Набор реагентов для выявления РНК вируса лихорадки долины Рифт методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР" по ТУ 9398-056-05664012-2016 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
о
УТВЕРЖДАЮ КОПИЯ!
енеральныи директор
j^ r
ш т ^ ш
? i: & - V . , ; • Л 4 ? , '- - = ' - ^ • r . . ’ A * f , - r i V - \ G X \j» s.iiis л - ''* ч я ;:Ь :•,/;,S ; 3 у e. i < « « ,■ /» «?.v*-^\v i'/i < - S * 'm - * '
M 4 S < .^ y .
i^ ia s s e c s 3 ! > ^
ГНЦ ВБ «Вектор»
Знадзора
ксютов
2 0 /^ .
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов
для выявления РНК вируса лихорадки долины Рифт методом ОТ-ПЦР
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«Вектор-ОТ-ПЦРрв-В ЛДР»
по ТУ 9398-056-05664012-2016
--- стр. 2 ---
список СОКРАЩЕНИИ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ВЛДР - вирус лихорадки долины Рифт
ОТ - обратная транскрипция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РВ - гибридизационно-флуоресцептпая детекция в режиме «реального времени»
кДНК - комплементарная ДНК, получаемая в реакции ОТ на матрице РНК
ПКО - положительный контрольный образец экстракции РНК и ОТ-ПЦР
ОКО - отрицательный контрольный образец экстракции РНК и ОТ-ПЦР
ВКО - внутренний контрольный образец
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1 Полное название набора
«Набор реагентов для выявления РНК вируса лихорадки долины Рифт методом О'Г-НЦР
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» по ТУ 9398-056-
05664012-2016.
1.2 Предназначение набора и его диагноетическая роль
Набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» предназначен для выявления РНК вируса
лихорадки долины Рифт (ВЛДР) в биологических образцах (плазме, сыворотке крови и
секционном материале) методом, основанным на обратной транскрипции вирусной РНК с
последующей амплификацией фрагмента кДНК в полимеразной ценной реакции (ОТ-НЦР) и
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продукта реакции в режиме «реального времени»
(РВ).
1.3 Область применения набора
Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика лихорадки долины
Рифт, специфическая индикация патогенных биологических агентов, эпидемиологический
мониторинг, научные исследования. Набор может быть использован в лабораториях
специализированных противоэпидемических бригад Роспотребнадзора (без накопления
возбудителя вирусологическими методами), а также в изолированных лабораториях
специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе
Министерства Обороны.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
Набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрц-ВЛДР» не требует технического обслуживания и
калибровки.
2.1 Состав набора
Набор реагентов «Вектор-0 Г-НЦРрв-ВЛДР» состоит из 7 реагентов:
--- стр. 3 ---
№ Реагент Описание Объём, мл Количество
1 HS Taq полимераза, Р-1 Опалесцирующая
бесцветная жидкость 0,012 1 микропробирка
2 M-MuLV ревертаза, Р-2 Опалесцирующая
бесцве'гная жидкость 0,012 1 микропробирка
3 ВЛДР-смесь 1, Р-3 Прозрачная бсыцютная
жидкость 0,6 1 микронробирка
4 ВЛДР-смесь 2, Р-4 Прозрачная жидкость
розового цвет а 0,3 1 микронробирка
5
ВЛДР-положителы шш
контрольный образец (ПКО),
Р-5
Прозрачная бесцвошая
жидкость* 0,05 2 микропробирки
6
Отрицательный
контрольный образец (ОКО),
Р-6
Прозрачная бесцветная
жидкость 1,0 2 микропробирки
7 Внутренний контрольный
образец (ВКО), Р-7
Прозрачная бесцветная
жидкость 0,3 2 микропробирки
у
*При хранении раствора ПКО при температуре от минус 16 до минус 20 °С возможно
образование растворимого кристаллического осадка.
HS Tag полимераза (Р-1) расфасована по 0,012 мл в микропробирку с основанием,
вместимостью 0,5 мл, с завинчивающейся крышкой, состав: Hot Start Taq-ДИК-полимераза в
буферном растворе.
M-MuLV ревертаза (Р-2) расфасована но 0,012 мл в микропробирку с основанием,
вместимостью 0,5 мл, с завинчивающейся крышкой, состав: M-MuLV обратная транскрингаза
в буферном растворе.
ВЛДР-смесь 1 (Р-3) расфасована по 0,6 мл в микронробирку с основанием
вместимостью 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, состав: раствор реакционного буфера (10х)
для Hot Start Taq-ДНК-полимеразы, хлорид магния, вода очищенная.
ВЛДР-смесь 2 (Р-4) расфасована по 0,3 мл в микронробирку с основанием
вместимостью 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, состав: раствор 4-х
дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов.
Положительный контрольный образец. НКО (Р-5). расфасован но 0,05 мл в 2
микропробирки с основанием вместимостью 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, состав:
инактивированная культуральная жидкость, содержащая музейный штамм RVF 2002/09-11C
вируса лихорадки долины Рифт в лизирующем растворе.
Отрицательный контрольный образец. ОКО (Р-6). расфасован но 1,0 мл в 2
микропробирки с основанием вместимостью 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, состав:
раствор ДНК фага.
--- стр. 4 ---
Внутренний контрольный образец. ВКО (Р-7). раефасован но 0,3 мл в 2 микронробирки
с основанием вместимостью 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, состав: нссисцифичный к
ВЛДР ампликон или рекомбинантная бактериальная плазмида, содержащая неспецифичную к
ВЛДР вставку.
Примечание: ингредиентами, которые могут влиять на измерения, являются праймеры
и флуоресцентные зонды, основной характеристикой которых для конечного пользователя
является температура отжига Та, составляющая 55 °С. Данная характеристика реализуется с
помощью температурно-временного режима амплификации, следовательно, его соблюдение
является строго обязательным.
2.2 Количество анализируемых проб
Набор рассчитан на проведение анализа 60 проб, включая контрольные образцы, и
состоит из комплекта реагентов для ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».
Реагенты дли выделения РНК из биологического материала в состав набора не входит!
Для вьщелеиия РНК из биологического материала необходимо дополнительно к набору
реагентов «13ектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» использо]шть комплект реагентов для экстракции
РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-нреп» производства ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора (ФСР 2008/03147 от 24.03.2017 г.) или аналогичный,
зарегистрированный в установленном порядке.
2.3 Метод исследования
Выявление РНК вируса лихорадки долины Рифт включает две стадии. На первой стадии
после первичной подготовки проб проводят выделение РНК из биологических образцов.
Экстракция РНК проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО),
обеспечивающего контроль процедуры анализа каждой индивидуальной пробы. На второй
стадии проводят обратную транскрипцию вирусной РНК с помощью фермента M-MuLV
ревертазы и последующую амплификацию фрагмента кДНК в полимеразной цепной реакции
при помощи олигонуклеотидных праймеров и фермента HS Taq полимеразы. Детекция
продуктов амплификации происходит непосредственно в ходе НЦР благодаря применению
флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда, гибридизующегося с продуктом реакции
(ампликоном) и обеспечивающего дополнительную специфичность метода. Интенсивность
флуоресценции возрастает в ходе НЦР пропорционально накоплению амликонов, а динамика
нарастания флуоресценции определяется исходным количеством вирусной РНК в образце.
Постановка ОТ-ПЦР-РВ осуществляется на специальных приборах, например, «СЬ'Х-
9 6 » (BioRad, США), «Rotor-Gene 3000/6000» (Corbett Research, Австралия) и «Rotor-Gene Q»
(Q iagen, Германия) или эквивалентных но характеристикам (см. и. 5 настоянщй инструкции),
им ею щ их каналы детекции флуоресценции FAM/Green и HEX/Yellow.
--- стр. 5 ---
i
2.4 Ограничения метода
В инфицированном материале РМК вируса лихорадки долины Рифт может быть ие
обнаружена по причине ингибирования ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточной эффективности
экстракции РНК. Для достижения показателей аналитической чувствительности используемый
набор для выделения должен обеспечивать эффективность экстракции РНК на уровне ие менее
20 %.
Причиной получения ложноположительного результата является контаминация на этане
экстракции РНК либо проведения реакции ОТ-ПЦР-РВ. Ложноноложительный результат
выявляется с помои(ью отрицательного контрольного образца экстракции РНК и ОТ-ПЦР-РВ
(ОКО) (пн. 7.2 и 8 настоящей инструкции).
Причиной получения ложноотрицательного результата является ингибирование О'Г-
ПЦР-РВ и/или недостаточная эффективность экстракции РНК. Ложноотрицательный резулыаг
выявляется с помощью внутреннего и положительного контрольных образцов экстракции РНК
и ОТ-ПЦР-РВ (ВКО и ПКО) (пн. 7.2 и 8 настояпщй инструкции).
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1 Аналитические характеристики
Исследования аналитических характеристик набора проведены на базах: клинико-
диагностическая лаборатория ООО «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР» (г. Москва) и ФБУН ТПЦ ВБ
«Вектор» Роспотребнадзора (Новосибирская обл., рабочий поселок Кольцово) в рамках
исследования эффективноети набора и проведения технических испытаний.
3.1.1 Чувствительность
Чувствительность набора реагентов составляет 1x10 копий кДПК вируса лихорадки
долины Рифт в 25 мкл реакционной смеси.
Для достижения показателей чувствительности объем аликвоты исходного материала
(пробы) должен составлять не менее 100 мкл.
3.1.2 Специфичность
Специ(})ичноеть - лошюположи'гельные и лояаюотрицательные резулыагы при анешизе
образцов РНК вируса лихорадки долины Рифт, вируса лихорадки Западного Нила, вируса жслч'ой
лихорадки, вируса денге, вируса Зика, вируса чикуигунья, вируса венесуэльского энцефаломиелита
лош адей, вируса диареи крупного рогатого скота, вируса клещевого энцефалита, вируса японского
энцефалита, вируса уличного бешеистаа, ДНК бактериофагов лямбда и Г4, ДНК человека и грызунов
отсутствовали.
--- стр. 6 ---
i
3.2 Диагностические характеристики
3.2.1 Диагностическая чувствительность
Диагностическая чувствительность - при исследовании 200 положительных проб,
содержащих РНК вируса лихорадки долины Рифт (100 проб на 2-х сериях набора), при
наличии в 25 мкл реакционной смеси 1x10 копий кДЫК вируса, был получен положительный
результат в 200 случаях.
Диагностическая чувствительность - не менее 98 % с доверительной вероятносп.ю
90 %.
3.2.2 Диагностическая специфичность
Диагностическая специфичность - при исследовании 200 отрицательных проб, не
содержащих РНК вируса лихорадки долины Рифт 100 проб на 2-х сериях набора,
отрицательный ответ в ПЦР получен в 200 случаях.
Диагностическая специфичность - не менее 98 % с до15еригел1>ной вероятноспло
90 %.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность вирусом
лихорадки долины Рифт (И группа патогенности), проводят с соблюдением санитарно-
эпидемиологических правил СИ 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1 -1 1
групп патогенности (опасности)», СИ 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и
транспортирования микроорганизмов 1-1V групп патогенности» и методических указаний МУ
1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-1V групп
патогенности». Утилизация тест-систем с истекшим сроком годности и отработанных
препаратов должна соответствовать требованиям СанПиН 2.1.7.2790-10.
Для предотвращения контаминации анализируемых проб при проведении работ с
использованием ПЦР пользователям диагностических наборов реагентов необходимо
выполнять следующие требования.
1 . Разделение лаборатории на зоны (помещения) для каждой из стадий ПДР-анализа:
ЗОНА 1 для подготовки проб;
ЗОИЛ 2 для экстракции нуклеиновых кислот;
ЗОИЛ 3 для приготовления реакционных смесей и постановки ОТ-ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции.
2 . Каждое из помещений лаборатории должно иметь евой набор реагентов, дозаторов,
наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов,
обуви и перчаток, уборочного инвентаря.
3 . Микронробирки и наконечники для дозаторов следует использовать однократно.
Необходимо менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью
--- стр. 7 ---
предотвращения перекрестной контаминации в процессе экстракции нуклеиновых кислот
или при внесении реагентов в реакционную смесь.
4. При постановке анализа следует обязательно применять прилагаемые к набору
отрицательный, положительный и внутренний контрольные образцы.
