’м.к./мл получен 
отрицательный ответ в 156 случаях.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ
4.1 Информация об инфекционных или микробных рисках
Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на 
деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и 
животных 1-1V групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеющих 
санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами 1-IV 
групп патогенности.
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, поэтому 
этапы подготовки образцов и проведение ПЦР-анализа проводят в соответствии с 
требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп 
патогенности», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы 
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим 
микроорганизмы I-1V групп патогенности», МУ 4.2.2831-11 «Лабораторная диагностика 
сапа», МУ 4.2.2787-10 «Лабораторная диагностика мелиоидоза».
4.2 Необходимость обучения персонала
Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним 
Инструкция по применению «Амплиген Буркхольдерий группы « p se u d o m a llei» РЬ B/D - ЕРЬ» Страница 4 из 13


--- стр. 5 ---
медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие соответствующие 
курсы специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными 
биологическими агентами (ПБА) I-II групп патогенности.
4.3 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными, 
вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует 
соблюдать обычные меры предосторожности для лабораторий;
- пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные халаты;
- не принимать пищу, пить или курить в лабораторных помещениях;
- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с 
мьшом.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них 
компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов 
набора реагентов за медицинской помощью следует обратиться немедленно.
4.4 Информация об экологических рисках
Уничтожение неиспользованных компонентов набора или наборов реагентов, не 
прошедших контроль, а также серий с истекшим сроком годности проводить в соответствии 
с СанПиНом 2.1.7.2790-10.
4.5 Информация о физических рисках, в том числе возможность взрыва или  
возгорания
Набор реагентов следует применять по назначению в комбинации с приборами, 
прошедшими надлежащее техническое обслуживание. Необходимо строгое соблюдение 
инструкций по эксплуатации электрооборудования, безопасности при работе с 
электроприборами.
4.6 Информация о рисках применения, приводящих к ошибочному результату исследо­
вания:
- Использование набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a lle i» 
РЬ B/D - ЕРЬ» с истекшим сроком годности;
- Нарушение условий транспортирования, хранения набора реагентов;
- Нарушения упаковки и внешнего вида компонентов набора реагентов;
- Нарушение условий транспортирования, хранения и подготовки проб;
- Нарушение условий окружающей среды при эксплуатации набора реагентов;
- Нарушение процесса проведения анализа, регистрации и учета результатов.
- Применение по назначению МИ в комбинации со средствами измерения, не 
прошедшими поверку и/или калибровку.
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, необходимые при работе с изделием’*
Таблица 2
Наименование Основные характеристики или обозначения 
документации, производитель
Амплификатор типа С1000 Термоциклер С1000, «Bio-Rad», США
Шкаф микробиологической 
безопасности класса II
Шкаф биологической безопасности II класса 
GL-130 Biowizard Golden Line, «KOJAIR», 
Финляндия
ПЦР-бокс Бокс для ПЦР работ UVC/T-M-AR, «BioSan»,
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у п п ы  « p se u d o m a llei» Р Ь  B / D  -  Е Р Ь »  С т р а н и ц а  5  и з  1 3


--- стр. 6 ---
Латвия
Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 120 °С, 
«ТЕРМО 48», «Биоком», Россия
Микроцентрифуга-вортекс Центрифуга «Фуга/вортекс микро-спин FV- 
2400», «BioSan», Латвия
Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга «Mini-Spin», «Eppendorf», 
Германия
Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский «ОМ-1», ОАО 
«Утес», Россия
Дозатор 0,5-10 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 5-50 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 20 - 200 мкл ILS (САРР), Дания
Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов универсальная 
на 5 дозаторов, «Хеликон», Россия
Штатив «рабочее место» для 
микропробирок на 1,5 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок на 
1,5 мл, 6x12 мест, «ИнтерЛабСервис», Россия
Штатив «рабочее место» для 
