Набор реагентов для выявления в клиническом материале ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска и их дифференциации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени "Онко-HPV" по ТУ 9398-012-01058639-2016 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор ООО <^Адьфалаб» М.А.Суворова 2018г. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления в клиническом материале ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска и их дифференциации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. «Онко-HPV» для диагностики in vitro ВНИМАНИЕ! Изучите инструкцию перед началом работы --- стр. 2 --- ОГЛАВЛЕНИЕ 1. 2. 2. 1. 2. 2. 2.3. 2.4. 3. 4. 5. 6. 7. 7.1. 7.1.1. 7.1.2. 7.1.3. 7.2. 7.2.1. 7.2.1.1. 7.2.1.2. 7.2.1.3. 7.2.2. 7.2.2.1. 1 2 2 1. 1 2.1 . Ъ . 7.2.2.4. 7.2.2.3. 8. 9. НАЗНАЧЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ПРИНЦИП МЕТОДА АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛБЗОВАНИЮ МАТЕРИАЛА ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 4 4 4 6 7 8 9 9 11 АНАЛИЗИРУЕМОГО 12 13 ПЕРВЫЙ ЭТАП - ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАЛИЧИЯ/ОТСУТСТВИЯ ДНК ВПЧ БЕЗ 13 ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПА ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРВОГО ЭТАПА АМПЛИФИКАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА ДЛЯ ФОРМЫ 1 (SCR/TYP) ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ ПЦР-АМПЛИФИКАЦР1Я ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ТИПА ВПЧ РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ ДЛЯ ПРОВЕРКИ КАЧЕСТВА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК И КОНТРОЛЯ ВЗЯТИЯ МАТЕРИАЛА РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ НАБОРА УКАЗАНИЯ ПО УТИЛИЗАЦИИ 13 14 АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРВОГО ЭТАПА 15 АМПЛИФИКАЦИИ ВТОРОЙ ЭТАП. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ТИПА ВПЧ 16 16 16 17РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ВТОРОГО ЭТАПА АМПЛИФИКАЦИИ АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ВТОРОГО ЭТАПА 18 АМПЛИФИКАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА ДЛЯ ФОРМЫ 3 (ТУР) 19 19 20 21 22 22 24 24 --- стр. 3 --- 10. ГАРАНТИИ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ 25 26 26 --- стр. 4 --- Набор реагентов «Онко-HPV» предназначен для качественного обнаружения в образцах биоматериала человека ДНК вирусов папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска и их дифференциации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Материалом для исследования являются мазки из урогенитального тракта (соскоб эпителия цервикального канала, соскоб эпителия с поверхности шейки матки, соскоб эпителия уретры). С использованием набора реагентов возможно выявление ДНК ВПЧ, принадлежащих к следующим типам: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73. Перечисленные типы ВПЧ обладают высокой трансформирующей активностью в отнощении эпителиальных клеток и могут являться этиологическим фактором развития цервикальных дисплазий и рака шейки матки. Целевая группа пациентов - женщины и мужчины 25 - 65 лет. Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика, научные исследования. Только для исследований in vitro. 1. НАЗНАЧЕНИЕ 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ 2.1. ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ. Набор реагентов выпускается в трёх формах комплектации. Форма 1 (SCR/TYP) включает: Реагенты для первого этапа амплификации (скрининг): - смесь для амплификации «HPV-скрин», запечатанная воском - раствор Taq-полимеразы «Taq - скрин» - положительный контрольный образец ПКО-скрин - отрицательный контрольный образец (ОКО) Реагенты для второго этапа амплификации (дифференциация типа ВПЧ): - 12 стрипов по 8 пробирок, содержащих амплификационные смеси для дифференциации типа ВПЧ (специфичность амплификационных смесей согласно рис. 1) - раствор Taq-полимеразы «Taq -тип» - комплект положительных контрольных образцов «ПКО-тип», состоящий из восьми положительных контрольных образцов в соответствии с количеством и специфичностью амплификационных смесей для дифференциации типа ВПЧ (ПКО HPV35/18, ПКО HPV16/31, ПКО HPV45/33, ПКО HPV52/56, ПКО HPV59/66, ПКО HPV39/58, ПКО --- стр. 5 --- HPV51/68, ПКО HPV53/73); - отрицательный контрольный образец (ОКО) Форма 2 (SCR) включает: Реагенты для первого этапа амплификации (скрининг): - смесь для амплификации «HPV-скрин», запечатанная воском - раствор Taq-полимеразы «Taq - скрин» - положительный контрольный образец ПКО-скрин - отрицательный контрольный образец (ОКО) Форма 3 (TYP) включает: Реагенты для второго этапа амплификации (дифференциация типа ВПЧ): - 12 стрипов по 8 пробирок, содержащих амплификационные смеси для дифференциации типа ВПЧ (специфичность амплификационных смесей согласно рис. 1) - раствор Taq-полимеразы «Taq -тип» - комплект положительных контрольных образцов «ПКО-тип», состоящий из восьми положительных контрольных образцов в соответствии с количеством и специфичностью амплификационных смесей для дифференциации типа ВПЧ (ПКО HPV35/18, ПКО HPV16/31, ПКО HPV45/33, ПКО HPV52/56, ПКО HPV59/66, ПКО HPV39/58, ПКО HPV51/68, ПКО HPV53/73); - отрицательный контрольный образец (ОКО) Реагенты для проверки качества выделения ДНК и взятия биологического материала: - смесь для амплификации «ВК» - раствор Taq-полимеразы «Taq - ВК» - Положительный контрольный образец ПКО-ВК Форма 1 (SCR/TYP) набора реагентов позволяет выполнить двухэтапное исследование. На первом этапе определяется наличие/отсутствие ДНК ВПЧ одного из следующих типов: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73; дифференциация типа вируса на данном этапе не проводится. Второй этап исследования необходим только для проб, положительных по результатам проведения первого этапа исследования и осуществляется для определения принадлежности вируса к одному из перечисленных типов. Количество определений: 50 образцов, включая положительные и отрицательные контрольные образцы для первого этапа исследования и по 12 образцов для каждого типа ВПЧ при проведении второго этапа исследования, включая положительные и отрицательные контроли. --- стр. 7 --- Раствор Taq-полимеразы «Taq -тип» 250 4 пробирки Комплект положительных контрольных образцов «ПКО-тип» 20 8 пробирок по 1 пробирке ПКО каждой специфичности Отрицательный контрольный образец (ОКО) 50 2 пробирки Реагенты для проверки качества выделения ДНК и взятия биологического материала Смесь для амплификации «ВК» 10 12 пробирок, запечатанных воском Раствор Taq-полимеразы «Taq - ВК» 130 1 пробирка Положительный контрольный образец «ПКО-ВК» 30 1 пробирка объемом 0,5 мл 2.3. ПРИНЦИП МЕТОДА Для выявления ДНК ВПЧ используется амплификация специфических участков вирусного генома методом ПЦР с применением специфических олигонуклеотидов и меченых олигонуклеотидных зондов Taqman. В ходе проведения первого этапа амплификации (скрининг) детектируются специфические фрагменты ДНК ВПЧ, принадлежащих к группе папиллом высокого канцерогенного риска (при условии их присутствия в исходном клиническом материале). ПЦР-смесь «HPV-скрин», предназначенная для проведения данного этапа исследования, содержит олигонуклеотиды, специфичные к участкам ДНК вируса папилломы всех определяемых типов, а также олигонуклеотиды, специфичные к участкам гена В-глобина человека, что позволяет одновременно контролировать качество взятия биологического материала и избежать получения ложноотрицательных результатов, обусловленных ошибками на этапе забора материала и выделения ДНК. При проведении первого и второго этапов амплификации для получения специфических фрагментов ДНК ВПЧ и гена В-глобина человека используются олигонуклеотиды и меченые олигонуклеотидные зонды Taqman. В присутствии фермента Taq-полимеразы происходит гибридизация олигонуклеотидов и зонда с комплементарным участком ДНК-мишени. Образование специфического продукта амплификации сопровождается отщеплением флуоресцентной метки (благодаря наличию у Taq- полимеразы 5’- экзонуклеазной активности) и появлению детектируемого флуоресцентного сигнала, регистрация которого проводится в режиме реального времени. Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна количеству продуктов амплификации и, следовательно, нарастает с каждым последующим циклом. Олигонуклеотидные зонды, используемые для детекции ДНК ВПЧ и детекции фрагмента ДНК человека (внутренний контроль) на этапе скрининга имеют флуоресцентные метки с разными спектрами поглощения и испускания, что позволяет проводить одновременную 7 --- стр. 8 --- регистрацию флуоресценции по двум каналам (FAM и HEX). На втором этапе амплификации в каждой из восьми пробирок стрипа объединены две смеси, каждая из которых содержит олигонуклеотиды, специфичные к определенному типу ВПЧ, и зонды, содержащие метку FAM (для одного из типов) и метку HEX (для другого типа). Набор предназначен для использования на амплификаторах детектирующих для постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (MiniOpticon, BioRad; ДТ-96 или другие амплификаторы с аналогичными техническими характеристиками). 2.4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Аналитическая чувствительность. Нижний предел аналитической чувствительности набора реагентов при проведении первого (скрининг) и второго (дифференциация типа ВПЧ) этапов исследования составляет 1000 копий/мл (1000 копий целевой ДНК в пробе, полученной методом экстракции из первичного биологического материала). Указанный уровень аналитической чувствительности обеспечивает детекцию клинически значимого уровня вирусной нагрузки. Пороговой в отношении трансформирующей активности считается концентрация ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска, составляющая 10^5 ГЭ в соскобе или 10^3 ГЭ на 10^5 эпителиальных клеток человека. Аналитическая специфичность. Специфичность анализа при постановке теста с применением реагентов первого этапа амплификации (скрининг) набора «Онко-HPV» подтверждена: - отсутствием регистрации экспоненциального роста флуоресцентного сигнала по каналам FAM и HEX в отрицательных контрольных образцах; - методом секвенирования продуктов амплификации; - отсутствием регистрации экспоненциального роста флуоресцентного сигнала в образцах, не содержащих ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска. Специфичность анализа при постановке теста с применением реагентов второго этапа амплификации (дифференциация типа ВПЧ) набора «Онко-HPV» подтверждена: - отсутствием регистрации экспоненциального роста флуоресцентного сигнала по каналам FAM и HEX в отрицательных контрольных образцах; - методом секвенирования продуктов амплификации; - отсутствием неспецифических перекрестных реакций при тестировании образцов, содержащих ДНК разных типов ВПЧ, включая ВПЧ низкого онкогенного риска. Диагностическая чувствительность. Набор «Онко-HPV» позволяет выявить ДНК 16-ти генотипов ВПЧ высокого канцерогенного риска. Диагностическая чувствительность первого этапа амплификации (скрининг) и второго этапа амплификации 8 --- стр. 9 --- (дифференциация типа ВПЧ) определяется на этапе клинических испытаний, количественный расчёт показателей производится по формуле Бернулли с доверительной вероятностью 90%. Диагностическая специфичность. Диагностическая специфичность рассчитывается на основе данных, полученных в ходе клинических испытаний на выборке клинических образцов; расчёт показателя производится по формуле Бернулли с доверительной вероятностью 90%. При проведении первого этапа исследования (скрининг) в 0,5% случаев могут наблюдаться неспецифические перекрестные реакции, обусловленные присутствием в биологическом образце ДНК типов ВПЧ с неустановленной степенью онкогенности (42, 62, 67,101). 3. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 3.1. Потенциальный риск применения набора- класс 26 (Приказ М3 России от 06.06.2012 № 4н). 3.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. 3.3. Меры предосторожности - соблюдение правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». 3.4. Утилизация отходов производится в соответствии с СанПиН N2.1.7.2790-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами", сбор отходов осуществляется в одноразовые пакеты желтого цвета, предназначенные для утилизации медицинских отходов класса Б (ГОСТ Р 50962-96). 4. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ Первый этап амплификации - определение наличия/отсутствия ДНК ВПЧ без дифференциации типа (скрининг) Для постановки ПЦР-реакции необходимы: - Реагенты для проведения первого этапа амплификации набора реагентов «Онко-HPV»; -ПЦР-бокс с УФ-лампой; - штатив «рабочее место» для пробирок объемом 0,2 мл; -микроцентрифуга-вортекс на 1500 - 3000 об/мин; 9 --- стр. 13 --- 7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 1 Анализ образцов включает следующие этапы: • Пробоподготовка (выделение ДНК из образцов клинического материала). • Первый этап амплификации - определение наличия/отсутствия ДНК ВПЧ без дифференциации типа (скрининг). • Второй этап амплификации - дифференциация типа ВПЧ (необходим для образцов, для которых получен положительный результат при проведении первого этапа амплификации). ВНИМАНИЕ! Комплект реагентов для выделения ДНК из биологического материала не входит в состав набора Для выделения ДНК из клинических образцов рекомендуется использовать комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ», зарегистрированный в РЗН РФ и предназначенный для применения в клинической лабораторной диагностике при анализе мазков из урогенитального тракта. Экстракцию ДНК проводят согласно инструкции производителя набора. Не рекомендуется использование экспресс-методов выделения ДНК, так как это может приводить к значительному снижению диагностической чувствительности набора и получению ложноотрицательных результатов. 7.1. Первый этап - определение наличия/отсутствия ДНК ВПЧ без дифференциации типа. 7.1.1. ПЦР-амплификация ! Важно: Общий объем пробы ДНК, выделенной из анализируемого клинического образца, достаточный для проведения первого и второго этапа исследования - не менее 50 мкл. На первом этапе исследования анализ образца предполагает постановку одной реакции - с использованием смеси «HPV-скрин» и раствора Taq-полимеразы «Taq-скрин». Общий объём реакционной смеси - 25 мкл, включая объём пробы ДНК - 5 мкл. Проведение исследования: 1. В штатив поставить: - пробирки со смесью для амплификации «HPV-скрин» из рассчета: одна пробирка - для каждого анализируемого образца, и по одной пробирке для положительного и отрицательного контролей); 13 --- стр. 14 --- 2 . В каждую пробирку, не повреждая слой воска, внести по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы «Taq-скрин»; 3. Закрыть крышки пробирок; 4. В пробирку со смесью для амплификации, подготовленную для отрицательного контроля, внести 5 мкл ОКО; 5. В пробирки со смесью для амплификации, подготовленные для анализируемых образцов, внести поочередно по 5 мкл исследуемого образца; 6. В пробирки со смесями для амплификации, подготовленные для положительного контроля, внести 5 мкл ПКО-скрин; 7. Установить все пробирки в блок детектирующего амплификатора; 8. Запустить программу амплификации в соответствии с параметрами, указанными в таблице 1. Внимание! Для предотвращения контаминации при внесении в пробирки реагентов, образцов ДНК и контрольных образцов рекомендуется использовать только одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами. Таблица 1. Каналы детекции продуктов амплификации и программа амплификации Специфический продукт РАМ Внутренний контроль HEX Температура Время Количество циклов 95°С 15 мин 1 95°С 12 сек 45°С 30 сек 5 60°С 60 сек 95°С 12 сек 45°С 30 сек 40 60°С 60 сек 10°С - хранение - детекция флуоресцентного сигнала 7.1.2. Регистрация результатов первого этапа амплификации Детекция продуктов амплификации проводится в режиме реального времени с использованием детектирующего ПЦР-амплификатора согласно инструкции к прибору. - по каналу РАМ регистрируется сигнал о накоплении специфического продукта амплификации - фрагмента ДНК одного или нескольких типов ВПЧ; - по каналу HEX регистрируется сигнал о накоплении продукта амплификации фрагмента гена 6-глобина человека (используется в качестве контроля взятия материала). 