5. Рабочие зоны (помещения) лаборатории должны подвергаться ежеднс]июму
обеззараживанию ультрафиолетовым излучением в соответствии с требованиями
руководства Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения
для обеззараживания воздуха в помещениях».
6. Использованные наконечники для дозаторов, микропробирки, другие одноразовые
материалы следует подвергать обработке дезинфицирующими средствами, вызывающими
деградацию ДНК (например, 0,2 % раствор ДП-2Т) с последующей утилиза]щей.
Внимание! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты
ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку эго
может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и
реагентов.
Потенциальный риск применения набора ~ класс 2 б (н. 9 приложения № 2 к приказу
Минздрава России от 06.06.2012 № 4и).
4.1 Необходимость обучения персонала
Для выполнения анализа с помощью данно 1’ о набора реагентов необходимо участие
специалистов не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим или иным
образованием, окончивших соответствующие курсы специальной подготовки с освоением
методов безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБЛ) 1 -1 1 ipyim
патогенности, не имеющих противопоказаний к применению средств профилактики и лечения
и к работе в средствах индивидуальной защиты.
Персонал должен иметь навыки работы с биохимическими реактивами и современшям
лабораторным оборудованием.
4.2 Меры безопасности, иозволяюпщс предохранять онераз ора
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичшями,
вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует
соблюдать обычные меры предосторожности для лабораторий:
- пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные халаты;
- не принимать пищу, не нить и не курить в лабораторных помещениях;
- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с м1ллом.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них
компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов
набора реагентов за медицинской помощью следует обратиться немедленно.
--- стр. 11 ---
действующими санитарными правилами о порядке учета, хранения, передачи и
гранснортирования микроорганизмов I-IV труни натотснности.
Клинический материал утилизируют в соответствии с Санитарио-энидемиолотичрекими
требованиями к обращению с медицинскими отходами (СанПиП 2.1.7.2790-10).
7. ИРОНЕДЕНИК ЛИЛЛИЗЛ
7,1 Экстракция РИК
Для экстракции РНК вируса лихорадки долины Рифт из биолотичсского материала
рекомендуется использовать комплект реагентов «РИБО-прсн» производства ФБУИ ЦНИИ
Эпидемиологии Росиотребцадзора (ФСР 2008/03147 от 24.03.2017 г.) или аналогичный,
зарегистрированный в установленном порядке. В каждую партию В 1лделсния наряду с
исследуемым материалом необходимо включать положительный контрол 1лн.1Й образец (ИКО,
Р-5) и отрицательный контрольный образец (ОКО, Р-6) из состава набора реагентов «Вектор-
ОТ-ИЦРрв-ВЗЩР», которые обязательно анализируются в ОТ-ГЩР-РВ. Применение ИКО (Р-5)
позволяет контролировать стабильность реагентов, используемых для экстракции цуклсино1илх
кислот, и компонентов набора, предназначенных для проведения ОТ-ИЦР-РВ. Назначение
ОКО (Р-6) - контроль возможной контаминации иа этапах экстракции нуклеиновых кислот и
ОГ-ИЦР-РВ.
Для контроля надлежащего прохождения этапов экстракции нуклеиновых кислот и О Г-
ИЦР-РВ в индивидуальных пробах используют внутренний контрольный образец (ВКО, Р-7)
из состава набора реагентов «Всктор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР».
Порядок работы:
1 . Прогреть раствор для лизиса из набора « РИБО-нрси» в термостате при темцсратурс 65 "С
до полного растворения кристаллов согласно инструкции производителя.
2. Отобрать необходимое количество пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися
крышками, включая пробирки для отрицательного (ОКО) и положительного (11КО)
контрольных образной. Промаркировать пробирки.
3. Внести в каждую пробирку но 10 мкл Р-7.
4. Добавить в пробирки но 300 мкл раствора для лизиса.
5. В пробирки с Р-7 и раствором для лизиса внести ио 100 мкл подготовленных проб,
используя наконечники с аэрозольным барьером.
6. В пробирку отрицательного контрольного образца внести 100 мкл Р-6.
7 . Переметать раствор Р-5 на вортсксс до полного растворения осадка, осадить капли с
крышки и стенок пробирки кратко15рсмсиным центрифугированием и внести в пробирку
иоложи'гслыюго кон трольного образца 10 мкл Р-5 и 90 мкл Р-6.
8 . Дальнейшие операции но экстракции РНК проводить согласно инструкции к набор>
реагентов «РИБО-нрен», начиная с н. 4 раздела «Экстракция РПК/)(ПК из исслсдус.м 1лх
образцов»: «Содержимое пробирок тщательно нсрсмешап. на вортсксс,
процеитрифугировать в течение 5 с иа микроцен трифуге для удаления капель с внутренней
поверхности крышки и прогреть 5 мин при 65 °С в термостате».
1 1
--- стр. 12 ---
7.2 Постановка ОТ-ИЦР с гпбрндшациоино-флуорссцси гной дстскцисн
(общий объем одной реакции - 25 мкл, включая объем РНК-иробы К) мкл)
Порядок рабогы:
1 . Приготовитъ необходимое количество микроиробирок/сгрииов или илашпст (далее
«микроиробирки») 110 числу тесгирусмых проб, включая полученные на стадии экстракции
отрицателъиый и ВЛДР-иоложителъиый коитроли. Для виессиия в пробирки рсагеигов,
проб и коитролъиых образцов используют одноразовые наконечники с фильтрами.
Втшаиие! При использовании амилификатора иланихетиого гина недопустимо наиссение
маркировки на крышки микроиробирок.
2. Приготовить реакционную смесь на нужное количество реакций, для чего смешагь в
отдельной пробирке Р-3, Р-4, Р-1 и Р-2 из расчета иа каждую реакцию;
- 10 мкл Р-3;
- 5 мкл Р-4;
- 0,2 мкл Р-1;
- 0,2 мкл Р-2.
3. Внести в каждую микроиробирку но 15 мкл нрш отовленной реакционной смеси.
4. Используя одноразовые наконечники с аэрозольным барьером, внести в микроиробирки е
реакционной смесью но 10 мкл РПК-нроб, включая прошедшие стадию экстракции РНК
отрицательный и положительный контрольные образцы (ОКО и ПКО).
5. Поместить микроиробирки в амнлификатор.
6. Выбрать объем реакционной смеси (25 мкл). Выбрать канал 1*ЛМ/Огссп для дегекции
амплификации кДПК вируса лихорадки долины Рифт. Выбрать капал llliX/Yellow для
детекции амплификации виутрсиисто контрольного образца (ВКО).
7. Запрограммировать положение микроиробирок с исследуемыми пробами, ноложител 1Л11лми
и отрицательными коитролями согласно руководству но эксплуатации прибора.
8. Провести ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцситной детекцией продуктов реакции в
режиме «реального времени» согласно следующему протоколу:
'Гемиера тура, "С Время Каналы детекции
флуореецеиции
Количество
циклов
1
1
45' 30 мин -
94 3 мии -
94 10 с -
55 30 с - 5
72 20 с -
94 Юс -
55 30 с FAM/Grccn, IIEX/Yellow 35
72 20 с -
8. АНАЛИЗ И УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Для анализа результатов испол 1>зуют программное обеспечение амилификатора. Рабозу е
программным обеспечением осуществляют согласно руководству но эксплуатации прибора.
При использовании амнлификаторов «Rotor-Gene 3000/6000» (Corbett Research, Австралия)
12
--- стр. 13 ---
1
или «Rotor-Gene Q» (Qiagen, Германия) уетаионить следующие параметры: и меню
Analysis/AiKi.'iin выбрать режим анализа Quaniitation/KojiUHecmeemibiu и 1жлючип^ опции
Dynamic /иЬе/Дшишичесппй фон и Slope Соггес 1/Коррекцш1 yiciona', в меню, Outlier
Removal/Устраиепие выбросов уезановигь NTC threslwld/Иорог Фона равным 10 %; в меню
СТ Calculation/Вычислепие СТ усгановичТ) Threshold/llopoe равным 0,03 но каналам l’ ’ A N 4 и
1IEX.
При использовании амнлификатора «СГХ-96» (BioRad, СП1Л) li меню Settings выбрагь: О/
Determination Mode - Single Threshold', Baseline Setting - Baseline Siibstrueted Curve Fit.
Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) иерсссчеиия кривых
флуоресценции образцов с пороговыми линиями, что соответствует шыичию или отсутетвик)
значения порогового цикла «СЬ> в еоо'пютствующсй графе таблиц 1л резул)>татов программ!.!
амплификатора. Пять первых нсрсгистрируемых циклов амнлифика!щи при анализе !!С
учитывают. Для достоверной интерпретации результатов следует учи! 1,1!и тт!. значения «Cl»,
полученные для положи тельного, отрицательного и внутреннего контролей:
4
Контроль Кош ролпрусмын э тан
Значение «Ct» но каналу
анализа FAM/Creen
(канал кДПК ВЛДР)
IlFX/Yellow
(ка!1ал ВКО)
ПКО Экстракция РПК и ОГ-1ЩР <25 <25
ОКО Экстракция РПК и ОТ-ПЦР нет или > 32 <25
Порядок учёта рсзулыагои:
■ Лнализируемый образец считают отрицатедыиам, т.с. не содсржа!!Ц!.м РПК ВЛД1Г ес.ти
значение «Ct» но каналу ГЛМ (канал к/Ц1К ВЛДР) больше 32 iu!h ! ic оирсдс!!яе!Ся.
Исключениями являются случаи:
- если для образца, показавшего отрицательный результат, значение «С1» д.тя
внутреннего контрольного образца (ВКО) но кашшу ПГХ !!рев!. 1!цаст 25 1И !И !!с
определяется, то результат анализа считается иедосто15ср!!ым, необходимо нро!Ю 'С !!1
повторный анализ данного образца, начиная с этана экстракции;
- если значение «Ct» для положительного контрольного образца (ПКО) но Kaiiaj!y 1-'Л М
ирсшлшаст 25 или не онрсде!!ЯС'тся, то результаты анализа !!о !5ссм образ! ia.\!
поста! !0!Ючной серии, ноказа!И 1шм отрицатслын.ш резу!!!.!ат, счига! 0!ся
!1СДОСТОВСрНЫ М И, !!СОбхОДИМО 1!ОВ!'ОрИТЬ анаЛИЗ этих обраЗ!!,0!!, начиная с )!а!!а
экстракции.
■ Анализируемый образец считают положительным, т.с. содсржа!!Шм 1 М 1 К ВЛДР, ко! да
кривая накоиления флуоресценции имеет характерную экс 1юнс!1циал!.!1ую фазу роста i!
пересекает !!ороговую линию. 11ри этом значение «Q» но каналу ГАМ должно быть не бо.т!.!!!е
--- стр. 14 ---
32. Амплитуда сигнала не имеет значения. Исключением яиляется случай, когда для
отрицательного контрольного образца (ОКО) но каналу FAM значение «С1» мешлне или painio
32. Это свидетельствует о наличии контаминации реагентов или образцо]?. В этом случае
результаты анализа но всем образца.м постановочной серии, для которых был получен
НОЛОЖ ИТСЛ1Л1Ы Й рсзул1тгат, считаются нсдосто1юрн1,1ми. Необходимо принять меры но
выявлению и лиюшдации источника контаминации и повторить анализ этих образцов, начиная
с этана экстракции.
9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРЛНСНОРТИРОВАНИЯ И ЭКСНЛУЛ1АЦИИ НАВОРА
9Л Условия хранения набора
Набор реагентов «Вектор-0 Г-НЦРрв-ВЛДР» хранить в упаковке нреднриятия-
изготовителя в соответствии с ГУ 9398-056-05664012-2016 при температуре от минус 16 °С до
минус 20 °С. Следует избегать длительного размораживания реагентов. Срок годносчи
вскрытых компонентов изделия - в течение срока годности серии набора.
9.2 Условия грансноргнровання набора
Набор реагентов «Вектор-ОТ-11ЦРрв-ВЛДР» транспортировать в соот15Стствии с ГУ
9398-056-05664012-2016 при тсмисратурс от 2 °С до 8 °С в термоконтейнере не более трех
суток.
9.3 Срок годносгн набора
Срок годности набора - 12 месяцев со дня изготовления. Набор реагентов с истектнм
сроком годности применению не подлежит.