микропробирок на 0,2 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок на 
0,2 мл, 10x20 мест, «ИнтерЛабСервис», Россия
Микроцентрифужные пробирки 
объемом 1,5 мл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с 
плоской крышкой
ФСЗ 2012/11892, «Axygen», США
Наконечники универсалъные для 
дозаторов переменного объемом с 
аэрозольным барьером до 10 мкл
ФСЗ 2012/11892, «Axygen», США
Наконечники универсальные для 
дозаторов переменного объемом с 
аэрозолъным барьером до 20 мкл
ФСЗ 2012/11892, «Axygen», США
Наконечники универсальные для 
дозаторов переменного объемом с 
аэрозолъным барьером до 100 мкл
ФСЗ 2012/11892, «Axygen», США
Наконечники универсальные для 
дозаторов переменного объемом с 
аэрозольным барьером до 200 мкл
ФСЗ 2012/11892, «Axygen», США
Пестик для пробирок типа Eppendorf 
1,5-2,0 мл
ФСЗ 2011/10287, «SSI», США
Камера для горизонтального 
электрофореза
Камера для горизонтального электрофореза 
multiSUB Midi Duo (lOx? +10x10 см), «Cleaver 
Scientific», Великобритания
Источник питания Источник питания EV243, «Consort», Бельгия
Система гельдокументирующая Система гельдокументирующая GelDoc, «Bio- 
Rad», США
Холодильник Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной 
камерой не выше минус 18 °С, «Атлант», Россия
Одежда одноразовая медицинская из 
нетканого и полимерного материалов
РЗН 2013/668
Перчатки медицинские 
диагностические одноразовые. Часть 
1. Спецификация на перчатки из 
каучукового латекса или раствора
ГОСТ Р 52239-2004
Спирт этиловый ректификованный из 
пищевого сырья ГОСТ 5962-2013
Натрий хлористый ГОСТ4233-77
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у п п ы  « p se u d o m a llei» р ь  B / D  -  Е Р Ь »  С т р а н и ц а  6  и з  1 3


--- стр. 7 ---
Комплект реагентов для вьщеления 
РНК/ДНК из клинического материала 
«РИБО-сорб», вариант 100 по ТУ 
9398-004-01897593-2008
ФСР 2008/03993, ФБУН «ЦНИИ 
эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия
Комплект реагентов для 
электрофоретической детекции 
продуктов амплификации в агарозном 
геле «ЭФ», вариант генотип-300 по ТУ 
9398-070-01897593-2008
ФСР 2008/03146, ФБУН «ЦНИИ 
эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия
* Примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим 
характеристикам не уступающего рекомендуемому.
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ
Материалом для исследования служат:
- пробы чистых культур микроорганизмов: бактериальные суспензии культур 
В. p se u d o m a lle i, В. m a llei, В. th a ila n d e n sis  или подозрительных изолятов;
- пробы биологического (клинического) материала:
на мелиоидоз {В. p se u d o m a lle i) -  кровь, моча, мокрота, спинномозговая жидкость, 
отделяемое язв, пунктаты лимфоузлов, экссудаты, абсцессы, рвотные массы, секционный 
материал (печень, селезенка, легкие, сердце, почки, головной мозг);
на сап {В. m a lle i) —  мокрота, отделяемое язв, пунктаты лимфоузлов, экссудаты, 
испражнения, секционный материал (печень, селезенка, легкое, сердце);
на В. th a ila n d e n sis -  секционный материал (печень, селезенка, легкие, сердце, почки, 
головной мозг).
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично 
завинчивающимися крыщками в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность 
работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и 
транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09 
«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых 
кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при 
температуре от плюс 2 до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036-95 
«Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-IV групп 
патогенности». После проведения предварительной обработки проб допускается их 
транспортировка при температуре от минус 16 до минус 20 °С в течение 7 суток или в сосуде 
Дьюара с жидким азотом - длительно.
7. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
7.1. Подготовка исследуемых образцов
7.1.1. Подготовка проб чистых культур микроорганизмов для ПЦР
Из культур в. m a lle i, В. p s e u d o m a lle i, В. th a ila n d e n sis  или подозрительных изолятов 
готовят суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному 
образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85 (ЮМЕ)), что соответствует 
1х10^м.к./мл для В. m a lle i, В. p se u d o m a lle i, В. th a ila n d e n sis.  Для исследования в отдельную 
микропробирку объемом 1,5 мл отбирают суспезии клеток чистой культуры в количестве 
100 мкл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК (пп. 7.2.1, 
7.2.2).
