Набор реагентов для определения профиля экспрессии генов с целью оценки прогностического индекса рецидивирования рака молочной железы методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Глобал Индекс РМЖ) по ТУ 9398-092-46482062-2017 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- ^^^ДНК-ТЕХИОЛОГНЯ Инструкция по применению Глобал Индекс РМЖ Организация-разработчик 1 УТВЕРЖДАЮ ектор ехнология» евичев 2019 г. Организация - разработчик 2 УТВЕРЖДАЮ Г енеральный директор ООО «Гамма Глобал РД» ИНСТРУКЦИЯ по ПРИМЕНЕНИЮ Набор реагентов для определения профиля экспрессии генов с целью оценки прогностического индекса рецидивирования рака молочной железы методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Глобал Индекс РМЖ) по ТУ 9398-092-46482062-2017 Организация-производитель СОГЛАСОВАНО Генер 00; ИЯ ТС» Самарин 2019 г. 2019 г. --- стр. 2 --- ^ № Н Е Х Н О Л О П М Инструкция по применению Лист 2 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 ВВЕДЕНИЕ Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре онкологических заболеваний и составляет 20% от общей заболеваемости женщин злокачественными опухолями. В структуре смертности от злокачественных новообразований у женщин удельный вес РМЖ составляет 17,4%. Распространенность заболевания в России составляет 43,8 человека (15,9 %) на 100 тыс. населения, тенденция увеличения этого показателя сохраняется [1]. Важную роль в выявлении группы риска и лечении больных РМЖ играют молекулярно-генетические маркеры. В частности определение мутаций в генах BRCA1 и BRCA 2 используется для оценки риска развития рака молочной железы и рака яичников в семьях с наследственными формами заболевания [2]. Определение профилей экспрессии генов позволяет прогнозировать развитие рецидивов РМЖ и определять тактику терапии. После хирургического лечения для больных РМЖ I-II стадии в случае эстроген- позитивного и HER2-HeraTHBHoro фенотипа опухоли стандартом адьювантной терапии является эндокринотерапия в сочетании с лучевой и химиотерапией при наличии показаний. Выбор тактики терапии осуществляется на основании рекомендаций российских и международных клинических руководств [3-6]. Традиционные клинико-морфологические характеристики заболевания, такие как размер первичйой опухоли, характер местного распространения, степень злокачественности и др. не всегда способны обеспечить необходимую прецизионность выбора терапии [7]. Подобная ситуация диктует необходимость создания диагностического инструмента, способного на основе многопараметрической оценки фенотипических особенностей РМЖ обеспечить обоснованный выбор адьювантной терапии, в особенности у пациентов, для которых сочетание классических факторов прогноза невозможно трактовать однозначно. То есть на основании про/ретроспективной оценки клинико-морфологических критериев невозможно выделить группу пациентов, которым, несмотря на благоприятное сочетание факторов прогноза, показано проведение адьювантной химиотерапии, а также пациентов, не нуждающихся в дополнительном цитостатическом лечении несмотря на неблагоприятное сочетание "классических" факторов прогноза [8-10]. В связи с тем, что используемые в настоящее время в клинике прогностические модели формируют достаточно гетерогенную группу больных в отношении риска прогрессирования, достаточно трудно оценить эффективность отдельных видов терапии. В частности, влияние адьювантной химиотерапии (АХТ) на десятилетнюю выживаемость без прогрессирования у больных без метастазов в регионарные лимфоузлы (N0) оценивается как низкое (абсолютный эффект составляет 4%) [16]. Несмотря на это приблизительно 50% больных ранним РМЖ (I-II --- стр. 3 --- ^ ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция no применению Лист 3 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 стадия заболевания) получают АХТ, которая характеризуется выраженными токсическими эффектами, что в значительной степени снижает качество жизни [10-13]. Эксперты 14 конференции Санкт-Галлен 2015 признают, что профили экспресеии мРНК функциональных генов человека адекватно отражают биологическую гетерогенность рака молочной железы и могут применяться для определения прогноза рецидива заболевания и рекомендаций назначения химиотерапии [14]. В основе предлагаемой технологии лежит анализ экспрессии генов методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР). Панель включает 24 гена (21 функциональный и 3 референеных гена). РНК извлекается из клеток, после чего преобразуется в кДНК, которая может быть амплифицирована и количественно оценена методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени. Полученный транскрипционный профиль сравнивается с транскрипционным профилем, характерным для риска рецидива заболевания. Мерой сходства исследуемого профиля с профилем, характерным для высокого риска рецидива заболевания является Индекс рецидивирования (ИР). По величине ИР делается заключение о наличии или отсутствии высокого риска рецидива РМЖ. Для оценки транскрипционных профилей использован метод сравнения индикаторных циклов с нормировочным фактором, рассчитанным на основе уровней экспрессии референеных генов В2М, HPRT1 и GUSB. ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Аксель Е. М. Давыдов М. И., Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных образований в 2008 г. // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 21, №2s, 2010, с.87-117. 2. Любченко Л.Н., Батенева Е.