9.4 Информация но безопасной угнлизаннн
11абор1л с истекшим сроком годности, а также в случае но 1феждсния унако 1н<н.
утилизируют но классу А, как эпидемиологически безопасные отходы, но составу
приближенные к ТБО (СанПиН 2.1.7.2790-10).
9.5 1"аран I нйные обяза гельс гва производи теля
11реднриятие-нроизводитель гарантирует соответствие функционал 1>ных характсрнс i iii.
набора реагентов требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в
течение установленного срока годности (12 месяцев) при соблюдении всех условий
транснортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество набора реагентов «Вектор-0 Г -1 1 1 |,Рр|гВЛ)1Р» направлять на
предприятие-изготовитель ФБУ11 ГИЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (630559, Россия,
Новосибирская область, рабочий поселок Кольцово, тел. (383) 336-60-10, факс (383) 336-74-09.
e-mail: vectoT@,vector.nsc.Tu).
При В1лявлении побочных действий, не указанных в инетрукции но применению набора
реагентов, нсжелателынлх реакций при его иснол1)30вании, фактов и обстоятельств, создающих
угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при нрименснии набора
14
--- стр. 18 ---
г
в данном
прошнуровано,
пронумеровано и скреплено
печатью. / / „листов
должность, подпись •
--- стр. 19 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел разработки средств
ПЦР-диагностики вирусных и
риккетсиозных заболеваний (отд. 02.16.00)
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
ПАСПОРТ № 93 от 27.09.2017
Набор реагентов для выявления РНК вируса лихорадки долины Рифт методом ОТ-ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«Вектор-ОТ-ПЦРрв-В ЛДР »
Номер серии 010917
Количество в серии 12 наборов
Дата выпуска 27.09.2017
Контрольный номер ОБТК № 93
Дата изготовления 18.09.2017
Анализ выполнен по проекту ТУ 9398-056-05664012-2016
Наименование показателя Требования НД Результаты анализа
1 2 3
1 .Внешний вид
HS Taq полимераза - (Р-1) Опалесцирующая бесцветная
жидкость
Опалесцирующая
бесцветная жидкость
M-MuLV ревертаза - (Р-2) Опалесцирующая бесцветная
жидкость
Опалесцирующая
бесцветная жидкость
ВЛДР-смесь 1 - (Р-3) Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
ВЛДР-смесь 2 - (Р-4) Прозрачная жидкость розового цветаПрозрачная жидкость
розового цвета
ВЛДР-положительный
контрольный образец (ПКО) -
(Р-5)*
Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
Отрицательный контрольный
образец (ОКО) - (Р-6)
Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
Внутренний контрольный
образец (ВКО) - (Р-7)
Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
2. Герметичность пробирок При 1 -2-х кратном переворачивании
микропробирок не должно
наблюдаться протечек веществ.
Соответствует
3.Функциональные (технические
характеристики)
3.1 Чувствительность Набор реагентов должен выявлять в
ПЦР от 1 0 ^ и более копий
рекомбинантной плазмиды,
содержащей вставку ДНК,
комплементарную участку РНК
вируса лихорадки долины Рифт в 25
мкл реакционной смеси
Выявляет в ПЦР
1,0x10’ копий.
Использовали
последовательные
разведения СОН ВЛДР-
К+сер. 010917
(исходная концентрация
- 10’ копий/мл) с шагом
Паспорт на набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» Страница I из 3
--- стр. 20 ---
Наименование показателя Требования НД Результаты анализа
10 от исходного до 10"^.
(протокол № 1 от 27
сентября 2017 г.)
3.2 Специфичность Наличие положительного сигнала на
канале FAM/Green в пробах с
положительными контрольными
образцами (СОП ВЛДР-К+ и ПКО)
Соответствует
(протокол № 1 от 27
сентября 2017 г.)
Наличие
положительного сигнала
на канале FAM в пробах
с положительными
контрольными
образцами (ПКО) и
СОП ВЛДР-К+
серия 010917
Отсутствие положительного
сигнала на канале FAM/Green в
пробе с отрицательными
контрольными образцами (ОКО и
СОП ДНК человека).
Отсутствие
флуоресцентного
сигнала на канале FAM
в ОКО и СОП ДНК
человека серия № 01-
10.16
3.3 Отсутствие
ложноположительных/
ложноотрицательных результатов
3.3.1 Отрицательный контрольный
образец
Значение Ct по каналу FAM/Green
(канал кДНК ВЛДР) больше 32 или
не определяется
Не определяется
(протокол № 1 от 27
сентября 2017 г.)
3.3.2 Положительный контрольный
образец
Значение Ct по каналу FAM/Green
(канал кДНК ВЛДР) должно быть
меньше или равно 32.
Менее 32
(протокол № 1 от 27
сентября 2017 г.)
3.4 Повторяемость Коэффициент вариации для
повторяемости не должен превышать
3%
0,39
3.5 Воспроизводимость Коэффициент вариации для
воспроизводимости не должен
превышать 6 %
0,62
4. Биологические препараты для
производства и контроля
1. СОП ВЛДР-К+ - Стандартный
образец предприятия - ВЛДР-
положительный контроль ПЦР
(рекомбинантная бактериальная
плазмида, содержащая
вирусспецифическую вставку
(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора).
Концентрация плазмидной ДР1К
составляет не менее 10^ копий/мл.
2. СОП ДНК человека -
крнцентрация не менее 10 нг/мл
3. ВЛДР-положительный
контрольный образец (ПКО) -
(Р-5). Инактивированная
культуральная жидкость,
Концентрация
10^ копий/мл
(протокол № 1К ВЛДР от
18 сентября 2017 г.)
(протокол
№4С_ВЛДР_СОП от
18 сентября 2017 г.)
0,341 мкг/мл
(протокол № 1 ДНК от 17
октября 2016 г.)
Соответствует
(протокол № 2С ВЛДР1
от 18 сентября 2017 г.)
Паспорт на набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» Страница 2 из 3
--- стр. 21 ---
Наименование показателя Требования НД Результаты анализа
содержащая музейный штамм
RVF 2002/09-ПС вируса
лихорадки долины Рифт, в
лизирующем растворе.
4. Отрицательный контрольный
образец (ОКО) - (Р-6). Водный
раствор ДНК фага X, 0,005
мг/мл («СибЭнзим», кат. №
D11).
5. Внутренний контрольный
образец (ВКО) - (Р-7).
Неспецифичный к ВЛДР
ампликон или рекомбинантная
бактериальная плазмида,
содержащая неспецифичную к
ВЛДР вставку.
Подлинность контрольных образцов
ПКО, ВКО и СОН ВЛДР-К+
подтверждается секвенированием.
Соответствует
(протокол
№1СП_ВЛДР_1
от 18 сентября 2017 г.)
Соответствует
(протокол
№ЗС_ВЛДР_1
от 18 сентября 2017 г.)
Комплектность В соответствии с требованиями
проекта ТУ п. 1.3______________
Соответствует
Маркировка В соответствии с требованиями
проекта ТУ п. 1.5______________
Соответствует
Упаковка В микропробирках вместимостью
0,5; 1,5 мл с завинчивающейся
крыщкой (полипропиленовые,
“SSI”, США, артикул SSI-2140,
SSI-2240 или аналогичные,
разрешенные к применению в РФ).
Набор реагентов упаковывают в
пакет полиэтиленовый с застежкой
(«Медиген», Россия, кат. №
170107 или аналогичный).
Вторичной упаковкой может быть
пакет с застежкой или коробка из
картона коробочного (ГОСТ 7933-
89Е). В пакет или коробку
вкладывают инструкцию по
применению.
Соответствует
* При хранении раствора Р-5 при температуре от минус 16 °С до минус 20 °С возможно
образование растворимого кристаллического осадка.
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым транспортом
(автомобильным, железнодорожным либо воздушным) в соответствии с проектом ТУ 9398-056-
05664012-2016 не более 3-х суток при температуре от 2 °С до 8 °С в термоконтейнере.
Хранение при температуре минус 16°С до минус 20 °С.
Следует избегать длительного размораживания реагентов.
Срок годности - 1 год.
Заключение: соответствует проекту ТУ 9398-О56-О56б4^$*^йТ0^*^^
Ж ” *
I & 2 Ш
Зав. ОБТК
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
Паспорт на набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв\ /#■?
.П. Богрянцева
Страница 3 из 3
--- стр. 22 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел разработки средств
ПЦР-диагностики вирусных и
риккетсиозных заболеваний (отд. 02.16.00)
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
ПАСПОРТ № 94 от 27.09.2017
Набор реагентов для выявления РНК вируса лихорадки долины Рифт методом ОТ-ПЦР е
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«Вектор-ОТ-ПЦРрв-В ЛДР »
Номер серии 020917
Количество в серии 12 наборов
Дата выпуска 27.09.2017
Контрольный номер ОБТК № 94
Дата изготовления 25.09.2017
Анализ выполнен по проекту ТУ 9398-056-05664012-2016
Наименование показателя Требования НД Результаты анализа
1 2 3
1 .Внешний вид
HS Taq полимераза - (Р-1) Опалесцирующая бесцветная
жидкость
Опалесцирующая
бесцветная жидкость
M-MuLV ревертаза - (Р-2) Опалесцирующая бесцветная
жидкость
Опалесцирующая
бесцветная жидкость
ВЛДР-смесь 1 - (Р-3) Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
ВЛДР-смесь 2 - (Р-4) Прозрачная жидкость розового цвета Прозрачная жидкость
розового цвета
ВЛДР-положительный
контрольный образец (ПКО) -
(Р-5)*
Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
Отрицательный контрольный
образец (ОКО) - (Р-6)
Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
Внутренний контрольный
образец (ВКО) - (Р-7)
Прозрачная бесцветная жидкость Прозрачная бесцветная
жидкость
2. Герметичность пробирок При 1 -2-х кратном переворачивании
микропробирок не должно
наблюдаться протечек веществ.
Соответствует
3.Функциональные (технические
характеристики)
3.1 Чувствительность Набор реагентов должен выявлять в
ПЦР от 10^ и более копий
рекомбинантной плазмиды,
содержащей вставку ДНК,
комплементарную участку РНК
вируса лихорадки долины Рифт в 25
мкл реакционной смеси
Выявляет в ПЦР
1,0x10' копий.
Использовали
последовательные
разведения СОП ВЛДР-
К+сер. 010917
(исходная концентрация
- 10’ копий/мл) с шагом
10 от исходного до 10'^.
Паспорт на набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» Страница 1 из 3
--- стр. 23 ---
' Наименование показателя Требования НД Результаты анализа
(протокол № 1 от 27
сентября 2017 г.) _______
3.2 Специфичность Наличие положительного сигнала на
канале FAM/Green в пробах с
положительными контрольными
образцами (СОП ВЛДР-К+ и ГЖО)
Отсутствие положительного
сигнала на канале FAM/Green в
пробе с отрицательными
контрольными образцами (ОКО и
СОП ДНК человека).
Соответствует
(протокол № 1 от 27
сентября 2017 г.)
Наличие
положительного сигнала
на канале FAM в пробах
с положительными
контрольными
образцами (ПКО) и
СОП ВЛДР-К+
серия 010917
Отсутствие
флуоресцентного
сигнала на канале FAM
в ОКО и СОП ДНК
человека серия № 01-
10.16
3.3 Отсутствие
ложноположительных/
ложноотрицательных результатов
3.3.1 Отрицательный контрольный
образец
Значение Ct по каналу FAM/Green
(канал кДНК ВЛДР) больше 32 или
не определяется____________________
Не определяется
(протокол № 1 от
сентября 2017 г.)
27
3.3.2 Положительный контрольный
образец
Значение Ct по каналу FAM/Green
(канал кДНК ВЛДР) должно быть
меньше или равно 32._______________
Менее 32
(протокол № 1 от
сентября 2017 г.)
27
3.4 Повторяемость Коэффициент вариации не должен
превышать 3 %_____________________
0,92
3.5 Воспроизводимость Коэффициент вариации не должен
превышать 6 %_____________________
0,81
4. Биологические препараты для
производства и контроля
1. СОП ВЛДР-К+ - Стандартный
образец предприятия - ВЛДР-
положительный контроль ПЦР
(рекомбинантная бактериальная
плазмида, содержащая
вирусспецифическую вставку
(ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора).