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у п п ы  « p se u d o m a llei» Р Ь  B / D  -  Е Р Ь »  С т р а н и ц а  7  и з  1 3


--- стр. 8 ---
7.1.2. Подготовка проб биологического (клинического) материала
Кровь. Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл с помощью 
одноразовой иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специальной вакуумной системы типа «Vacuett» с 
6 % ЭДТА или одноразовым шприцем в стерильные стеклянные или пластиковые пробирки с 
цитратом натрия (3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Аккуратно 
перемешивают покачиванием до полного смешивания с антикоагулянтом. После 
центрифугирования отбирают лейкоцитарное кольцо вместе с плазмой. Для исследования в 
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают пробу в количестве 100 мкл. Затем 
выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления ДНК (пн. 7.2.1, 7.2.2).
Моча. При исследовании мочи собирают ее среднюю порцию (20-30 мл) в 
специальный одноразовый контейнер с завинчивающейся крышкой. Переносят 1 мл мочи, 
используя наконечник с фильтром, в стерильную одноразовою микроцентрифужную 
пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируют в течение 10 мин при 10000 об/мин, полностью 
удаляют супернатант, не захватывая осадок. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % 
раствора натрия хлорида, тщательно перемешивают содержимое на вортексе. Затем 
выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
Мокрота. Мокроту забирают в количестве не менее 1 мл в одноразовые 
градуированные стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками 
объемом не менее 50 мл. Для разжижения мокроты применяют раствор «Муколизин» 
(Na2HP04 0,0774 М, NaH 2P04 0,0226 М, бета-МЭ 0,094 М, 5 % азид натрия в конечной 
концентрации 0,05 %). Пробу объемом 1-2 мл смешивают с пятикратным объемом раствора 
«Муколизин», перемешивают покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 20-30 
мин, периодически встряхивая. Затем отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в 
микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000 об/мин в 
течение 10 мин. Удаляют супернатант, не захватывая осадок. Осадок ресуспендируют в 
100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы обеззараживания материала 
и вьщеления ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
Спинномозговую жидкость (ликвор) отбирают после пункции поясничной, 
субокципитальной области или мозговых желудочков с помощью одноразовых игл в 
одноразовые пластиковые сухие микропробирки объемом 1,5 мл в количестве не менее 1 мл. 
Пробирку плотно закрывают крышкой, не допуская зазора и смятия внутренней части 
крышки. Для концентрирования клеток 1 мл спинномозговой жидкости центрифугируют в 
течение 10 мин при 10000 об/мин. Удаляют 0,9 мл надосадочной жидкости, осадок клеток 
перемешивают с 0,1 мл оставшейся жидкости. Затем выполняют этапы обеззараживания 
материала и вьщеления ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
Отделяемое язв, пунктаты из лимфатических узлов, экссудаты берут шприцем 
емкостью не менее 5 мл. Кожу на участке, намеченном для прокола, обрабатывают 70 % 
спиртом, а затем смазывают 5 % раствором йода и вновь протирают 70 % спиртом. У язв 
пунктируют плотный край. Материал переносят в отдельную микропробирку объемом 
1,5 мл. Для исследования в отделъную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают 100 мкл 
клинического материала. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления 
ДНК(пп. 7.2.1, 7.2.2).