И. Медико-генетическое консультирование и ДНК- диагностика при наследственной предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников. Пособие для врачей. // ФГБНУ “Российский научный онкологический центр имени Н.Н. Блохина”, Москва, 2014, 63 с. 3. Харченко В.П., Рожкова Н.И. Маммалогия: национальное руководство// ГЭОТАР- Медиа, 2009, С. 56. 4. АеЫ S, Davidson Т, Gruber G, Castiglione М. ESMO Guidelines Working Group. Primary breast cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann. Oncol. 2014, T. 21, 5, стр. v9— vl4. --- стр. 5 --- / ^^^ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 5 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 1 НАЗНАЧЕНИЕ 1.1 Настоящая инструкция распространяется на Набор реагентов для определения профиля экепресеии генов е целью оценки прогноетичеекого индекеа рецидивирования рака молочной железы методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Глобал Индеке РМЖ) по ТУ 9398-092-46482062-2017. 1.2 Набор реагентов Глобал Индекс РМЖ предназначен для определения профиля экспреееии мРНК функциональных генов человека в парафиновых срезах и нативной ткани молочной железы с целью оценки прогностического индекса рецидивирования рака молочной железы в течение 10 лет у женщин всех возраетных категории (репродуктивного, пре- и постменопаузального возраста) больных эстроген- позитивным и HER2-негативным (ER-t-/Her2-) раком молочной железы I-II стадии (Т1-2, N0-1, МО), не получавших неоадьювантную химиотерапию, методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Оценку прогностического Индекса рецидивирования рака молочной железы проводят с учетом планируемой послеоперационной терапии (только гормонотерапия или гормонотерапия и адъювантная полихимиотерапия). Функциональное назначение изделия: Изделие предназначено для диагностики in vitro (определения профиля экепресеии мРНК функциональных генов человека с целью оценки прогностического индекса рецидирования рака молочной железы). 1.3 В качестве биологического материала иепользуют образцы парафиновых срезов и нативной ткани молочной железы, полученные в результате оперативного вмешательства. 1.4 Показания к проведению иселедования: женщины всех возрастных категорий (репродуктивного, мено- и постменопаузального возраста), с впервые диагноетируемым эстроген-позитивным и НЕК2-негативным (ER+/Her2-) раком молочной железы, I-II стадии (Т1-2, N0-1, МО), не получавших неоадьювантную химиотерапию, е целью оценки прогностического индекса рецидивирования рака молочной железы в течение 10 лет. Ограничения метода: Метод не предназначен для пациенток, получивших неоадьювантную химиотерапию, так как результаты неоадьювантной химиотерапии могут оказать влияние на уровень экепреееии генов. Тип адъювантной терапии в иееледовании не учитывается, включает весь спектр етандартных схем, применяемых в Российской Федерации, и не являетея ограничением к проведению иселедования. 1.5 Набор может быть иеполъзован в клинико-диагностичееких лабораториях медицинских учреждений и научно-иеследователъской практике. 1.6 Применять набор реагентов строго по назначению соглаено данной инструкции по применению. --- стр. 6 --- ^^^ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 6 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА Все компоненты набора реагентов готовы к применению и не требуют дополнительной подготовки к работе. 2.1 Состав набора 2.1.1 Набор в стандартной фасовке (фасовка S) включает следующие компоненты: R3-H203-S3/7, фасовка S Наименование компонентов Внешний вид Количество пробирок Номинальное количество компонента ОТ-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка 100 мкл Праймеры ОТ-Глобал Индекс РМЖ +дНТФ Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка • 32 мкл Обратная транскриптаза Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка 25 мкл Буфер для разведения ДНК Прозрачная бесцветная жидкость 4 пробирки по 1,0 мл Смеси для амплификации, запечатанные парафином. Стрип № 1 Прозрачная бесцветная или голубая жидкость, под воскообразным белым слоем 16 стрипов по 8 пробирок по 20 мкл Смеси для амплификации, запечатанные парафином. Стрип № 2 Прозрачная бесцветная или голубая жидкость, под воскообразным белым слоем 16 стрипов по 8 пробирок по 20 мкл Смеси для амплификации, запечатанные парафином. Стрип № 3 Прозрачная бесцветная или голубая жидкость, под воскообразным белым слоем 16 стрипов по 8 пробирок по 20 мкл ПЦР-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 4 пробирки по 1,0 мл Т aq-полимераза Прозрачная бесцветная жидкость 2 пробирки по 100 мкл Минеральное масло Прозрачная бесцветная вязкая маслянистая жидкость 1 флакон 8,64 мл Положительный контрольный образец Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка 240 мкл Крышки для стрипов 48 шт. ------------------------------------------------------------------------------------------------------- --- стр. 7 --- ; Л днк-ТЕХНОЛОГНЯ Инструкция по применению Лист 7 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 2.1.2 Набор в фасовке для автоматизированного дозирования (фасовка А) включает следующие компоненты: R3-H203-XA/7, фасовка А Наименование компонентов Внешний вид Количество пробирок Номинальное количество компонента ОТ-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка 100 мкл Праймеры ОТ-Глобал Индекс РМЖ+дНТФ Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка 32 мкл Обратная транскриптаза Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка 25 мкл Буфер для разведения ДНК Прозрачная бесцветная жидкость 4 пробирки по 1,0 мл Смеси для амплификации Стрим Прозрачная бесцветная или голубая жидкость тройной стрип по 8 пробирок по 90 мкл ПЦР-буфер Стрим Прозрачная бесцветная жидкость 2 пробирки по 600 мкл Полимераза TexHoTaq МАХ Прозрачная бесцветная жидкость 2 пробирки по 60 мкл Положительный контрольный образец Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка 160 мкл Крышки для Стрипов 3 шт. Стрипы по 8 пробирок 10 шт. 2.2 Число анализируемых проб Набор реагентов предназначен для одноразового применения и рассчитан на 16 образцов (рекомендуется проведение реакции обратной транскрипции 8 клинических образцов в двух повторах). 