14 --- стр. 15 --- Учет результатов следует начинать с результатов амплификации положительных и отрицательных контрольных образцов. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции на соответствующем канале с пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct. Принцип интерпретации: Результаты анализа не учитываются, если: - Во время прохождения реакции детектирующий амплификатор не регистрирует экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу РАМ в пробирке с положительным контрольным образцом (ПКО-скрин). В данной ситуации необходимо повторное исследование образцов. - В пробирке с анализируемым образцом при проведении амплификации не регистрируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу HEX или величина порогового цикла Ct превышает 35. Для такого образца процедура исследования должна быть проведена повторно, начиная со стадии выделения ДНК. При повторении результата делается вывод о плохом качестве взятия клинического материала, образец должен быть взят повторно. - В пробирке с ОКО регистрируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу FAM и/или каналу HEX. Необходимо принятие мер для устранения контаминации в ПЦР-лаборатории и повторное исследование всех образцов. Результаты анализа учитываются, если - Во время прохождения амплификации регистрируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналам FAM и HEX в пробирке с ПКО-скрин; - Во время прохождения амплификации отсутствует флуоресцентный сигнал по каналам FAM и HEX в пробирке с отрицательным контрольным образцом; При соблюдении этих условий анализируемая проба считается положительной, если: - для пробы определены значения порогового цикла Ct по каналам FAM и HEX; - график нарастания флуоресценции имеет форму экспоненциальной кривой; - кривая флуоресценции по каналам FAM и HEX пересекает пороговую линию на участке экпоненциального роста. Получение положительного результата является основанием для заключения о наличии в анализируемом клиническом образце ДНК одного или нескольких типов ВПЧ высокого онкогенного риска. 7Л.З. Анализ и интерпретация результатов первого этапа амплификации 15 --- стр. 16 --- I Анализируемая проба считается отрицательной, если: - во время прохождения амплификации регистрируется флуоресцентный сигнал по каналу HEX; - во время прохождения амплификации отсутствует экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу РАМ. Получение отрицательного результата является основанием для заключения об отсутствии в анализируемом клиническом образце ДНК ВПЧ высокого онкогенного риска. 7.2. Второй этап. Дифференциация типа ВПЧ. 7.2.1. Последовательность проведения анализа для Формы 1 (SCR/TYP) 7.2.1.1. ПЦР-амплификация Второй этап исследования проводится только для проб, положительных по результатам проведения первого этапа исследования и осуществляется для определения принадлежности вируса к одному из следующих типов:16 , 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73. Анализ образца проводится в соответствии со схемой, приведенной в Таблице 2. Таблица 2. Схема расположения амплификационных смесей в стрипе и наименование FAM HEX Используемый ПКО Окрашенная смесь «HPV-35» «НРУ-18» ПКО 35/18 Прозрачная смесь «HPV-16» «HPV-31» ПКО 16/31 Прозрачная смесь «HPV-45» «HPV-ЗЗ» ПКО 45/33 Прозрачная смесь «HPV-52» «HPV-56» ПКО 52/56 Прозрачная смесь «HPV-59» «HPV-66» ПКО 59/66 Прозрачная смесь «HPV-39» «HPV-58» ПКО 39/58 Прозрачная смесь «HPV-51» «HPV-68» ПКО 51/68 Прозрачная смесь «HPV-53» «HPV-73» ПКО 53/73 Общий объём реакционной смеси - 25 мкл, включая объём пробы ДНК - 5 мкл. Для проведения данного этапа исследования необходимо, чтобы общий объем ДНК, выделенной из анализируемого образца, составлял не менее 45 мкл (по 5 мкл на 8 реакций) На втором этапе исследования анализ образца предполагает использование смесей «HPV-тип» и раствора Taq-полимеразы «Taq-тип». Проведение исследования: 1. В щтатив поставить необходимое количество стрипов со смесями для амплификации из расчёта п + 2, где п - количество анализируемых образцов, два дополнительных стрипа предназначены для анализа положительных и отрицательных контрольных образцов. 16 --- стр. 17 --- 2. Во все пробирки каждого стрипа внести, не повреждая слой воска, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы «Taq-тип»; 3. Закрыть крышки пробирок; 4. В каждую пробирку стрипа, предназначенного для отрицательного контроля, внести поочередно по 5 мкл ОКО; 5. В каждую пробирку стрипа, подготовленного для исследуемого образца, внести поочередно по 5 мкл соответствующей пробы ДНК; 6. Повторить процедуру для всех исследуемых образцов; ! Важно: для недопущения контаминации при внесении ДНК следует открывать крышки пробирок только того стрипа, в который будет вноситься образец, и закрывать их перед внесением следующего образца. 7. В каждую пробирку стрипа, предназначенного для положительных контрольных образцов, внести поочередно по 5 мкл соответствующего ПКО согласно Таблице 2; 8. Установить все стрипы в блок детектирующего амплификатора; 9. Запустить программу амплификации в соответствии с параметрами, указанными в Таблице 3. Внимание! Для предотвращения контаминации при внесении в пробирки реагентов, образцов ДНК и контрольных образцов рекомендуется использовать только одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами. Таблица 3. Условия проведения ПЦР на втором этапе амплификации Программа амплификации Температура Время Количество циклов 95°С 15 мин 1 94°С 30 сек 58°С 45 сек 5 72°С 10 сек 94°С 20 сек 58°С *30 сек 40 72°С 10 сек 10°С - хранение - детекция флуоресцентного сигнала 7.2.1.2. Регистрация результатов второго этапа амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится в режиме реального времени с использованием детектирующего ПЦР-амплификатора согласно инструкции к прибору. Сигнал о накоплении специфических продуктов амплификации - фрагментов ДНК отдельных типов ВПЧ - регистрируется по каналу FAM и/или HEX (в соответствии с Таблицей 2). 17 --- стр. 18 --- Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции на соответствующем канале с пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct. Учет результатов следует начинать с результатов амплификации положительных и отрицательных контрольных образцов. 7.2Л.З. Анализ и интерпретация результатов второго этапа амплификации. i Принцип интерпретации: Результаты анализа не учитываются, если: - Во время прохождения реакции детектирующий амплификатор не регистрирует экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналам РАМ и HEX (либо по одному из каналов) в одной или нескольких пробирках с ПКО; в данной ситуации необходимо повторение исследования; - В пробирках стрипа с ОКО регистрируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналам РАМ и HEX (либо по одному из каналов). Необходимо принятие мер для устранения контаминации в ПЦР-лаборатории и повторное исследование всех образцов. Результаты анализа учитываются, если - Во время прохождения амплификации регистрируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналам РАМ и HEX во всех пробирках стрипа с ПКО; - Во время прохождения амплификации отсутствует флуоресцентный сигнал по каналам РАМ и HEX в пробирках стрипа с ОКО; Заключение о наличии либо отсутствии в анализируемом клиническом образце ДНК определенного типа/типов ВПЧ делается в соответствии с Таблицей 2. Тип ВПЧ для анализируемой пробы определён, если: - как минимум в одной из пробирок стрипа, содержащего исследуемый образец, регистрируется флуоресцентный сигнал по каналу РАМ и/или HEX; - график нарастания флуоресценции имеет форму экспоненциальной кривой; - для пробы определено значение порогового цикла Ct; - кривая флуоресценции пересекает пороговую линию на участке экпоненциального роста. 