Концентрация плазмидной ДНК
составляет не менее 10^ копий/мл.
2. СОП ДНК человека -
крнцентрация не менее 10 нг/мл
3. ВЛДР-положительный
контрольный образец (ПКО) -
(Р-5). Инактивированная
культуральная жидкость,
содержащая музейный штамм
RVF 2002/09-ПС вируса
лихорадки долины Рифт, в
Концентрация
10^копий/мл
(протокол № 1К ВЛДР от
18 сентября 2017 г.)
(протокол
№4С_ВЛДР_СОПсуг
18 сентября 2017 г.)
0,341 мкг/мл
(протокол № 1 ДНК от 17
октября 2016 г.)
Соответствует
(протокол № 2С_ВЛДР_2
от 25 сентября 2017 г.)
Паспорт на набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» Страница 2 из 3
--- стр. 24 ---
Наименование показателя Требования НД Результаты анализа
лизирующем растворе.
4. Отрицательный контрольный
образец (ОКО) - (Р-6). Водный
раствор ДНК фага X, 0,005
мг/мл («СибЭнзим», кат. №
D11).
5. Внутренний контрольный
образец (ВКО) - (Р-7).
Неспецифичный к ВЛДР
ампликон или рекомбинантная
бактериальная плазмида,
содержащая неспецифичную к
ВЛДР вставку.
Подлинность контрольных образцов
ПКО, ВКО и СОН ВЛДР-К+
подтверждается секвенированием.
Соответствует
(протокол
№1СП_ВДДР_2
от 25 сентября 2017 г.)
Соответствует
(протокол
№ЗС_ВЛДР_2
от 25 сентября 2017 г.)
Комплектность В соответствии с требованиями
проекта ТУ п. 1.3______________
Соответствует
Маркировка В соответствии с требованиями
проекта ТУ п. 1.5______________
Соответствует
♦
Упаковка В микропробирках вместимостью
0,5; 1,5 мл с завинчивающейся
крышкой (полипропиленовые,
“SSI”, США, артикул SSI-2140,
SSI-2240 или аналогичные,
разрешенные к применению в РФ).
Набор реагентов упаковывают в
пакет полиэтиленовый с застежкой
(«Медиген», Россия, кат. №
170107 или аналогичный).
Вторичной упаковкой может быть
пакет с застежкой или коробка из
картона коробочного (ГОСТ 7933-
89Е). В пакет или коробку
вкладывают инструкцию по
применению.
Соответствует
* При хранении раствора Р-5 при температуре от минус 16 °С до минус 20 °С возможно
образование растворимого кристаллического осадка.
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым транспортом
(автомобильным, железнодорожным либо воздушным) в соответствии с проектом ТУ 9398-056-
05664012-2016 не более 3-х суток при температуре от 2 “С до 8 °С в термоконтейнере.
Хранение при температуре минус 16°С до минус 20 °С.
Следует избегать длительного размораживания реагентов.
Срок годности - 1 год.
М.П. Богрянцева
--- стр. 25 ---
ПРОТОКОЛ № 1 (от 27 сентября 2017 г.)
лабораторного испытания набора реагентов для выявления
РНК вируса лихорадки долины Рифт методом ОТ-ПЦР
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«Вектор-ОТ-ПЦРрв-В ЛДР»
серия 010917, дата изготовления 18.09.2017
серия 020917, дата изготовления 25.09.2017
*
1. Принцип метода.
Набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» предназначен для выявления РНК
вируса лихорадки долины Рифт методом обратной транскрипции - полимеразной цепной
реакции в режиме реального времени на приборе Rotor-Gene 6000 (“Corbett Life Science”,
Австралия), CFX96 («Bio-Rad», США) или аналогичных приборах других производителей.
Метод основан на многократном увеличении числа копий фрагмента вирусных
нуклеиновых кислот (комплементарной ДНК - кДНК) с одновременной гибридизационно-
флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, что позволяет обнаружить
специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации. Для проведения
ПЦР в режиме реального времени используют специфические праймеры (прямой и
обратный) и флуоресцентно-меченый зонд. Специфические праймеры обеспечивают
амплификацию фрагментов кДНК, предварительно синтезированной в ходе реакции на
матрице РНК, соответствующих нуклеотидной последовательности участка генома вируса
лихорадки долины Рифт.
2. Меры предосторожности.
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. ПЦР-
анализ выполнялся в соответствии с требованиями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы
лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с
материалом, содержащим микроорганизмы 1 - IV групп патогенности».
3. Анализируемые образцы.
В качестве анализируемых образцов использовали: отрицательный контрольный образец
(ОКО), положительный контрольный образец (ПКО), представляющий собой
инактивированную культуральную жидкость, содержащую музейный штамм RVF 2002/09-
ПС вируса лихорадки долины Рифт в лизирующем растворе; СОП ДНК человека серия
№01-10.16, представляющий собой ДНК человека вьщеленную из крови здоровых
доноров. СОП ВЛДР-К+ серия №010917 представляющий собой рекомбинантную
бактериальную плазмиду, еодержащую вставку кДНК вируса лихорадки долины
Рифт, штамм RVF 2002/09-ПС;
4. Экстракция РНК.
Экстракцию НК проводили с помощью комплекта реагентов «РИБО-преп» (ФБУН
«ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) из 100 мкл. Процедуру проводили
для положительного контрольного образца (ПКО, Р-5) и отрицательного контрольного
образца (ОКО, Р-6) из состава набора реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР».
В пробирки вместимостью 1,5 мл вносили по 10 мкл Р-7 и 300 мкл раствора для
лизиса, предварительно прогретого при 65°С до полного растворения кристаллов. В
пробирку отрицательного контрольного образца вносили 100 мкл Р-6. В пробирку
положительного контрольного образца вносили 10 мкл Р-5 и 90 мкл Р-6.
--- стр. 34 ---
1
День 2
Оператор2
Канал HEX
Амплификация
№ Поз Тип Описание Ct
FAM
1 А01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,60
2 В01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,88
3 С01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,57
4 D01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,55
5 Е01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,80
6 F01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,58
7 G01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,54
8 Н01 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,63
9 А02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,47
10 В02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 010917 24,30
1 1 С02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,19
12 D02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,45
13 Е02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,47
14 F02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,39
15 G02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,50
16 Н02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,42
17 АОЗ ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,44
18 ВОЗ ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,43
19 СОЗ ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,45
20 D02 ИО СОП ВЛДР-К+ (1х10^копий/мл) серия 020917 24,42
10
--- стр. 35 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел разработки средств
ПЦР-диагностики вирусных и
риккетсиозных заболеваний (02.16.00)
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
П А С П О Р Т № 92 от 25.09.2017
Стандартный образец предприятия
ВЛДР- положительный контроль ПЦР для определения аналитической чувствительности
набора реагентов для выявления РНК вируса лихорадки долины Рифт
СОН «ВЛДР-К^ »
Номер серии № 010917
Количество в серии 6 микропробирок
Контрольный номер ОБТК № 92
Дата изготовления 07.09.2017
Наименование
показателя Требования НД Результаты анализа
Внешний вид Прозрачная бесцветная жидкость Соответствует
Подлинность,
специфичность
Содержит специфичную нуклеотидную
последовательность
5’-AGGAGCATCTGAAATAGGTTCAACTTTAC
TACCCTCCATGTCGATAGATGTGGAAGATAT
GGCCAATTTTGTTCACGATTTCACCTTTGGCC
ACTTAGCTGACAAGACTGACAGACTGTTAAT
GCGTGAGTTTCCCATGATGAATGACGGGTTT
G АТС ATTTGAGCC-3 ’
Соответствует
(протокол
№ 4С_ВЛДР_СОП
от 18 сентября 2017 г.)
Объем 0,2 мл Соответствует
Концентрация Концентрация плазмидной ДНК - не менее 1 0 ^
копий/мл
1 0 ^ копий/мл
(протокол
№ 1К_ВЛДР
от 18 сентября 2017 г.)
Упаковка Микропробирка с основанием вместимостью 1,5
мл с завинчивающейся крышкой («SSI», США,
артикул SSI-2240 или аналогичные).
Соответствует
Маркировка Этикетка из прозрачной пленки на клейкой
основе («Lomond» или аналогичной) с указанием
сокращенного наименования предприятия-
изготовителя, краткого названия набора
реагентов, названия компонента и его объема;
номера серии, даты изготовления, срока годности
(годен до) и условий хранения, надписи «Только
для in vitro диагностики»
Соответствует
Хранение при температуре минус 16°С до минус 20 “ С.
Срок годности - 1 год.
Заключение:
Соответствует требованиям проекта лабораторного регламента № ЛР 05664012-032-16 и проекта
ТУ 9398-056-05664012-2016.
Зав. ОБТК
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнад; М.П. Богрянцева
--- стр. 36 ---
ПРОТОКОЛ № 4С_ВЛДР_СОП (от 18 сентября 2017 г.)
секвенирования фрагмента ДНК, амплифицированного со стандартного образца
предприятия - ВЛДР-положительного контроля ПЦР (СОН ВЛДР-К+) для
определения аналитической чувствительности набора реагентов для выявления
РНК вируса лихорадки долины Рифт
серия 010917, дата изготовления 07.09.2017 г.
СОН ВЛДР-К+ представляет собой рекомбинантную бактериальную
плазмиду, содержащую вставку кДНК вируса лихорадки долины Рифт.
Секвенирование ВЛДР-специфичного фрагмента выполнено с использованием
набора реагентов «BigDye Terminator 3.1 Cycle Sequencing PRIOO» («Applied
Biosystems», США) в соответствии с указаниями фирмы-производителя.
Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 8 мкл раствора «Terminator
Ready Reaction Mix», 3,2 пкМ каждого праймера (RVFV-2s 5’-
AGGAGCATCTGAAATAGG-З’и RVFV-2a 5’-GGCTCAAATGATCAAMCC-3’) и
0,3 M K T анализируемой плазмидной ДНК.
Полимеразную реакцию с терминирующими агентами проводили в
амплификаторе «MJ Minf'^» («Bio-Rad», США) с использованием следующей
программы температурно-временных циклов:
Температура, °С Время Количество
циклов
96 1 мин 1
96 10 сек
2550 5 сек
60 4 мин
4 хранение 1
Секвенирование по обеим цепям ДНК проводили на автоматическом
анализаторе «хЬ3500» («Applied Biosystems», США). Растифровку первичных
данных секвенирования (хроматограмм), их состыковку и проверку осуществляли с
^ помощью программы «Sequencer 4.0.5.» («Gene Codes Corporation», США).
В результате секвенирования получена нуклеотидная последовательность:
5’-AGGAGCATCTGAAATAGGTTCAACTTTACTACCCTCCATGTCGATAGATGTGGAA
GATATGGCCAATTTTGTTCACGATTTCACCTTTGGCCACTTAGCTGACAAGACTGAC
AGACTGTTAATGCGTGAGTTTCCCATGATGAATGACGGGTTTGATCATTTGAGCC-3’,
соответствующая фрагменту кДНК гена РНК-зависимой РНК-полимеразы
вируса лихорадки долины Рифт, штамм RVF 2002/09-ПС (GenBank № НМ586953.1,
позиции 180-346).
Н.с. отдела разработки средств
ПЦР-диагностики вирусных и
риккетсиозных заболеваний
Зав. отделом разработки средств
ПЦР-диагностики вирусных и
риккетсиозных заболеваний
k
Ж
Б.С. Малышев
Н.А. Нетесова
--- стр. 37 ---
ПРОТОКОЛ № 1К_ВЛДР (от 18 сентября 2017 г.)
определение концентрации плазмидной ДНК в препарате, использованном для
приготовления
СОН ВЛДР-К+ серии 010917
СОП ВЛДР-К+ предетавляет собой раствор рекомбинантной бактериальной
плазмиды, еодержащей ветавку кДНК вируеа лихорадки долины Рифт, с
концентрацией плазмидной ДНК не менее Ю’ копий/мл.
Препарат плазмидной ДНК, использованной для приготовления СОП ВЛДР-
К+, получен из компетентных бактериальных клеток Escherichia соИ штамм JM109,
трансформированных рекомбинантной бактериальной плазмидой, нееущей
вирусспецифичную ветавку.