2.3 Принцип действия набора Метод: Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени с определением уровня экспрессии мРНК исследуемых генов методом сравнения индикаторных циклов (дельта Ср) относительно референсных генов В2М, HPRT1, GUSB, экспрессируемых в образце. --- стр. 8 --- ►^ЛНК-ТЕХИОЛОГНЯ Инструкция по применению Лист 8 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 Принцип метода основан на использовании процесса обратной транскрипции РНК и последующей амплификации кДНК, заключающейся в повторяющихся циклах: температурной денат)фации кДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров Taq-полимеразой. Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается в формате автоматического раскапывания использованием полимеразы, активность которой блокирована антителами, либо в формате ручного раскапывания методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоёв, разделённых прослойкой из парафина. Смешение слоёв и превращение их в амплификационную смесь происходит только после плавления парафина. При использовании полимеразы, активность которой блокирована антителами, активация фермента происходит только после предварительного прогрева реакционной смеси при 95°С в течение 5 минут. Это исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК- мишени при начальном прогреве пробирки. В реакционную смесь для проведения ПЦР введены ДНК-зонды, каждый из которых несёт флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификации в режиме реального времени. Для анализа продуктов ПЦР используют детектирующий амплификатор. ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой кДНК, помечены флуоресцентной меткой Fam. В таблице 1 представлен перечень выявляемых мРНК генов, канал детекции продуктов амплификации и цветовая кодировка для набора реагентов Глобал Индекс РМЖ. В определенн)ло пробирку набора реагентов добавлен олигонуклеотид с флуоресцентной меткой Rox - «Маркер». Он используется прибором как маркер определения положения стрипа в планшете. После прохождения амплификации программное обеспечение детектирующего амплификатора сравнивает заданное оператором расположение пробирок с реальным положением маркера, и, если находит несовпадение, то предупреждает оператора о несоответствии. Исследование с использованием набора состоит из следующих этапов: выделение нуклеиновых кислот (пробоподготовка); реакция обратной транскрипции; ПЦР- амплификация кДНК в режиме реального времени. --- стр. 10 --- ^ ’•^ЛНК-ТЕХНОЛОГНЯ Инструкция по применению Лист 10 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 в основе оценки прогностического Индекса рецидивирования лежит метод сравнения индикаторных циклов исследуемых генов (АСр). Экспрессия мРНК функциональных генов измеряется в относительных единицах и отражает соотношение уровня представленности транскриптов по отношению к референсным генам (В2М, GUSB, HPRT1). Для оценки валидности полученных результатов учитывается показатель амплификации кДНК референсного гена В2М (см.п. 3.2, 9.3), а также генов GUSB и HPRT1 (см. п.9.5). Праймеры и ДНК-зонды подобраны с учетом структуры генов, кодирующих мРНК, и не дают положительного результата на матрице геномной ДНК. Для некоторых генов (SCGB2A2, ERBB2, CCNB1, BAG1, CD68, ESR1, GRB7, ММРП, В2М, GUSB) фоновая амплификация на матрице геномной ДНК в пределах 1-2 Ig не вносит вклад в конечный результат исследования (см. п.3.1). Заключение о риске рецидива рака молочной железы проводится на основании значения величины Индекса рецидивирования' с учётом планируемой послеоперационной терапии (только гормонотерапия или гормонотерапия и адъювантная полихимиотерапия). В связи с погрешностью измерения Индекса рецидивирования выделена «серая зона». «Серая зона» представляет собой диапазон значений Индекса рецидивирования, в который могут попадать как пациенты с риском рецидива, так и без риска рецидива. В качестве погрешности измерения Индекса рецидивирования использовано среднее значение среднеквадратичного отклонения с учётом 95% доверительного интервала. Примечание - Граница «серой зоны» установлена как ±10% от разделяющего значения 50%. Для «серой» зоны выдаётся заключение «умеренный риск». Любое сомнение должно расцениваться в пользу пациента и, соответственно, разумнее этим пациентам назначать химиотерапию, в связи с этим по клиническому принципу данные пациенты отнесены в группу высокого риска. Алгоритм вычисления Индекса рецидивирования приведён в Приложении 3 к данной Инструкции. 