Для концентрирования клеток 1 мл экссудата центрифугируют в течение 10 мин при 
10000 об/мин. Удаляют 0,9 мл надосадочной жидкости, осадок клеток перемешивают с 0,1 мл 
оставшейся жидкости. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления 
ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у п п ы  «pseudom allei'»  p L  B / D  -  E P h »  С т р а н и ц а  8  и з  1 3


--- стр. 9 ---
Абсцессы. Для взятия содержимого абсцессов с поверхности раны удаляют 
поверхностный экссудат салфеткой, смоченной стерильным физиологическим раствором или 
70 % спиртом. После дезинфекции поверхности раны и высыхания дезинфектанта с 
помощью шприца отбирают аспират из глубины раны. Если первоначально аспират взять не 
удалось, подкожно вводят стерильный физиологический раствор и повторно пытаются взять 
аспират. Отсасывают содержимое и переносят в стерильную микропробирку объемом 1,5 мл 
с крышкой. Для исследования в отдельную микропробирку объемом 1,5 мл отбирают 100 мкл 
клинического материала. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления 
ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
Рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в стерильную посуду ложками или 
автоматической пипеткой переменного объема. Дальнейшую подготовку проводят так же как 
при исследовании жидких испражнений. Затем выполняют этапы обеззараживания материала 
и вьщеления ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
Испражнения, если они жидкие забирают в количестве 10-20 мл в стерильную посуду 
объемом 60-100 мл стерильными ложками или автоматической пипеткой переменного 
объема, если они плотные - в количестве 1-3 г в стерильные емкости объемом 60-100 мл.
Жидкие испражнения переносят по 1-5 мл в микроцентрифужные пробирки с 
завинчивающими крышками. Пробирки центрифугируют при 9000 об/мин в течение 5 мин. 
Затем отбирают по 0,2 мл верхней бело-желтой части осадка (если отсутствует бело-желтый 
пограничный слой или полностью осадок, то отбор производят на границе осадка и 
супернатанта или со дна пробирки, соответственно) и переносят в микроцентрифужные 
пробирки объемом 1,5 мл. Пробирки центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин. 
Удаляют супернатант, не захватывая осадок. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9% 
раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и въщеления 
ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
К плотным испражнениям добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в соотношении 
1:9, тщателъно ресуспендируют с исполъзованием микроцентрифуги-встряхивателя. 
Отбирают по 1 мл в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Дальнейшую подготовку 
проводят так же как при исследовании жидких испражнений. Затем выполняют этапы 
обеззараживания материала и вьщеления ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
Секционный материал (биоптаты печени, селезенки, легкого, сердца, почки, 
головной мозг) отбирают при вскрытии, соблюдая регламентированные меры безопасности. 
Кусочки органов массой 0,1-1 г растирают в микропробирках объемом 1,5 мл пестиками до 
гомогенного состояния, затем добавляют равный объем (не менее 100 мкл) стерилъного 0,9 % 
раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Суспензию отстаивают при комнатной 
температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу переносят (не захватывая осадок) в 
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл, используя наконечник с фильтром. Затем 
выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления ДНК (пп. 7.2.1, 7.2.2).
7.2 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
7.2.1 Обеззараживание материала
Подготовленные для исследования пробы обеззараживают в соответствии с 
МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации 
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-1V групп 
патогенности».
К исследуемым образцам добавляют мертиолят натрия до концентрации 1:10000 
(0,01 %) и прогревают их при (56±1) ”С в течение 30 минут. Затем, 100 мкл образца переносят
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у п п ы  « p se u d o m a llei» р ь  B / D  -  Е Р Ь »  С т р а н и ц а  9  и з  1 3


--- стр. 11 ---
а) отрицательный контроль ПЦР - вместо ДНК-пробы вносят 8 мкл ОКО;
б) положительный контроль ПЦР - вместо ДНК-пробы вносят 8 мкл ПКО.
8. Перемешивают содержимое микроробирок и для избавления от микропузырьков 
кратковременно центрифугируют с помощью микроцентрифуги-вортекса.
9. При необходимости для предотвращения испарения реакционной смеси при 
термоциклировании сверху во все микропробирки добавляют по 25 мкл минерального масла.
7.2.3.3 Проведение реакции амплификации
Микропробирки устанавливают в ячейки реакционного модуля амплификатора типа
С Ю О О .
Программируют прибор и запускают выполнение программы амплификации согласно 
таблице 4.
Таблица 4
Цикл Температура, °С Время Колиество циклов
1 95,0 5 мин 1
2
94,0 30 с
3559,9 30 с
72,0 45 с
3 72,0 1 мин 1
По окончании выполнения программы приступают к анализу и интерпретации 
результатов.