Концентрация (С) выделенной плазмидной Д1Ж, определенная с помощью
епектрофотометра NanoView Plus™ («GE Healthcare», CIUA), составила
402,5 мкг/мл (среднее значение трех повторных измерений).
Пересчет концентрации ДНК [мкг/мл] в количество копий (соответствующее
числу копий к ДНК вируса лихорадки долины Рифт) произведен с учетом
молекулярного веса рекомбинантной плазмиды по формуле (1):
С-10-^-6,02-10'^
М = - ( 1)2853-2-3,26-10"
где М - количеетво копий плазмидной ДНК [копий/мл];
С - концентрация рекомбинантной плазмиды [мкг/мл];
Ю "* - коэффициент перевода [мкг/мл] в [г/мл];
6,02 • 10^^ - число Авогадро;
2853 - размер плазмиды [пар оснований, п.н.];
3,26-10^ - средний молекулярный вес одного звена нуклеотидной цепи [Да].
1 3Концентрация плазмидной ДНК в данном препарате составила 13,02 х10
i копий/мл.
Для получения СОП ВЛДР-К+ с концентрацией 10 ^ копий/мл выполнено
последовательное разведение исходного препарата рекомбинантной плазмиды
РНК-буфером из набора «АмплиПрайм РИБО-преп» (ООО «НекетБио»).
--- стр. 38 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел «Коллекция микроорганизмов»
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
Телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
П А С П О Р Т № 84 от 17.10.2016
Стандартный образец предприятия - ДНК человека
(СОН ДНК человека)
Номер серии №01-10.16
Количество в серии 5
Контрольный номер ОБТК № 84
Дата изготовления 10.10.2016
к
Наименование
показателя
Требования НД Результаты анализа
1 2 3
Внешний вид СОН ДНК человека - прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная
бесцветная
жидкость
Подлинность,
специфичность
Исследуемый образец СОН ДНК человека
должен определяться, как отрицательный
Соответствует
Объем 0,5 мл Соответствует
Концентрация Концентрация ДНК - не менее 10 нг/мл 0,341 мкг/мл
Упаковка В микропробирке объемом .1,0 мл
(полипропиленовые, “Axygen”, США Кат.
№ МСТ-060 или аналогичные).
СОН ДНК человека упаковывают в
полиэтиленовый пакет с застежкой
("Медиген", Россия, кат. № 170107 или
аналогичный). Вторичной упаковкой может
быть пакет с застежкой или пакет,
вложенный в коробку.
Соответствует
Маркировка На микропробирки наклеивают этикетки из
бумаги писчей на клеящей основе (с
указанием: сокращенного названия
предприятия-изготовителя, (ФБУН ГНЦ ВБ
«Вектор» Роспотребнадзора) сокращенного
названия стандартного образца предприятия,
объема, номера серии, даты изготовления,
срока годности (годен до), условий хранения.
Соответствует
Назначение
спедаюшййтстй^ 5
pe^^TOB^t',,
егламенту№ ЛР 05664012-010-12.
IIP ill#
J ''‘ * u o j e u 9
М.П.Богрянцева
--- стр. 39 ---
ПРОТОКОЛ № 1 ДНК (от 17.10.2016 г.)
контроля «Стандартного образца предприятия - ДНК человека»
(СОП ДНК человека)
серия №01-10.16, дата изготовления 10.10.2016 г.
1. Характеристика реагента
«СОП ДНК человека» - водный раствор ДНК, вьщеленной из крови здоровых доноров,
используется в качестве контрольного образца для контроля специфичности наборов
реагентов.
К
2. Контроль концентрации ДНК
Концентрацию ДНК определяли с использованием набора реагентов Quant-iT dsDNA, HS
(Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).
Концентрация СОП ДНК человека, серии №01-10.16 - 0,341 мкг/мл.
4
Н.с. отдела молекулярной вирусологии
флавивирусов и вирусных гепатитов
Зав. отделом биологического
и технологического контроля
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
Е.В. Чуб
М.П. Богрянцева
--- стр. 40 ---
ПРОТОКОЛ № 1СП_ВЛДР_1 (от 18 сентября 2017 г.)
оценки специфичности набора реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» в отношении отрицательного
контрольного образца экстракции РНК и ОТ-ПЦР (ОКО) - Р-6
Серия 010917, дата изготовления 18.09.2017 >
Отрицательный контрольный образец экстракции РНК и ОТ-ПЦР (ОКО) - Р-6 из набора
реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» представляет собой водный раствор ДНК фагаХ (концентрация
5мкг/мл) Назначение ОКО (Р-6) - контроль возможной контаминации реагентов, используемых для
экстракции РНК и проведения ОТ-ПЦР.
Набор реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР» включает систему для детекции генетического
материала вируса лихорадки долины Рифт, состоящую из пары праймеров и флуоресцентно-меченного
зонда:
Прямой праймер RVFV-2s: 5’-AGGAGCATCTGAAATAGG-3’
Обратный праймер RVFV-2a: 5’-GGCTCAAATGATCAAMCC-3’
Зонд RVFV-2: 5’-FAM-TCATCATGGGAAACTCACGCA-BHQl-3’.
Кроме того, набор содержит праймеры и зонд, предназначенные для детекции внутреннего
контрольного образца (ВКО, Р-7):
Прямой праймер IC_N200_S56: 5’-GGTAGTTCAGTTGAGTTG-3’;
Обратный праймер IC_N200_A56: 5’-GTCTCTGTCATTAACCTC-3’;
Зонд IC_N200_TM56: 5’-HEX-TCTCGTGACCTTGTTGCTAT-BHQ2-3’.
4 Отсутствие в составе ОКО (Р-6) последовательностей нуклеиновых кислот, выявляемых набором
^зеагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР», подтверждали результатами контрольной ОТ-ПЦР с внесением
ОКО (Р-6) в качестве экспериментальной пробы.
Контрольную ОТ-ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава:
ВКЭ-смесь 1 (Р-3) 10 мкл
ВКЭ-смесь 2 (Р-4) 5 мкл
HS Taq полимераза (Р-1) 0,2 мкл
M-MuLV ревертаза (Р-2) 0,2 мкл
Исследуемый ОКО 10 мкл
ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме «реального
времени» проводили в амплификаторе «CFX96» («Bio-Rad», США) согласно следующей программе
гсмпературно-временных циклов:
I
Температура, °С Время Каналы детекции
флуоресценции
Количество
циклов
45 30 мин - 1
94 3 мин - 1
94 Юс -
55 30 с - 5
72 20 с -
94 Юс -
55 30 с FAM/Green, HEX/Yellow 35
72 20 с -
Отсутствие роста флуоресцентного сигнала по каналам детекции FAM/Green и HEXA^ellow
вдгверждает, что ОКО (Р-6) из набора реагентов «Вектор-ОТ-ПЦРрв-ВЛДР», серия 010917, не
вдержит последовательностей нуклеиновых кислот, выявляемых данным набором.
д,с. отдела разработки средств ПЦР-диагностики
^эусных и риккетсиозных заболеваний
I. отделом разработки средств ПЦР-диагностики
Ьусных и риккетсиозных заболеваний
Н.А. Сметанникова
Н.А. Нетесова
--- стр. 46 ---
в данном
прошнуровано,
пронумеровано и скреплено
печатью листов
Ф - прописью,-— ■ _
^ ^
должность, П О Д П И С Ь
--- стр. 47 ---
г. Москва, ул. Тимирязевская, д.42, к. 352 ЗАО «СИНТОЛ»
Тел/факс; (495) 977-7455 Тел,: (495) 984-69-93
e-mail: syntol@iab.ac.ru www.syntol.ru '
ПАСПОРТ 1<АЧЕСТВЛ
«ОМ-Скрип-ЛЗН/ЛДР-РВ»
«НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ РНК ВИРУСОВ
ЛИХОРАДОК ЗАПАДНОГО НИЛА И ДОЛИНЫ РИФТ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ
ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (ОМ-СКРИН-ЛЗН/ЛДР-РВ)
НО ТУ 9398-001-46395995-2013»
Серия '2^^% I \ Наборов в серии / О шт. Дата изготовления^ ^ / 9
Пункт
ТУ Наименование показателя Требования 9398-001-46395995-2013 Результаты
контроля
1 .3 Комплектность
Комплект включает 6 стрипов по 8 микропробирок
объемом 0,2 мл, две пробирки объемом 1 ,5 мл,
четыре пробирки объемом 0,5 мл
Соответ ствует
1.5 Упаковка и маркировка Пакеты типа Zip-lock, этикетки из бумаги Соответствует
1.2,
табл. 1 ,
п. 1,2
Реакционная смесь в
стрипованных микропробир
ках, РС-ЛЗН/ЛДР*
Сухое вещеетво белого цвета Соответствует
Разбавитель, РБ** Прозрачная бесцветная жидкость, р11 8,8 Соответствует
Внутренний положительный
контроль выделения, ВПК-
В-РНК
Сухое вещество белого цвета Соответствует
Положительный кошроль-
ный образец, ПКО-ЛЗН/ЛДР Сухое вещество белого цвета Соответствует
Раствор для разбавления
ПКО, ОКО Прозрачная бесцветная жидкость, pH 8,0 Соответствует
1.2,
табл. 1 ,
н.З
Положи тельный результат
ПЦР-РВ.
Регистрация сигнала в пробирках с ПКО-
ЛЗН/ЛДР по каналам РАМ, R6G, ROX и Су5 Соответствует
Отрицательный результат
ПЦР-РВ
Регистрация сигнала в пробирках с ОКО
по каналам РАМ и Су5;
Отсутствие регистрации сигнала в пробирках с
ОКО но каналам R6G и ROX
Соответствует
Лнгшитическая
чу вс'тви'тел ы юсть
Регистрация сигнала в пробирках с:
СКО-ЛЗН по каналам РАМ, ROX и Су5
СКО-ЛДР по каналам РАМ, R6G и Су5
Соответствует
Примечания:
^Содержит дсзоксину1слеозидтрифосфаты, специфические праймеры, флуоресцентные зонды, Taq-
полимеразу, MMLV-ревсртазу, РНК внутреннего положительного контроля, трегалозу для
проведения 0'1'-ПЦР-Р13.
**СоДсржит ГЩ Р буфер (КС1, ТриеНС! (pH 8,8), MgCb, глицерол).
Заключение ОБТК: «Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов лихорадок
Западного Нила и долины Рифт методом полимеразной цепной реакции в реальном времени
(ОМ-Скрин-ЛЗН/ЛДР-РВ) по ТУ 9398-001-46395995-2013» серии V^ I'T но своим показателям
соответствует требованиям технических условий.
Храни 1ь в сухо.м, защищенном от света месте при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Суммарный
срок хранения при температуре от плюс 9 до плюс 20 °С не должен превышап. 14 суток в течение
срока годности набора реагентов.
Транспортировать крытым транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при
температуре от плюс 2 до плюс 8 “С. Допускается транспортирование до 14 суток при тсмнерату'ре до
20 °С.
Годен до: ^ 5 .