2.4 Время проведения анализа - от 6 ч (с учётом пробоподготовки). математической точки зрения Индекс рецидивирования является значением граничной функции уровней представленности транскриптов ключевых генов. Общее назначение данной функции состоит в анализе связи между несколькими независимыми переменными. Значением функции является вероятность того, что полученный профиль экспрессии соответствует профилю экспрессии при высоком риске рецидива заболевания. Для вычисления Индекса рецидивирования используются методы многофакторного анализа, при которых разделяющее значение вероятности рецидивирования рака молочной железы, классифицирующее образцы высокого и низкого риска, соответствует уровню 50%. В частности, разделяющее значение при использовании метода логистической регрессии составляет 0,5 или 50%; при использовании дискриминантного анализа разделяющее значение классифицирующей линейной дискриминантной функции составляет 0, что в пересчете на вероятность, как функцию сигмоиды, составляет 50%. --- стр. 11 --- ^^^ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Глобал Индекс РМЖ Лист 11 Листов 33 3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА 3.1 Специфичность анализа В таблице 2 приведен перечень мРНК генов, выявляемых с помощью набора реагентов Глобал Индекс РМЖ. Таблица 2 - Перечень мРНК генов, выявляемых с помощью набора реагентов Глобал Индекс РМЖ. Номер пробирки В Стрипе 1 2 3 4 5 6 7 8 Стрип № 1 Наименование мРНК гена SCGB2A2 BCL2 BIRC5 NDRG1 MKI67 ERBB2 BAG1 CCNB1 Стрип № 2 Наименование мРНК гена CTSL2 MYC CCND1 CD68 TERT PTEN P43R ESR1 Стрип № 3 Наименование мРНК гена GRB7 AURKA MYBL2 CDKN2A ММРП В2М HPRT1 GUSB В образцах биологического материала человека, содержащих мРНК исследуемого гена, после реакции обратной транскрипции и после заверпзения реакции амплификации программное обеспечение детектирующих амплификаторов определяет индикаторный цикл и концентрацию транскрипта. Вклад геномной ДНК в результат исследования. В обр£13цах биологического материала человека, содержащих геномную ДНК человека, без реакции обратной транскрипции после завершения реакции амплификации программное обеспечение прибора не определяет индикаторный цикл и наличие транскрипта. Фоновая амплификация на матрице геномной ДНК в пределах 1-2 Ig не вносит вклад в конечный результат исследования. Риск интерференции На результат иеследования может оказать влияние наличие в образце большого количества здоровой ткани, некротизированной ткани, значительное количество примесей крови. Допускается присутствие в образце 10-20 % клеток стромы нормальной и некротизированной ткани молочной железы и примесей крови. В образцах должно присутствовать не менее 80 % опухолевых клеток. --- стр. 12 --- ,»-^ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 12 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 3.2 Чувствительность анализа Чувствительность набора реагентов составляет 1000 копий/мл. Для достоверного определения уровня экспрессии всех генов количество мРНК гена В2М должно быть не менее 10000 копий/мл (что соответствует показанию прибора более 4,0 Ig, Ср не более 31,5). При меньшем количестве мРНК гена В2М результат определения уровня экспрессии всех генов считается недостоверным. В случае отрицательного результата на наличие экспрессии кДНК референсных генов GUSB и HPRT1 или значении Ср более 37 цикла результат также считают недостоверным. 3.3 Диагностические характеристики Группа пациенток с программой послеоперационного лечения, включавшей только гормонотерапию (тамоксифен) (88 образцов): Чувствительность (95%ДИ) = 87,5% (76,0-98,9); Специфичность (95%ДИ) = 89,3% (81,2-97,3); Предсказательная ценность положительного результата (95%ДИ) = 82,3% (69,5-95,1); Предсказательная ценность отрицательного результата (95%ДИ) = 92,6% (85,6-99,6). Группа пациенток, пациента с программой адьювантной терапии, включавшей комбинацию гормонотерапии и адьювантной полихимиотерапии (124 образца): Чувствительность (95% ДИ) = 87,2% (76,7-97,7); Специфичность (95% ДИ) = 90,6% (84,4-96,8); Предсказательная ценность положительного результата (95% ДИ) = 81,0% (69,0-92,8); Предсказательная ценность отрицательного результата (95% ДИ) = 93,9% (88,7-99,0). --- стр. 13 --- ^ ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 13 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно биологические ПЦР исследования клинического материала с соблюдением методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», требований ГОСТ Р 52905 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности» и с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-ГУ групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Исследуемые образцы рассматриваются как потенциально-опасные. К работе с набором реагентов допускается только персонал, обученный методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико-диагностической лаборатории. При работе с набором следует надевать одноразовые перчатки без талька. Использовать только новые наконечники и пробирки. Приготовление реакционной смеси следует проводить в ПЦР-боксах. Этап ПЦР в реальном времени следует проводить в помещении, снабженном комплектами полуавтоматических или автоматических дозаторов, халатами и прочими принадлежностями. / Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, халаты, головные уборы и пр., а также растворы реагентов должны быть строго стационарными. Запрещается их перемещение из одного помещения в другое. Дозаторы должны быть соответствующим образом поверены (в аккредитованных лабораториях) и промаркированы. Поверхноети рабочих етолов, а также помещений, в которых проводится ПЦР, следует обязательно, до и после проведения работ, облучать бактерицидными облучателями в течение 30 минут. Использованные одноразовые принадлежности (пробирки, наконечники) должны сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раетвор. ВНИМАНИЕ! Удалять отходы с продуктами ПЦР необходимо только в закрытом виде. Не допускается открывать пробирки после амплификации. Все поверхности в лаборатории (рабочие столы, штативы, оборудование и др.) ежедневно подвергают влажной уборке с применением дезинфицирующих/моющих средств, регламентированных санитарными правилами СП 1.3.2322-08. При использовании набора в клинико-диагностической лаборатории образуются отходы классов А и Б, которые классифицируются и утилизируются в соответствии с --- стр. 14 --- .