18 --- стр. 19 --- 7.2.2. Последовательность проведения анализа для Формы 3 (TYP) Данная форма комплектации не включает реагенты для первого этапа амплификации (скрининг), в процессе которого параллельно с накоплением фрагментов ДНК ВПЧ происходит накопление продуктов амплификации фрагмента гена В-глобина человека. Проверка качества выделения ДНК и взятия биологического материала должна осуществляться отдельно с использованием предназначенных для этого реат ентов, входящих в состав набора данной формы комплектации. 7.2.2.1. ПЦР-амплификация для дифференциации типа ВПЧ Исследование осуществляется для определения принадлежности вируса к одному из следующих типов: 16,18, 31,33, 35, 39, 45. 51, 52, 53, 56, 58, 59. 66, 68, 73. Анализ образца проводится в соответствии со схемой, приведенной в Таблице 4 и предполагает использование смесей «HPV-тип» и раствора Taq-полимеразы «Taq-тип». Таблица 4. Схема расположения амплификационных смесей в стрипе и наименование канала для детекции флуоресцентного сигнала РАМ HEX Используемый ПКО Окрашенная смесь «HPV-35» «HPV-18» ПКО 35/18 Прозрачная смесь «HPV-16» «HPV-3h> ПКО 16/31 Прозрачная смесь «HPV-45» «HPV-ЗЗ» ПКО 45/33 Прозрачная смесь «HPV-52» «HPV-56» ПКО 52/56 Прозрачная смесь «HPV-59» «HPV-бб» ПКО 59/66 Прозрачная смесь «HPV-39» «HPV-58» ПКО 39/58 Прозрачная смесь «HPV-51» «HPV-68» ПКО 51/68 Прозрачная смесь «HPV-53» «HPV-73» ПКО 53/73 Общий объём реакционной смеси - 25 мкл, включая объём пробы ДНК - 5 мкл. Для проведения исследования необходимо, чтобы общий объем ДНК, выделенной из анализируемого образца, составлял не менее 50 мкл (по 5 мкл на 8 реакций для дифференциации типа ВПЧ и 5 мкл для проверки качества выделения ДНК) Проведение исследования: 1. В штатив поставить необходимое количество стрипов со смесями для амплификации из расчёта п + 2, где п - количество анализируемых образцов, два дополнительных стрипа предназначены для анализа положительных и отрицательных контрольных образцов. 19 --- стр. 20 --- % 2 . Во все пробирки каждого стрипа внести, не повреждая слой воска, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы «Taq-тип»; 3. Закрыть крышки пробирок; 10. В каждую пробирку стрипа, предназначенного для отрицательного контроля, внести поочередно по 5 мкл ОКО; 11. В каждую пробирку стрипа, подготовленного для исследуемого образца, внести поочередно по 5 мкл соответствующей пробы ДНК; 12. Повторить процедуру для всех исследуемых образцов; ! Важно: для недопущения контаминации при внесении ДНК следует открывать крышки пробирок только того стрипа, в который будет вноситься образец, и закрывать их перед внесением следующего образца. 13. В каждую пробирку стрипа, предназначенного для положительных контрольных образцов, внести поочередно по 5 мкл соответствующего ПКО согласно Таблице 2; 14. Установить все стрипы в блок детектирующего амплификатора; 15. Запустить программу амплификации в соответствии с параметрами, указанными в Таблице 5. Внимание! Для предотвращения контаминации при внесении в пробирки реагентов, образцов ДНК и контрольных образцов рекомендуется использовать только одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами. Таблица 5. Условия проведения НЦР на втором этапе амплификации Программа амплификации Температура Время Количество циклов 95°С 15 мин 1 94°С 30 сек 58°С 45 сек 5 72°С 10 сек 94°С 20 сек 58°С *30 сек 40 72°С 10 сек 10°С - хранение - детекция флуоресцентного сигнала 1.2.2.2, Регистрация результатов амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится в режиме реального времени с использованием детектирующего ПЦР-амплификатора согласно инструкции к прибору. Сигнал о накоплении специфических продуктов амплификации - фрагментов ДНК отдельных типов ВПЧ - регистрируется по каналу FAM и/или HEX (в соответствии с Таблицей 4). 