Начальник отдела ОБ'ГК
Н.А. Парыгина
Паспорт №
2013-1
--- стр. 48 ---
■ v S
.J
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
№J (РОСЗДРАВНАДЗОР)
РЕГИСТРАЦИОННОЕ УДОСТОВЕРЕНИЕ
НА МЕДИЦИНСКОЕ ИЗДЕЛИЕ
от 24 ноября 2015 года № РЗН 2015/3358
На медицинское изделие
Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов лихорадок
Западного Нила и долины Рифт методом полимеразной цепной реакции в
реальном времени (ОМ<Скрин-ЛЗН/ЛДР>РВ) но ТУ 939816-001-46395995>2013
Настоящее регистрационное удостоверение выдано
Закрытое акционерное общество "Синтол" (ЗАО "Сиитол"), Россия,
127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42
Производитель л "
Закрытое акционерное общество "Синтол" (ЗАО "Синтол"), Россия,
127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42
Место производства медицинского изделия
127550, Москва, ул. Тимирязевская, д. 42
Номер регистрационного досье № РД-3314/5751 от 07.03.2014
Вид медицинского изделия -
Юшсс поз-енциального риска применения медицинского изделия 3
Код Общероссийского классификатора продукции для медицинского изделия 93 9816
Настоящее регистрационное удостоверение имеет приложение на I листе
приказом Роездравнодзора от 24 но^
допущено к обращению на террито""* *' * “ ^
Руководитель Федеральной служб!^)^
по надзору в сфере здравоохраис
У/у
М.А. МурашкоЦ
0014878
\
--- стр. 51 ---
Инструкция по применению набора сравнения -
«Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов лихорадок Западного
Нила и долины Рифт методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-
Скрин-ЛЗН/ЛДР-РВ) по ТУ 939816-001-46395995-2013»
УТВЕРЖДЕНА
Приказом Госзлраннадзора
от24.П.2015 № 8652
УТВЕРЖДАЮ
I <»1сралы1ыА Anpcvttip
(КХ) «Смкгоя»
А И KytyAia
ИНСТРУКГ1ИЯ
по применению «Набора p e a ie H io e для вм яйлгния м нден гифмканий РНК
пирусой лихоралок Западного Ии. 1я и долины Рнфт методом полимератиой
иепной реакции в реальном времени (OM-CKpHibvllH/JIAP-PB)
но IУ 939К-001~*Ы95995-2013»
I 11Л1НЛЧТ1П1Е
i.f Г10ДНОС назнамие набора
«И.»6ор |»eaicimii» до» пыянлсиня и илситфнкаиии ГПК mipvt.ii
лим>ра.10к Запалного Нила и дадинм Гифд мето.ч»>м гкиимеразти! iioinioH
реакции н реальном нрсмеии (<^>М-С'крин-ЛЗП ЛЛГ-РВ) но ТЪ' <ЯУ«-(ип
463Ч5995-20П».
1.2 Прелназначенне наГюра н ею лна 1 ноетмческаи роль
Набор pcaieHiiW <ЮМ-Скрин-.'ГЗН'ЛДР-РИ» П1>сдилиачеи ti-
качественного определения <скриннн1. мониторинг) РНК внрусоп .шкорплок
Залалнош Нила (/ИН) н долины Рнф»т <ЛДР) в rtjKiiapntax НК. пм.к.лсм11ы\ ш
ripiH» обьекдов 01сружакнцен срслы. воздуха, насекомых, гцкк' к.жинческич
образцов, виpyccoлqJжaшeй суспензии, бнопсийтнч. и а>доисий1иио
магсриа.ш.
Ли.згностнческл» р*з.ль набора реагеншв заключается в й.тшт1апюс1 и ст«
исполыовацня в цахдержке лиатиосгики специфических патотчнй Иих«>рйж»к
Западного Нилл н долины Рифт) при исследовании мазериала «и fariMioH.
(подозритслытою на зоболслание1 н ннликацни нтшеинык бнолотичеекмх
atemoB ШВА), в обьектах окружающей среды; как усютрепшно
пре.дваритсльноп) теста при вытюлнежтн культуральною и 5Ho]ioiH'it.%iioio
мсц'дов исследования ц илентифнкаинн полотритезьных к\.1ыур. для
зпндемиологическогх* .моннгоринга
1.3 Область прнзтснсиин набора
Облттсть применения набора клиническая .заоорагориая лнатжигика зи
хора.|ок Заиа.1Нпго Мила и долины Рифз. спсиифн тескля ттлихаимя иаичсиимч
биолотнческих агстгтов. зпжкмиологн’тсскнЙ мониторит , научные нсслелова
ния. Hewp может быть истю.тыован в учрсжлсн1тя.\ ме.тишшы н тлрткмктхранс
ния. вирусологических ляборлтт^ях Ненгров гигиены и жилемноют ни Р«к1ю
трсбиолктра. в зпидсмнологичсских службах для расшифровки всмыитск нрГч>-
внрусных инфекции, а также н стационарных н мобн.и.ных 3a6opjTopnKx сис-
цмалнзнронйниых учреждений лрутзтх министерств и ведпишя. в том числе
.Мннжтгсрства Оборттны.
2 ХАРАК'ГЕРИС ТИКЛ И.АБОРЛ
к'омттонснты набора являкттся одиг^акшыми.
Набор рсмхгкюв «ЮМ-Гкрин-ЛЗН.'.ПДР.РВ« не требует техническою
обслуживания и калнбрттвки.
2 . 1 Гоетвя нябори
Набор реагентов состоит из 5 реатептов.
А» Слегав нябора Описание Объем KiM-BA
Рсмщнжнвя смесь я стрнноииких
мнкрттровиркох. РСЧЛЗН.'ЛЛР
сухое MtaccTMT
белого цвета 1 ыт 6 сгрвплв
Ра<6атипе.1ь. РЬ прозрачмая боеивегная
жнявоетъ 0.8 яи 1 npo6u|Hca
3- Пш1оаптлы*мй коктрплкныП
обрахеи. ПКО-ЛЗН/ЛДР
сухое ■ещсстяи
бояоп1 цвета 2 мг 3 пробирки
4 Растворлчя ратбаялення ПКО.
ОКО
прозрячная бесцветная
жмавостъ 1 пробирка
5, Ьиутреннмй 1Ю ЯЦ Ж И ГС.71.Н М Й [ сухое вешеттво
контрольанлелеиия, ВПК-В-М1К | белогоцветя 2 M l 1 пробирка
Реакционная смесь в стрнтюванных микропробирках. РГ-ЛЗН/.'|ДР,
расфасована в микртитробирки в стрипах объемом 0,2 мл. упакованные а
непрозрачный 1ЮлитгнденовыГт пакет Zip-l.ock размером 9»: 12 см. состав:
жвнмолярнан смесь лсюксннуклеозилгрифосфатов, десять олигонуклеотнадых
праймеров, четыре флуоресиситчых зоила, фермент Taq ДИК-нолимервза.
фермент MMLV-pcBcprnta; синтсзическая РНК пнутрсниего ттоложнтельного
кингролн. ВПК. трегвлоза.
Разбави1ель. РВ, расфасован в пробирку из т)липроп1Ь '1сиа т>бьсмом 1.5 мл
с завннчинаннпейся крышкой, упакованную и иоли-ттлеиовый пакет Zip-Lock
pn iMcpoM 4*7 см. состн; ПДР-буфер; хлорид мшния: глииерол; вода для ПЦР,
Раствор для разбаяления ПКО. ОКО. расфясовлн в ттробирку из лолипро-
низеиа объектом 1.5 мл с завинчнваюшейся крышкой, упакованную в полизти-
зсттовый пакет Zip-Livk размером 4*7 см. состав. ТЕ буфер
--- стр. 52 ---
Положигсиьный *«>тр«»льмый < »6р*т« 1. ПКО-ЛШ/ЛДР. расфасок»» п
пробирку из полипропн *спа оГ)ьем«м 0,5 мл с ^авиичиваюшсйс» крышкой, ynj
кованную н поли пи- 1еиовий пакет Zip-Lock размером 6*7 см. с(*став: смесь
сиктстичеч:кпх РНК. полученных с помощью m vrfro транскрипции с рекомбп
иаигных Г1ла 1мил рОст-Т с встроенными спсцифическнмп фржменимн 5* пс-
1ранслнруемой облаети<5‘иТК) вируса ЛЗН и S-ссгменга генома вируса ЛЛР
Внутренний положительный котро.ть вылелени*. ВПК-В-РНК. расфасо
ван в пробирку И Т полипропилена 1>6ьемпм 0,5 мл с заяинчиваюшейс» крыш
кой. упакованную в тпитги-кновый пакет Zip-Lock paiMcpoM 4*7 см. соспв:
синтстнчсска* РНК, пплучсшшв с помошью 1И vitro транскрипиии с рскомон
нашной платмилы p(iem-T со негроенным спсиифичсскнм фрагментом ДНК
Примечание: Ииг]*слиснтами. которые мснут влиять на итмерсиия. ввля
ются праймеры н флуоресцентные тонлы. основной харвктеристикой коп^рых
,Х1я конечною нольюватсля является температуря отжига Та. составляющая
60 Ч:. Двпна* характеристика рсалитуется с помопннп темперятурио-
временного режима амплификации, слсловатслмю, сю соблюленис является
строго обятательным.
2.2 Ко. 1нч1чг1поамв. 1н)нруеммх проб
Набор реагентов рассчитан иа 48 онрслслсиий. включая ктпролы 1ыс
образцы
2.3 Mctm.i нсслеллваннв
СХтнаружсннс фрагмеиюв нуклеиновых кислот вирусоп лихораиж
Запагшого Нк-та и лолнмы Рифт основано на испольюванин метола
мультиплскстюй олносгалийиой реакции обратной !ракскрипции. совмешетюй
с полимеразной иептюй реакцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) в олной
мивропробнркс
При амплификации с помоптмо ОТ-ПЦР-РВ используют четыре
олнгопуклеотилных праймера, фланкирующих фрагметп У нгтраислируемой
области генома вируса лихорадки Западного Нила, лва олшоиуклсогилных
праймера, фланкирующих фра 1мент п:нома вируса лихорадки лолниы Риф|,
два олтонуклсотмдных праймера. ф; 1апкируюшмх иукясиновые пилоты (НК)
внутреннего положительного контр^шя ОТ-ИЦР-РВ. лва олмюиуклеотидных
праймера, фланкирующих НК внутреннею полоткктельтнтю контрола
выделения, а также четыре флу 1»рссцентных зоила. Процесс амш 1нфикации
специфичных фрагментов заключается в повгорякчцнхся циклах
гемиературной ленатураинн ДНК. отжига првймсров с комплементарными
ПГК.ЛСЛОВаТСЛЫЮСТЯМИ и послсдуюшей .юстройкс 1К).’1ННуКЛС0ТНЛЯЫХ испей с
ттнх праймеров ДМК-полнмераюй с легекпней результатов в режиме реального
времени Постпновка ОТ-1ЩР-РВ осуми-сгвляегся на специальных приборвх,
например. «АПК-32 (32М. 4Я>- (ИЛИ РАН. г. Саикт-Пстербур!), ГРХ-%
iBioRad. США), или зквиввяентных по харакгеристтпевм (см. п. 5.1 настоящей
ипструкции).
НаГнтр peaiCHTOB «ОМ-Гкрин-ДЗН/ЛДР-РВ» реяяитует преимущества
мулыигшсспов OT-nUP-1'B » ч»;ти o,mo 4>CMCHHori> ти чепи , к олной пробе
РНК двух вирусов, а также двух контралей анализа по разным каналам детек
ции флуоресценции. Сигналы ф.туоресисяции регистрируюгея независимо друг
от друга по спелующнм канвлам- FAM виугренний патожитс. 1Ьный иипроль
выделения PtlK; RWJ - вирус лихорадки долины Рифт; ROX - вирус лихорадки
За1та,11101о Нила; Су5 - внутреши 1Й положительный контроль OT-UUP-PFL
Положительный рстультит теста означает, что исследуемый материал со-
дсрж 1гг РНК вирусов лихорадок Западного Нила и/или .долины Рифт, Отрнца-
тельный результат теста означает, что исследуемый материал не содержит РНК
вирусов лихорадок Западного Нн.па №'iuih до-тины Рифт.
2.4 Ограничения метола
В инфицировантш материале РНК вирусов может быть не обнаружена
по причине нигибирования ОТ-ПЦР-РВ и/нли недостаточной эффс 1т 1вжк 1и
вылелепия нуклеиновых кислот Для достижения показателей анвлктической
чувствительности истзлыуемый набор для выделения должен обеспечивать
■чффскгииность выделения НК иа уровне не менее 20 •/•.
Причиной получения ложноноложительного pciyjiKTaia является конга-
минация на ттапс выделения НК либ«> проведения реакции ОТ-ПЦР-РВ, Лож-
iimmюжительныГг результа! выявляегся с помощью отрипшельных Konipo.ib-
ных образцов выделения н ОТ-ПЦР-РВ (п. 8 3 настоящей инструкции)
Причиной потучеиня тожноотрицагслыюго результата является ингиби
|Ч1ванис (ТТ ПЦР-РВ н.'нлн недостаточная эффективность вылелсиия НК. Лож-
ноотрш|31елм1ый результат выявляется с помощью внутренних по.тожнгсльных
контрольных Ж 1р.гзцов выделения РИК (ВПК-В-РНК) н ОТ-ПЦР-Р 1) (Ш1К»
(п. 8.3 настоящей ннс 1рукции)
3 Л И Л . 1 И Т 1 1 Ч К С К И К и Д И Л П К Х 1 И Ч К ( к и к Х А Р А К Т К Р И С Т И К Н
3 . 1 А Н А Л И Т И Ч Е С К И Е Х А Р Л К Т Е Р И П И К И
Исслстовання аналитических характеристик набора проведены на баих
ФГВУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Сергиев Посад Московск^Л
об.ласти) и ООО ( ингол (г Mck:kiu) в рамках исслежжлиня (ффсммииосгп
набора н 11рг»всления технических испьпаний.