^■^ЛИК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 14 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». Не допускается использовать набор реагентов: - при нарушении условий транспортирования и хранения; - при несоответствии внешнего вида реагентов; - при нарушении внутренней упаковки компонентов набора; - по истечению срока годности. Примечание - Набор реагентов не содержит материалы биологического происхождения, веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным действием, а также влияющих на репродуктивную функцию человека. При использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности является безопасным. --- стр. 15 --- ,^ ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 15 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ При работе с набором реагентов необходимо оборудование и материалы, приведенные в таблице 3. Таблица 3- Материалы, оборудование и реагенты Оборудование и материалы Вариант фасовки S А ПЦР-бокс да да детектирующий амплификатор: «ДТпрайм» или «ДТлайт», да да или «ДТ-96»* да нет устройство дозирующее, например ДТстрим нет да устройство герметизирующее, например ДТпак нет да термостат программируемый, например ТТ-1-«ДНК-Техн.» да да холодильник с морозильной камерой да да микроцентрифуга-вортекс да да центрифуга для микропланшет ПЦР нет да центрифуга типа Eppendorf да да дозаторы переменного объёма со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2,0-20 мкл, 20- 200мкл, 100-1000 мкл да да наконечники вместимостью 1,0-20 мкл с фильтром да нет наконечники вместимостью 20-200 мкл с фильтром да да микропланшет ПЦР (384 лунки) нет да полимерная термопленка для запаивания микропланшета нет да штатив «рабочее место» для стрипованных пробирок объёмом 0,2 мл да да ёмкостъ с дезинфицирующим раствором для сброса использованных наконечников, пробирок и других расходных да да материалов комплект для выделения РНК из биологического материала да да вода деионизованная (используется в качестве да да отрицательного контрольного образца) перчатки медицинские (неопудренные /текстурированные да да /одноразовые) программное обеспечение для амплификаторов детектирующих да да ini файл с параметрами анализа «Global Index BC.ini» да да * указаны детектирующие амплификаторы, на которых были проведены испытания набора реагентов. --- стр. 16 --- ЛИК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 16 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ В качестве биологического материала используют образцы парафиновых срезов и нативной ткани молочной железы, полученные в результате оперативного вмешательства. Взятие, предобработку и хранение материала проводят в соответствии с инструкциями к комплектам реагентов для хранения и выделения РНК из биологического материала. 6.1 Взятие образцов и требования к биоматериалу Взятие материала осуществляется только врачом патоморфологом. Для приготовления срезов используют чистое, острое лезвие микротома, отрезают 2 участка толщиной 10 мкн или 3-5 участка толщиной 5 мкн из предварительно обрезанного блока ткани, заключенной в парафин (приблизительная площадь среза 0,5-1,5 см^). Парафиновые срезы помещают в сухие пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл. Не следует превышать рекомендуемое количество ткани, т.к. избыток ткани, заключенной в парафин может снизить выход тотальной РНК. Для диагностики можно использовать образцы нативной ткани молочной железы. Взятие материала осуществляется только врачом патоморфологом. Удаленную оперативным путем опухоль визуально анализируют, выбирают фрагменты только из очага опухоли размером около 0,2-0,3 х 0,5-1,0 см. В образце должна отсутствовать нормальная и некротизированная ткань, посторонние примеси крови. Образцы нативной ткани опухоли молочной железы помещают в пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл, которые содержат транспортную среду для стабилизации мРНК. Материал соседних срезов и кусочков нативной ткани опухоли, предоставленный врачом патоморфологом, обязательно гистологически исследуется. В образцах должно присутствовать не менее 80% опухолевых клеток. Допускается присутствие в образце 10- 20% клеток стромы нормальной и некротизированной ткани молочной железы, примесей крови. Как правило, примеси крови в ткани молочной железы отсутствуют. 6.2 Выделение РНК Для выделения тотальной РНК из биологического материала рекомендуется использовать комплекты реагентов, обеспечивающие параметры качества выделенной тотальной РНК, указанные в п.6.3, (например, набор реагентов «ПРОБА-МЧ» в комплектации «ПРОБА-МЧ-НК», производства ООО «ДНК-Технология ТС», РУ № РЗН 2017/5753 от 22.05.2017г, или аналоги). При выделении из парафинизированной ткани обратите внимание на необходимость удаления парафина и последующей обработки образца протеиназой К, свободной от РНКаз. При выделении тотальной ткани используйте гомогенизацию в лизирующем растворе. Выделение проводят в соответствии с Инструкциями производителя. Рекомендуемый объём элюирующего раствора 100 мкл. --- стр. 17 --- ЛИК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 17 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 6.3 Оценка качества РНК При рутинном использовании набора качество выделенной РНК оценивают на основании значений пороговых циклов референсных генов (см.