7.2.4 Постановка гель-электрофореза
Анализ продуктов амплификации проводят разделением фрагментов ДНК в агарозном 
геле, используя коммерческий набор Комплект реагентов для электрофоретической детекции 
продуктов амплификации в агарозном геле «ЭФ», вариант генотип-300 (ФБУН «ЦНИИ 
эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Рабочие растворы и агарозный гель готовят в 
соответствии с инструкцией к указанному набору.
После окончания реакции амплификации пробирки с продуктами ПЦР выставляют в 
штатив последовательно, отбирают из-под слоя масла по 10 мкл проб и вносят в лунки геля 
под буферный раствор для электрофореза (используют новый наконечник для каждой 
пробы). В каждом ряду дорожек геля обязательно должен быть представлен «положительный 
контроль» и «отрицательный контроль».
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к 
положительному электроду), и включают источник. Для проведения электрофореза 
используют камеру multiSUB Midi Duo («Cleaver Scientific», Великобритания) и источник 
питания EV243 («Consort», Бельгия) или аналогичные. Оптимальная напряженность 
электрического поля при этом составляет 5 В/см. Время электрофореза - 40 мин.
По завершении времени электрофореза, выключают источник тока, агарозный гель 
извлекают из камеры и результаты проведения ПЦР регистрируют в проходящем 
ультрафиолете с использованием системы документации гелей «Gel Doc» («BioRad», США) 
или аналогичной.
7.2.5 Учет и интерпретация результатов
Учёт и интерпретацию результатов ПЦР-анализа проводят по наличию или 
отсутствию на электрофореграмме специфических фрагментов ДНК в сравнение с 
«положительным контролем» (таблица 5, рис. 1, рис. 2, рис. 3).
Инструкция по применению «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a llei» рь B/D - ЕРЬ» Страница И из 13


--- стр. 12 ---
Таблица 5
Результат анализа/ вид возбудителя в пробе Длина специфиеского фрагмента 
ДНК на электрофореграмме
727 п.н. 440 п.н. 352 п.н.
Положительный/обнаружена ДНК В. p se u d o m a lle i + + +
Положительный/обнаружена ДНК В. m a lle i + - +
Положительный/обнаружена ДНК В. th a ila n d e n sis - + +
Отрицательный/не обнаружена ДНК штаммов 
В. p se u d o m a lle i, В. m a lle i  и В. th a ila n d e n sis
- - -
«Положительный контроль» ч- + -1 -
«Отрицательный контроль» - - -
Рис. 1
Электрофореграмма 
результатов ПЦР при 
иссследовании проб 
1.0К0
2. ПКО
3. Обнаружена ДНК 
В. p se u d o m a lle i
Рис. 2
Электрофореграмма 
результатов ПЦР при 
иссследовании проб 
1.0К0
2. ПКО
3. Обнаружена ДНК В. m a lle i
4. Обнаружена ДНК В. m a lle i
Рис. 3
Электрофореграмма 
результатов ПЦР при 
иссследовании проб 
1.0К0
2. ПКО
3. Обнаружена ДНК 
В. th a ila n d e n sis
1. В «положительном контроле» должны присутствовать три фрагмента ДНК размером 
727 П .Н ., 440 п.н. и 352 п.н.
2. На электрофореграммах проб содержащих «отрицательный контроль» ампликоны 
должны отсутствовать.
3. Наличие трех ампликонов размерами 727 п.н., 440 п.н. и 352 п.н. на дорожке 
исследуемой ДНК-пробы, еоответствующих по электрофоретической подвижности 
фрагментам ДНК в «положительном контроле», свидетельствует о присутствии в пробе ДНК 
В. p se u d o m a lle i и учитывается как «положительный результат».
4. Наличие двух ампликонов размерами 727 п.н. и 352 п.н. или одного ампликона 
размером 727 п.н. на дорожке исследуемой ДНК-пробы, соответетвующих по 
электрофоретичеекой подвижности фрагментам ДНК в «положительном контроле», 
свидетельетвует о присутствии в пробе ДНК В. m a lle i  и учитывается как «положительный 
результат».