20 --- стр. 21 --- I 7.2.2.3. ПЦР-амплификация для проверки качества выделения ДНК и контроля взятия материала. Проведение исследования: 1. В штатив поставить необходимое количество пробирок, содержащих смесь для амплификации «ВК», из расчёта п + 2, где п - количество анализируемых образцов, две дополнительных пробирки предназначены для анализа положительных и отрицательных контрольных образцов. 2. Во все пробирки внести, не повреждая слой воска, по 10 мкл тщательно перемещанного раствора Taq-полимеразы «Taq-ВК»; 3. Закрыть крышки пробирок; 16. В пробирку, предназначенную для отрицательного контроля, внести 5 мкл ОКО; 17. В пробирку, подготовленную для исследуемого образца, внести 5 мкл соответствующей пробы ДНК; 18. Повторить процедуру для всех исследуемых образцов; I Важно: для недопущения контаминации при внесении ДНК следует открывать крышку только той пробирки, в которую будет вноситься образец, и закрывать её перед внесением следующего образца. 19. В пробирку, предназначенную для положительного контрольного образца, внести 5 мкл ПКО-ВК. 20. Установить все пробирки в блок детектирующего амплификатора; 21. Запустить программу амплификации в соответствии с параметрами, указанными в Таблице 6. Внимание! Для предотвращения контаминации при внесении в пробирки реагентов, образцов ДНК и контрольных образцов рекомендуется использовать только одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами. Таблица 6. Условия проведения ПЦР со смесью для амплификации ВК для проверки качества выделения ДНК и взятия биологического материала Программа амплификации Температура Время Количество циклов 95°С 15 мин 1 94°С 30 сек 58°С *30 сек 40 72°С 10 сек 10°С - хранение - детекция флуоресцентного сигнала 21 --- стр. 22 --- T.2.2.4. Регистрация результатов амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится в режиме реального времени с использованием детектирующего ПЦР-амплификатора согласно инструкции к прибору. Сигнал о накоплении продуктов амплификации - фрагментов ДНК гена В-глобина человека регистрируется по каналу HEX. 7.2.2.5. Анализ и интерпретация результатов. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции на соответствующем канале с пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct. Учет результатов при проведении ПЦР-амплификации для дифференциации типа ВПЧ и при проведении ПЦР-амплификации для проверки качества выделения ДНК и контроля взятия материала следует начинать с результатов амплификации положительных и отрицательных контрольных образцов. Принцип интерпретации: Результаты дифференциации типа ВПЧ не учитываются, если: - Во время прохождения реакции детектирующий амплификатор не регистрирует экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналам РАМ и HEX (либо по одному из каналов) в одной или нескольких пробирках с ПКО-тип; в данной ситуации необходимо повторение исследования; - В пробирках стрипа с ОКО регистрируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналам РАМ и HEX (либо по одному из каналов). Необходимо принятие мер для устранения контаминации в ПЦР-лаборатории и повторное исследование всех образцов. Результаты проверки качества выделения ДНК и контроля взятия материала не учитываются, если: - Во время прохождения реакции детектирующий амплификатор не регистрирует экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу HEX в пробирке с ПКО-ВК; в данной ситуации необходимо повторение исследования; - В пробирке с ОКО регистрируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу HEX. Необходимо принятие мер для устранения контаминации в ПЦР- лаборатории и повторное исследование всех образцов; 22