п.9.3, п.9.5). В случае несоответствия значений пороговых циклов результат интерпретируют как недостаточное количество материала или присутствие ингибиторов. Перед первым использованием набора в лаборатории или при повторяющихся недостоверных результатах исследования (см. п.9.3, п.9.5) рекомендуется провести оценку чистоты препарата тотальной РНК. Чистоту препарата тотальной РНК оценивают путём определения отношения А260/А280 (примеси белка) и А260/А230 (примеси органических соединений). В препарате хорошего качества соотношение А260/А280 составляет 1,8-2,2, соотношение А260/А230 >2. Оптическую плотность при 260, 280 и 230 нм измеряют, проанализировав небольшую аликвоту образца (1-2 мкл) с использованием спектрофотометра, например NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Размер молекул тотальной РНК не имеет критического значения. Длина ампликонов, получаемых в амплификации с использованием предлагаемого набора реагентов, составляет около 100 нуклеотидов, в реакции обратной транскрипции используются специфические олигонуклеотиды. В результате деградации в парафинизированных образцах большая часть РНК имеет длину 100-300 оснований, пики 18S и 28S рРНК не детектируются, что приемлемо для ОТ-ПЦР с короткими ампликонами. Реакцию обратной транскрипции рекомендуется поставить сразу после выделения РНК. Остаток образца РНК рекомендуется хранить при температуре минус 20 °С в течение одного месяца или минус 70 °С в течение одного года. --- стр. 18 --- Л днк-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Глобал Индекс РМЖ Лист 18 Листов 33 7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1 Подготовка и проведение обратной транскрипции 7Л.1 Промаркируйте для каждого исследуемого образца по две пробирки объёмом 0,5 мл и одну пробирку для отрицательного контрольного образца (К-). 7Л .2 Разморозьте содержимое пробирок ОТ-буфер и Праймеры ОТ-Глобал Индекс РМЖ + дНТФ для обратной транскрипции при комнатной температуре от 18°С до 25 °С, затем встряхните пробирки в течение 3-5 с и центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 3-5 с на микроцентрифуге-вортексе. 7Л.З Приготовьте ОТ-смесь. Смешайте в отдельной пробирке: 4.0 X (N+1) мкл ОТ-буфера, 2.0 X (N+1) мкл праймеров ОТ-Глобал Индекс РМЖ +дНТФ, 1.0 X (N+1) мкл обратной транскриптазы, где N - количество анализируемых образцов с учётом дублей и К-. Примечание - В связи с вязкостью раствора и его малым количеством комплектация осуществляется с запасом обратной транскриптазы. При приготовлении ОТ-смеси строго следуйте Инструкции, не допуская переизбытка отдельных компонентов смеси. 7.1.4 Встряхните пробирку на вортексе и центрифугируйте при 1000 - 3000 об/мин в течение 3-5 с. 7.1.5 Добавьте в промаркированные пробирки по 7,0 мкл ОТ-смеси. 7.1.6 Внесите в пробирки с ОТ-смесью по 33 мкл соответствующего образца РНК, используя отдельные наконечники для каждого образца. В пробирку К- РНК не вносится. 7.1.7 В пробирку, маркированную «К-», внесите 33 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего этап выделения РНК. Примечание - во избежание контаминации рекомендуется вносить образцы РНК наконечниками с фильтром. 7.1.8 Встряхните пробирки на вортексе в течение 3-5 с и осадите капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с. 7.1.9 Поместите пробирки в термостат и инкубируйте при 40 °С в течение 30 мин, затем прогрейте при 95 °С в течение 5 минут. Примечание - рекомендуется использовать программируемые термостаты с прижимной крышкой (например, ТТ-1-«ДНК-Техн.» производства ООО «НПО ДНК-Технология»). --- стр. 23 --- / ^ ЛНК-ТЕХИОЛОГНЯ Инструкция по применению Лист 23 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 9.5 в случае отрицательного результата на наличие экспрессии кДНК референсных генов GUSB и HPRT1 (отсутетвие индикаторного цикла) или значении Ср более 37 цикла результат считают недостоверным. В этом случае необходимо повторить исследование данного образца. Недостоверный результат может быть связан с недостаточным количеством материала, присутствием ингибиторов в препарате мРНК, полученном из биологического материала; неверным выполнением протокола анализа, несоблюдением температурного режима амплификации и др. В этом случае требуется либо повторная постановка амплификации препарата кДНК, либо повторное выделение мРНК (выполняется последовательно). 9.6 Для положительных контрольных образцов должен регистрироваться экспоненциальный роет флуоресценции по каналу Fam (указано значение индикаторного цикла). При отсутствии экспоненциального роста флуоресценции (отсутствие индикаторного цикла) результаты считают недостоверными. В этом случае требуется повторная постановка амплификации всей партии образцов. 9.7 В отрицательных контрольных образцах экспоненциальный рост флуоресценции по каналу Fam должен отсутствовать. При регистрации экспоненциального роста флуоресценции по каналу Fam (указано значение индикаторного цикла), результаты всей постановочной серии считают недостоверными. В этом случае необходимо проведение специальных мероприятий для устранения контаминации. 