3.1.1 4 >вс 1ямгелыюсть
Чувствктстьжкгь - не батсс 1.0 10‘ копий РНК в ) ми.тлн.шгрс пробы
(копий-мл ') Данный показатель лостн 1Жстся при условии обьсма аликногы
1КХОДНОГО магериала (пробы) не мснсс 1 0 0 мкл
3.1.2 Спеинфнчнос 1ь
Специфичность - южнсчюложитгльпые и ложноогрицагелми
рсзулывгы при анализе образцов НК вирусов лихорадок Западного Пила н
ЛОЛИНЫ Рифт (4 злвсломо положительных образца), а также НК вирус
Мярбург. Эбола. Дассв. .VfaHvnn, Хуиин. ВЭЛ. клещевого и японского
)1Щсфалкт{>11, тенге, желтой лихорадки. ККГ71. ТОК’; бактерий /1иаНш
anthroiis. Yersinia /icsin. Corielh hiirnelli. ДИК челззвека н грызунов, культур
КЛ С1Х Ж Ven), GMK и ВНК. а также РК 3 (27 ывеломо отрицательных обращонк
отсутствовали.
При ПроКЛРННИ 1 1ССЛМОМ11И П н^шюдм»:. „„„„„
.и>при,„кги„п«,пш,.. мс»т«г,,шо»очи., „ «с»сср„й„.. кспрои,»,аим,чп.
Д.1Я всех гюложнтсльпых образцов,
3.2 ЛИЛ1ТККТНЧЕСКНЕХАРАКТЕРН(-ГИКИ
Клинические иссчелования набора проведены на базе ФБУН ГНЦ ПБ Век
тор (р.п. Килышво. Новосибирской облвспО
3.2.1 Лнагносгичеекая ч>вс 1ви 1е.т1.нпгть
Д||..жн;т,.чс«а. чу«г.пгс/,.жк;гь ,,р» исслрлоипп» М проб «лггоч-
иы. купнур («пруссол.р*а|,|СЙ «ндкоегш, 12« проб fiiwoornncciioro магерич»
и W. г,р,Ч-. ч.«,™стоно,т ( 2*» проб). conq*a„,n< .«русы ли.
XOP1.I.IC (аомного Пила н лихорплю, долнии Рифт с хошкнтрапной
|х | 0'ко 1|иГ|'мл, опложитсям|ий рлулктат по.хучсн > 2«К .-лучмх. Лнагипсти.
ч «.м лу,ог,»«лкиость - и. исисх 94 •/. с докрителиюй «грттиостьи, 90 %.
.1.2 .2 / 1нв| ностнмееь'ая спеимфнчнпсгь
/1нагностчсикал спсоифичнастк - при псслсломнии 4« ОтрН 1иТ9ЛкНих
обратио., солоржатих оггсролоп,чик,е «нхрооршинзми ).,рус„ „сшамго
.ниефалига, желто* лохоралхи, хпонсхою Ж 1 1а|хиита. лсигх, юоесутлксхого
шосфалоиоолит. лошалей) « хоопрнтрации нс нсисс 1,0' 1 0’ хопик'и.,. отрноа-
.слкюай от.ст в 1ЩР получен т жгс, ай случаах. Диатоостичссха, сосоифич-
ность - нс менее 95 % с довсрнтсльпой вероятностью 90 %.
Про ороаслсоии исслсдоаший оаОлюдалась оолнаа
М|у.рооостано 1ючнаа, мсжоостаиоаочоаа и осжссроВпая жкороитволихнхгтк
для всех ппложнтсльных образцов.
а МЕРЫ 11РЕЛ(ИТОРОЖНОСТИ ПРИ РЛЮТЕ с НЛЬОРОМ
Работу с материалом, таражсоным или подозрителкным на |араженностк
вирусами янхорадо, Заиалпоге Нила и датины Рифт проводат • соотасктаии с
трсбованивми саиитарно-тпидсмнологичсскнх правил по беюоасности ра&та
с микроорганитмзми I-II ipyon патогенности )опасиооти) ГСП 1.3,3118-13).
методичеехих уиатаний ..Органитапих роботм лабораторий, исполктутоших
--- стр. 53 ---
меткам амплнфнкаини нук.чсиниямх кисло! при pa5oic с читсридлом,
солсржаии1м M HKiKK>pj4HHjMH I-1V групп гштогатоон» (MV I .V25f>9-(>9i,
МУ 3.1-1027-01 «Сбор, учсг и полютойка к лаборигприочу ксслс.юшжиго
KpoBocivyiUHx Ч.КННСПЧ10ГИ Х - nqxHoc'iMKon волбулн гелей iipnpo.'iHO'O'iaroma.v
инфекций» и мешдичсских укамниП «Mepoiipnini* по борьбе с 1ихор.1лкон
Чаиалного Нила на терригорни РосснПскон Фслерв1шн» (МУ 3,1.3 2МЮ-1П).
Ксобхолнио одновременно обсс 1 1е'1ить н еоблмлать нсрсогсалом ripami.ia
бнологичеекой бе 1олас 1нкти н требованиа к органн1аинн и rTpoae.ieHHHi лакиыч
работ с иелью нрело 1«рашения конта.минанин нуклеиновыми кнс.итгачн и (или!
амп.тнкиначн исследуемых прогЗ пометеннй к оборуловання
11о1снннальний риск ирнченения набора - »угасс 3 (н Ч приложения \« 2
к прнжалу Мин права России от 06.06.2012 .Ss 4и>.
4.1 Необкплнмогть обучения персоиа-та
Для выпстлнсння аналн1а с номошьи} <1ант>го иабс<ра реагентов нс«)бхо-
димо участие специа;нн;тв е высшим мслининским обрамтианием. пришс.тшсго
обучение на лицеим<ровмнных курсах сг№Ш»алншцнн по работе с ИЬ.Л 1-
N групп натга-сннос™ и по ГЩР-лиагнистике. а также .гзбоража со qrc.iHHM
снениальным мслииннскни обрвзованнем. Персопа .1 лотжен иметь навыки ра
боты с биохимическими релкгннами и современным табориториым оборулова-
инем
4.2 Мери бек 1ласиоС1и. ишволиютие ире-тхранить оперятра
При рабогс с набором атблюдать требования ГОСТ Р 52405-200? «Лаб 1> -
ратории мелииннские. Зребовония бетопаежтети». Нее кочпонсшы наСк>ра в
испольтусмых конис 1праииях яв-иются нетоксичными, врелиого влияния на
органиш гнтеротора нс окатывают. При работе с набором следует соблюдать
обычные меры прелосюрожиости для лаборатории
- нолкюватьсн лаб1траторными лерчаткачн и ндтсвать лабораторные ха
латы:
• ис ирниимап- пищу, пить или курить в лабораторных помещениях:
- после работы с пробами л реактивами еяелует тщательно вымыть руки
полой с мм.том.
Птбсгвть контакта с кожей, гламми и слитистыми оболочками, при гтона-
лаиии на ник кочионс 1гтов набора промыть большим количеством води. При
приеме ннутрь компонентов набора реагентов за че.тииннской помощью следу
ет обратиться нечедтенно.
4J Иеобкиличме меры иредоеторожноети в отнотгнии влияния фи-
ткческнк фак-торив
При нспольтованни набора реагентов нет исобкодимос1н принимать ме
ры 1 1редосторож1ккгти в отношении B.TKaHHfl магнитных палей, внешних элек-
фических яот.теИствий. тлектростятичсских рвтрялт. .тяялсння или иерепвлов
давления, перегруткн. источников термичсско1х> воспламемеиня.
4.4 Необхо. 1имые меры прс-юггарожноети против сиеиив.тьиых рис
ков
Прн иеппльтованпи набктра реагентов нсг необходимости принимать ме
ры прел1Ч'ГОрожностн против лмтбых С1 1еина.ты1ыя рисков при нспо.тыованнм
или {к-алитации, поскольку в состав нгтелня не яхохигт вещества человеческого
или животного происхождения с учетом нх потенциальной инфекционной при
роды.
5 О В О Р У Л О В Л Н И 1 ; и м атери.\лы. необходн.м ы р при РА БО ТЕ ( Н А БО РО М
5.1 Рскименлусаюе измгрите.тьног оборудование
Прнбтф лл» 1П1Р-1’В шрегнпрнрованный в РФ как мелииинскос
игтелне и имеющий каналы легекиин, соответстиуимцис крвеителам РАМ. R6G.
ROX. Су5 (.тнбо их спектральным аналогам) со следующими харагтсрнстнкаин
- « (№1 490им'520нм, Лк2 - 525нм.'550нм. 550нм/5Я0им.
.4*4 6.30пк'665нм), например. «АПК-32 (32М. 48)н. CFX-96.
5.2 Укв танин п необходимосгн нспи. 11.мжаиня спецна.жиого
о б о р у . 1 0 В Я К Н Я
Работу с набором е.телуст ир 01юлитт1 в настольном боксе i
бэктсрниилтчЗ лампой (например. ЬАВ-ПЦР-*-Ламннар-С> *, <КЮ «Ламиплрные
системы», г. Миасс. Россия), усгановленном в рабочей ктс 3 (NfV' 1.3.2569-09).
5.3 Дтируютне устройсгия
Набор авгоматцчсских пипеток переменного обьсма на 0.5-10 мкл.
2 - 2 0 мкл. 1 0 - 1 0 0 мкл и из 2 0 - 2 0 0 мкл
5.4 Другое иснользуечое г»б(*рудовяниг
Микроиентрифугя воргскс «например. <<Инк;юи-ми-90Ь>г:
микроценгрифу! а .шя сгрилов (например, «11нклотсмп-90.1»).
штатив тина «IsoFreezc»,
ипагиа для работы со сфннами (кат номер t'1-t 5.1КХ> (..итоя):
штативы для наконечников. миь|юпр1>бнрок на 0.5 и 1.5 м.т:
хо/юлитлнк на 2-8 *С.
5.5 ..Забораторнан посуда
Ыкосгн для сброса иакопечников и микроиробнрок.
5 . 6 Мятерна.ти и реагеигы. не вхптятие в соетвв набора
Одноразовые ртаконечиики хт* иипсток псремеин 1'цр объема с
U рр!гюлы1ым бары*|ч>м до И) м
одноразовые наконечники .хтя пипеток переменного обьсма с
а гро'то.тьным бярьером до 2 0 мкл;
одмораювыс наконечники для пипеток переменного объема с
ит(нгц>л||НЫМ бяртлром до 2 0 0 мкл;
набтф реагентов хтя вылеленпя ДНК РНк':
ГЕ-буфер (кат. номер В-014. (ХЮ «( интол»):
отдельный ха-тат и оджтраювыс медицинские тгерчатки;
мрмплект средств для обработки рабочер о места.
6 Л Н Л .П О И Р У Е М Ы Е П Р О Б Ы
По.тучение и обработка биологическою мате(шата. тараженного или
подозритедыцмх' на зараженность возбудителями лихорадок Западного Нила н
долины Рртфт. не являются частью процедуры анализа с использованием набора
реагентов «ОМ-СкринЛЗН.'ЛДР-РВ».
6.1 Тим исслг.дуеимх пбранюв
Магеривлом хтя исслсдоваинй служат препараты нуклеиновых кислот,
выделенные из проб i» 6w;iaoB окружающей среды, воздуха, насекомых, проб
К.1И Н И ЧССКИ Х образцов (цсльн«н1 крствн. сыворотки шили плазмы крови,
лейкоцитарной фракини крови. СМЖ), вируссодержащей суспензии, а также
проб биопсийною и аутопсийногчт материала.
6 .2 Процедура получении би 1>лптическ1ио мятгриа; 1а
Лля проведения ОТ-ПЦР-РВ забор проб крови и спинномозговой
жнльчюти проводи в ранние сроки болезни (а период внруссмии). Дтя
прелотвращеиия свертывания кровь отбирают с ЭДТЛ либо цитратом натрия,
испольтовагь гепарин запрещается.