5. Наличие двух ампликонов размерами 440 п.н. и 352 п.н. на дорожке иееледуемой 
ДНК-пробы, соответствующих по электрофоретической подвижности фрагментам ДНК в 
«положительном контроле», свидетельствует о присутствии в пробе ДНК В. th a ila n d e n sis и 
учитывается как «положительный результат».
6. Отсутствие на электрофореграммах анализируемых проб ампликонов при 
одновременном наличии таковых на дорожках с «положительным контролем» 
свидетельствует о том, что ДНК возбудителей еапа, мелиоидоза и В. th a ila n d e n sis в 
анализируемой пробе отеутствует. Результат анализа учитывается как «отрицательный 
Инструкция по применению «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a llei» PL B/D - EPh» Страница 12 из 13


--- стр. 13 ---
результат». Наличие ампликонов в анализируемых пробах, размер которых не соответствуют 
таковым положительного контроля, не учитываются.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные 
результаты для положительного и отрицательного контролен: амплификации, в соответствии 
с таблицей 5.
8. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
8.1 Условия хранения набора
В соответствии с ТУ 21.20.23-014-01898084-2016 условия хранения компонентов 
набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a lle i» РЬ B/D - ЕРЬ» - ПЦР- 
смесь № 1, ПЦР-смесь № 2, Та^-ДНК-полимераза, ПКО, ОКО, деионизованная вода при 
температуре от минус 16 до минус 20 °С, минеральное масло - при температуре от 18 до 
25 °С.
8.2 Условия транспортирования набора
Транспортирование набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a lle i» 
РТ B/D - EPh» осуществляют всеми видами крытых транспортных средств в соответствии с 
требованиями ГОСТ 15150 и правилами, установленными для каждого вида транспорта. 
Условия транспортирования - при температуре от 2 до 8 °С не более 2 суток, при температуре 
от минус 16 до минус 20 °С - неограниченно.
8.3 Срок годности набора
Срок годности набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы « p se u d o m a lle i» РЬ 
B/D - ЕРЬ» - 6 месяцев.
Условия эксплуатации набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии группы 
« p se u d o m a lle i» РЬ B/D - ЕРЬ» - при температуре от 18 до 25 °С.
8.4 Информация по безопасной утилизации
Использованные пробирки с ампликонами, наконечники, перчатки, ветошь для 
обработки поверхностей в ПЦР-боксе, собирают в пластиковые закрывающиеся емкости, 
выносят в рабочую зону 4-1 либо специально предназначенное вспомогательное помещение 
(МУ 1.3.2569-09) с целью последующей инактивации согласно требованиям СанПиН 
2.1.7.2790-10.
Наборы с истекщим сроком годности, а также в случае повреждения упаковки, 
утилизируют по классу А, как эпидемиологически безопасные отходы, по составу 
приближенные к ТБО (СанПиН 2.1.7.2790-10).
9. ГАРАНТИИ И ИНФОРМАЦИЯ О ПРОИЗВОДИТЕЛЕ
Производитель гарантирует качество набора реагентов «Амплиген Буркхольдерии 
группы « p se u d o m a lle i» рЬ B/D - ЕРЬ» при соблюдении условий транспортирования, хранения 
и эксплуатации в течение указанного срока годности.
Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно- 
исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере 
защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ Волгоградский научно- 
исследовательский противочумный институт'’Роспотребнадзора) (400131, г. Волгоград, ул. 
Голубинская, 7). Тел. (8442) 37-37-74. Г
Директор ФКУЗ «Российский 
научно-исследовательский противочумный 
институт «Микроб» Роспотребнадзора 
академик РАН, д.м.н., профессор
И н с т р у к ц и я  п о  п р и м е н е н и ю  « А м п л и г е н  Б у р к х о л ь д е р и и  г р у й п ы  «j
В.В. Кутырев 
m a lle i» рЬ B/D - ЕРЬ» Страница 13 из 13