10 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Значения индикаторных циклов мРНК исследуемых генов (п.9.4), полученных в результате исследования, используют для расчёта прогностического Индекса рецидивирования. Расчёт прогностического Индекса рецидивирования рака молочной железы проводят е учётом планируемой послеоперационной терапии (только гормонотерапия или гормонотерапия и адъювантная полихимиотерапия) в соответствии с алгоритмом, приведённом в Приложении 3 к Инструкции (разработан ООО «Гамма Глобал РД»). Оценку прогностического Индекса рецидивирования рака молочной железы проводят с учётом планируемой послеоперационной терапии (только гормонотерапия или гормонотерапия и адъювантная полихимиотерапия) в соответствии с таблицей 5. Пример полученных результатов и заключения о риске рецидива приведены в таблице 6. --- стр. 24 --- , ^ ДИК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 24 1 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 Таблица 5 Интерпретация Индекса рецидивирования с учётом планируемой послеоперационной терапии Только гормонотерапия (ГТ) Гормонотерапия и адъювантная полихимиотерапия (ГТ+АПХТ) Индекс рецидивирования, % Заключение о риске рецидива Индекс рецидивирования, % Заключение о риске рецидива <40 Низкий <40 Низкий 40-60 Умеренный* 40-60 Умеренный* >60 Высокий >60 Высокий 1 писка, так как любое• - хшцисгнив V -------------- сомнение должно расцениватьея в пользу пациента. Решение о планируемой терапии принимает врач на основании совокупных клинико-лабораторных данных о состоянии пациента. Значение прогностичеекого Индекса рецидивирования является дополнительным фактором для принятия решения о выборе послеоперационной терапии. Таблица 6 - Пример полученных результатов и заключения о риске рецидива ____________ 2. Перед проведением расчёта необходимо проверить выполнение 1. Получены следующие значения индикаторных циклов при исследовании образца (для двух Параметр Ср _____Ср_ SCGB2A2 27,2 26,6 CTSL2 35,1 35,3 BCL2 35,7 35 МУС 29,7 29,7 BIRC5 37,1 41,8 CCND1 29,7 29,6 NDRG1 - - CD68 33,5 33,8 MKI67 35,1 35,3 TERT 35,4 36,7 ERBB2 25,6 25,4 PTEN 31,5 31,9 BAG1 32,4 32,6 PGR 34,6 34,5 CCNB1 33,6 33,9 ESR1 28,7 28,9 GRB7 28,1 27,6 MMP11 31,1 31,2 AURKA 36,1 37,1 В2М 24,8 25,2 MYBL2 31,6 31,6 HPRT1 33,3 33,8 CDKN2A 32,6 32,2 GUSB 32,6 32 3. условия валидности исследования по значениям референсных генов: В2М (Ср)<31,5, GUSB(Cp)<37, HPRTl(Cp)<37 (п.9.3, 9.5) По алгоритму, приведённому в Приложении 3, получены следующие значения Индекса рецидивирования для указанного образца: Индекс рецидивирования ГТ,% Индекс рецидивирования ГТ+АПХТ,% 88,6 16,1 В соответствии с таблицей 5 результат интерпретируется следующим образом: Индекс рецидивирования ГТ - 88,6% (>60%) Индекс рецидивирования ГТ+АПХТ = 16,1% (<40%) Заключение: Высокий риск рецидива, если пациентке будет назначена только гормонотерапия. Низкий риск рецидива, если пациентке будет назначена гормонотерапия в сочетании с адъювантной полихимиотерапией. --- стр. 25 --- т / / ^"^ЛИК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 25 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 11 ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ, ХРАНЕНИЕ И ЭКСПЛУАТАЦИЯ 11.1 Транспортирование 11.1.1 Транспортирование набора осуществляют в термоконтейнерах е хладоэлементами всеми видами крытого транспорта при температурах, соответствующих условиям хранения компонентов, входящих в соетав набора. 11.1.2 Наборы реагентов, транспортированные с нарушением температурного режима, применению не подлежат. 11.2 Хранение 11.2.1 Компоненты набора в фасовке S следует хранить: смееи для амплификации, запечатанные парафином Стрип №1, Стрип №2, Стрип №3, буфер для разведения ДНК, положительный контрольный образец и крышки для стрипов при температуре от 2°С до 8°С в холодильных камерах или в холодильниках в течение всего срока годности; - праймеры ОТ-Глобал Индекс РМЖ + дНТФ, ОТ-буфер, обратную транскриптазу, Taq-полимеразу, ПЦР-буфер и минеральное масло при температуре от минус 18°С до минус 22°С в морозильных камерах в течение всего срока годности. 11.2.2 Компоненты набора в фасовке А следует хранить: емееи для амплификации Стрим, ПЦР-буфер Стрим, буфер для разведения ДНК, положительный контрольный образец, стрипы по 8 пробирок и крышки для стрипов при температуре от 2°С до 8°С в холодильных камерах или в холодильниках в течение всего срока годности; - праймеры ОТ-Глобал Индекс РМЖ + дНТФ, ОТ-буфер, обратную транскриптазу, полимеразу TexHoTaq МАХ при температуре от минус 18°С до минус 22°С в морозильных камерах в течение веего срока годности. 11.3 Указания по эксплуатации 11.3.1 Набор должен применяться согласно действующей вереии утвержденной инструкции по применению. 11.3.2 После вскрытия упаковки компоненты набора следует хранить при следующих условиях: смеси для амплификации, запечатанные парафином, смееи для амплификации Стрим еледует хранить в занщщенном от света месте в течение всего срока годности набора при температуре от 2 °С до 8 °С в холодильных камерах или в холодильниках в течение всего срока годности набора; --- стр. 26 --- ^■•^ЯНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 26 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 буфер для разведения ДНК, ПЦР-буфер, минеральное масло, положительный контрольный образец, стрипы по 8 пробирок и крышки для стрипов следует хранить при температуре от 2 °С до 8 °С в холодильных камерах или в холодильниках в течение всего срока годности набора. - праймеры ОТ-Глобал Индекс РМЖ + дНТФ, ОТ-буфер, обратную транскриптазу, Taq-полимеразу, полимеразу TexHoTaq МАХ, следует хранить при температуре от минус 18 °С до минус 22 °С С в морозильных камерах в течение всего срока год ности набора. Допускается хранение ПЦР-буфера и минерального масла при температуре от минус 18 °С до минус 22 °С в течение всего срока годности набора и их многократное замораживание/оттаивание. 12 УКАЗАНИЯ ПО УТИЛИЗАЦИИ 12.1 При использовании набора в клинико-диагностической лаборатории образуются отходы классов А и Б, которые классифицируются и утилизируются в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». 12.2 Наборы, пришедшие в непригодность, в том числе, в связи с истечением срока годности и неиспользованные реактивы, относятся к классу Б и подлежат утилизации в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790 и МУ 1.3.2569. 12.3 Упаковка набора реагентов (коробки, грипперы) после использования по назначению, относится к отходам класса А и утилизируется с бытовыми отходами. 13 ГАРАНТИИ ИЗГОТОВИТЕЛЯ 13.1 Предприятие-изготовитель гарантирует соответствие набора реагентов требованиям технических условий при соблюдении условий транспортирования, хранения и эксплуатации, установленных настоящими техническими условиями. 13.2 Срок годности набора реагентов — 12 месяцев при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и эксплуатации. 14 РЕМОНТ И ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБСЛУЖИВАНИЕ 14.1 Набор реагентов предназначен для одноразового использования и не подлежит техническому обслуживанию и текущему ремонту. --- стр. 27 --- Л днк-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 27 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 15 символы, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ МАРКИРОВКЕ НАБОРА |lVD| Только для in vitro диагностики Дата производства Температурный диапазон т Содержит инструкцию по применению V Количество определений [ref] Каталожный номер Годен до iJ Адрес производителя LOT Серия набора Не допускается воздействие солнечного света 16 ПЕРЕЧЕНЬ ПРИМЕНЯЕМЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ ГОСТ 2.105-95 Общие требования к текстовым документам. ГОСТ ISO 14971-2011 Изделия медицинские. Применение менеджмента риска к медицинским изделиям. ГОСТ Р 15.309-98 Система разработки и постановки продукции на производство. Испытания и приёмка выпускаемой продукции. Основные положения. ГОСТ Р 51088-2013 Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест-системы, контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и поддерживающей документации. ГОСТ Р 51352-2013 Медицинские изделия для диагностики ин витро. Методы испытаний. ГОСТ Р 53022.3-2008 Требования к качеству клинических лабораторных исследований, Ч.З. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов. ГОСТ Р ИСО 18113-1-2015 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины, определения и общие требования. ГОСТ Р ИСО 18113-2-2015 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 2. Реагенты для диагностики in vitro для профессионального применения. ГОСТ Р ИСО 23640-2015 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Оценка стабильности реагентов для диагностики in vitro ГОСТ Р ИСО 15223-1-2014 Изделия медицинские. Символы, применяемые при маркировании на медицинских изделиях, этикетках и в сопроводительной документации. Ч. 1. Основные требования. ГОСТ Р 52905-2007 (ИСО 15190:2003) Лаборатории медицинские. Требования безопасности. Примечание - Указанные выше стандарты были действующими на момент утверждения инструкции по применению. В дальнейшем, при пользовании документом, целесообразно проверить действие ссылочных нормативных документов на текущий момент. Если ссьшочный документ заменён или изменён, то при применении настоящего документа следует пользоваться заменённым (изменённым документом). --- стр. 28 --- f , ^ ДИК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 28 Глобал Индекс РМЖ Листов 33 7 АДРЕС ДЛЯ ОБРАЩЕНИЯ Производство наборов реагентов имеет еертифицированную сиетему менеджмента качеетва и соответствует требованиям стандартов систем менеджмента качества ISO 9001 в области разработки, производства и продажи IVD реагентов и приборов для медицинской молекулярно-генетической диагностики и другого лабораторного применения и EN ISO 13485 в области разработки, производства и продажи IVD реагентов и приборов для медицинской молекулярно-генетической диагностики. Производитель; Общество с ограниченной ответственностью «ДНК-Технология ТС»; ООО «ДНК-Технология ТС», Россия. Адрес производителя: ООО «ДНК-Технология ТС», Россия, 117246, г. Москва, Научный проезд, д. 20, стр. 4. Место производства: ООО «ДНК-Технология ТС», Росеия, 117246, г. Москва, Научный проезд, д. 20, стр.4. Рекламации по вопросам качества набора реагентов Глобал Индекс РМЖ, следует направлять по адрееу: ООО «ДНК-Технология», 117587, г. Москва, Варшавское шоссе, д. 125 ж, К.6., тел./факе +1 (495) 640-17-71, www.dna-technologYT u Служба клиентской поддержки: 8 (800) 200-75-15 (звонок по России бесплатный). E-mail: hotline@dna-technology.ru Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК-Технология»: http://www.dna-technology.ru/customer_support/ Старший научный сотрудник ООО «НПФ ДНК-Технология», д.б.н. О.В. Бурменская « 2019г. Заведующий отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ «РНЦРР» Минздрава РФ, Д.М.Н., профессор СОГЛАСОВАНО Директор ФГБУ «РНЦРР» Минздрава Академик РАН, д.м.н., профе' В.К. Боженко « j j t » 2019г. В.А. Солодкий « J J L » 2019г.