Отбор проб насекомых осуществляют в соответешни с МУ 3.1.10274М
«(’бор. учет и подгшовка к лабораторному исс.тсдованию кровоакуших
'i.iCHHCTOHOi их - переносчиков возбудителей ирироажт-очагхшых инфекций».
11робы воздуха (бнологнческ(мхг азрозоля) отбирают с гюмошью
спс1|на.тьиых нрибнтров. снаряженных сорбирующей жидкостью или
фильтрами. Объем исследуемого воздуха должен составлять не меиес 2 м\
6..3 ()| раничеция по игш>.зъзаваимю аиа.тизнру1'ми1о матерналя
/Еля выделения ПК используют зарегистрнроааииые н»б<.*ры реагентов
С!М)брашо происхождению проб. Л?я достижения 1юказагепей анаянтнческо1 1
чувствнтсяьжютн объем аликвхггы исходного матсриата (пробы) должен
составлять не менее 100 мкл. Полученный препарат НК используется хтя
нровеления анализа с по.хюшью набора pcaicHToe «ОМ-Скрнн-ЛЗН'ЛДР-РВ».
Н кааслую партию вылеления наряду с исследуемым материалом
необходимо включать отрицательный контроль яыделення |01СС)-В). который
--- стр. 54 ---
потом 1 1бя 1ат«лы11> aiiajiHjHpycrte в ОТ ПЦР-РВ. !>то птволяет котролн[>оват»,
в о1 Мпжн>’ ю к о н т ам н н я к и ю нл iranc вмлспспия НК
Для контроля вьиелення нук.' 1енновых кислот нспользуют проонрку с
Ш1К-Н-РМК И1 cvKTaea набора реаггнтов «ОМ-С'крнн-ЛЧН/ЛДР-РП» Сухое
со.1сржим(>с ВПК-В-РНК ранюляг 500 мкп ».чн>снтя ит составя наборов
рсягентрн лля вмлелеиня и 1 0 мкл лолучемного раствора лобавляии в пробмрку
с гтробоП иетюсрслстмкно nqил ансчтснисм copOcHia. PciHCtpaUHH р<к-та
сн1на.та по каналу 1-ЛМ евнлетгльствует об успешном пылелеюш ГНК
6.4 УС.ТОВНЯ транс11ортир4»вя11Ия и йо1можнл|п хранения
вна.тнтируемых обрашов
Пробы об-ьекгов окружающей срелы. платму и сыюрот' крови хранят
мри темпер.«туре от плюс 2 до плюс S Ч' нс балсс 2 суток, при температуре от
минус 16 ло минус 20 Ч' ис более одною месяца, ирн гем 1нгра1уре минус
н.ш в жидком амттс в течение I шла. >тс лопуская nxt оттан1тя1тя до пр>твелення
исслсловамин Обратим тканой хранят при температуре минус 70 нлн в жил-
ком аитте в течение I ru;ia.
При иморижимшии клинического мзтериа.та сю трамспоргировка также
.юпжиа иронолиться в тамс^рожином стч'тоянин Лспу'скастся толькхт
однократное таморлживанис-огтаиавннс обранюа.
6.5 Меры прглосторожности к чя 1Сряа.|у нсстеловакня
Учет, храменне. перелвча и транспстртттровапне биологического мзтерна-
.па. поло1рн 1с.чьного на на.тнчи« вотбуди1е.тен лихорадок Запалноггт Ннла н до
лины Гкфг. должны осу1исетв.1яться в окттвсктвнн с .теЛствуюшими сашггар-
ио-тнлемнологичеекнмн п(>аяиламн по бехшаончпи ршиттм е мпкрснт^нннит-
M UM H 1-П групп iiaroivHHiKTH (опасности) (СП I D.1IIK-I.1) н лействуюшимн
слннтарнммм правнпамн о лоря.ткс учета. хра1иЧ1Ня. передачи и транстюртиро-
ивиня мнкрсюрсинн'тмов MV групп патогенности
Клинический материал утилизируют по классу В. как чрст 8мча(н10 ?пи-
лемиоло! ическм опасные отходы в соотвсгстени с Саинтарно-
HiiucMHO.TUi нческимн требованиями к обратенню с мсдиитшскимн отходами
(СапПиИ 2.1.7.2790-И»,
7 110Д1ОТОВКЛ РКЛГКНТОВ Д1Я ЛПЛ.1ИЗЛ )
7.) npoiii'.iypa нрн 1ап 1н.1ення Kompaibiiui вбрашпв
В пробирку с сухим со.держимым ПКО-.ПН/ЛДР добавляют
200 мм ОКО. перемешивают на вортексе до поянию расгвирения.
центрифугнрунгг 5 секунд при .1000 о 6-мия '. Хранение равсленных
препаратов 11КЧ)-Д1НЛ1ЛР лолусгается при температуре не выше миагус
20 X.
7.2 Ратаечение препарата РНК (при мевбхп.твмости)
Для ныян.теиня и н. 1ентнфн|салии РНК вирусов
.тихора.лок кшалного Нила и ло.тинм Рифт необходимо внести в рсакпию
20мк.т препарата ГИК. П случае необходимости, раствор препарвта РНК
разводят с 1Ю М О Ш ВЮ ТЕ-буфера (пт. номер В-014. ООО «Синтол»).
Н IIPOBEUILHIIL .Л.11ЛЛИ1Л
K.I Расход каждого реагента (иинима.Т1>ныи)
Ив одно »лрсле.1сн1к расходуются:
• одна микр(Н|робнрка с Р('-Л'11Ш1ДР:
• 1 5 м к л Р Ь .
На каждый ана.1нт росхстлутотся:
- 20 мкл ПкЧК13Н/.1ДР;
- 20 мкл ОКО
6.2 П»сдедевяге.1ьиос 1ь проведения ттаиов анвяита
Аналит с помошыо набора рсагеитов прополите» в олнн ттал:
• включают прибор. за1гускают программу в соответствии с инструкыисй
по тксплуатацнк.
- вводят параметры гемпературно-времекнош режима ам|шнфнквини со-
г.тасно 'габ.шце I н вводят красители ^ ЛМ, KMi, R04 я <'т5;
1 2
Таблица I - Гемперлтурно-врсменной режим амплификации
Ц/Ц Тсмпсратуршьвремсннон режим Число UKK.'ioB
50 Т - 900 секунд 1
2 9.5 %• - 300 секуил '
60 Т 40с«уил
. Гчитт4вяннс сигнала ф.|уоресцемцни 50
95 ®С - 15 сскуч»д
• вшт.тят сйс.тсння об образцах по всем красителям н акгт<нирук>т прибор в
с*хттвс1ст1*ин с РУКОВОДС1ЯО М по тксплуатацяи:
При работе с РНК необходимо испольювать то.тько однораюкме
пластимтыс рягхотные матсрнв.тм. ичею1ние спеинальнунт н1Вркнр<1нк>
••RNaxe-free». «DNnsc-Ггес».
• набор реагентов итвлекают из холодильника. РВ и ОКО псремстивакп
на В1>ртексс и центрифугируют в течение 5 секуттд при ,1000об мин ';
- цомсчпактт микропробнркм в стрипах (РС-Л 1Н/ЛДР 1 в штатив ,гтя
стрипов типа «lst>Prce7c»* н .маркируют в соответствии с протчжолом исследо-
нания на боковой с'гснкс пробирки: открывают крышки микроцргмжрок н вно
ся! в них по 15 мкл Pit:
- нсрюлыуя наконечники с атризольимч барьером, последовательно вно
сят а мнкропробирки спответсгвеннп порялху иссле.-швания обра щов по 2 0 мкл
ОКО. ОКО-Н н далее по 20 мкл растворов исследуемых 1>6ратиоь в нсобхоли-
мой тювторцостя**. чакрываюг крышки лаинмх микропробирок:
• П1М КЯТ я ммкропробиркн соотвеп;гвемно маркировке но 20 .мкт ПКО-
.1’ ЗН/ЛДР. закрываюг крышки .ланных микроирсЧзирок.
• перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и истрифугн-
рукп 5 секунд прн 1000 об-чнн' :
•Примечание: До начата работы штатив рекомендуется охлали 1ь в быто
вом хож 1дн. 1ьникс до температуры 2-Я ®С
••Примечание: каждый обратен рскоменлуется аналнп 1;н>на!ь н двух по
вторах.
ВНИМАНИЕ! Пос. 1С емпняваиия К -.ПН/ЛДР, разбм 1гтс.1Я и пре-
иар:ия ГНК. мнкропробирки сразу устамо« 1ПЪ в амялмфвкагор я хаму-
стить ОТ-ПЦР-РВ.
Помешают микропробмркн в прнбе^ • соотяетствин с протокатом исеяе-
довання (таблица 2) и прикатывают крышки мнкро1гробмров.
Таблица 2 - Гекоменлуемый порядок исслеломния обрашов
Лшч»Лкы
1 ПКО-ЛЗН/ЛЛР
Г~ 2 пко-лзн/лш-
у око
4 око
5 око-в
А око-в
7
% иссаааусммй еЬмн (швЙаЗ 1
9
10 иосясазчммй обвезем (авева) 2
' П
- такрывают крышку прибора, запускают ремняю ОТ-ПЦР-РВ и фикси
руют в рабочем журнале иазааине файла с результатом работы приборе, рве-
четшк время молила состаашет а сред1км 2 часа.
8J Проис.тура измерения и опенки ретультвтов ама. 1ни
Оценку рс 1уяьтвтоя прояолят с помооом) прнбороя дня ПЦР-РВ. напри
мер. аЛНК-32 (32М, 48)», CFX-96 или левнаалектные им (см. п. 5.1 насгияв|аА
инструкции).
Кинетическая к^шпая роста сигнала флуоресценции (регнстра1тя росте
сигнала) означает любую величину порогового цикла С( менее 50. Отсутствие
рсгисг|К1иии рхкга сн 1иа.та прибором опнсыавсгся программой прибора,
например, как величина порогового никла (Ct >— 5# в приборах ЛНК), либо как
ее огсук'гвнс (N/A в приборах фирмы BioRad) и т.п. Подробная информация
иринсленя в руководстве по зксллуатаинм конкретного прибора.
Книегпчсскаа хтжвая роста сигнала флуоресценции по каналу R6<t либо
ROX 0 1Н1ТС М ГС Л Ы Н ) отрниазельноги контроля означает регнетрапию роста сиг
1 5
--- стр. 55 ---
нала и свилетельстауст о наличии с-нсинфичсских фрагмснгов НК вирусов ЛЗН
или ЛЛГ в лан1н)й микропробнрке
Кинстическа* кривая роста сиг шиш флуоресценция но каиалу С>5 в слу
чае отсутствия нолчтжигсльной динамики по каналам RM i н КО\ отначаст ре-
гисфаиин! р(ч.-та сигнала и сннлетсльствует об успешпом прохождении реакций
ОТ и 11Ц1’ РВ. и нолтнерждает отсутствие специфических фрагментов НК ви
русов ЛЗН и ЛЛР в данной микронробирке.
Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналу I ЧМ в
слумае отсутствия 1тложнтсльной динамики 1ю кана-1лм RhC; и КО\ отначает
регистрацию роста сигнала и свидетельствует об успешион вылелении РНК нэ
пробы, и дополнительно полттк^ждает отсутствие специфических фратмеитов
НК вирусов и ЛДР в дайной микрттробирке.
Учет рпультатов анализа (толкование характера реакций)
Результаты анатмза не подлежат уче 1\
• в случае регистрнции роста сигнала ОКО ио кама, 1ам к 6<; и;т КО\
(ЛОЖЦОПОЛОЖИГСЛЫ1ЫЙ результат всею чксР1еримспта). Величина порогового
цикла Cl при )Гом не имеет значения;
■ в случае тсугствня регистрации роста сигнала ПКО-Л и1/.1ДР ио кана
лам RMi или ROX (ложноотрицателытый результат всего лксперичента),
• в случае отсутствия (ниистраиии роста сигнала по каналу С у5**" (лож-
тюгрицательиый ретуяьтат в конкретно»! мик 1Ч'пр«»бирке).
Реэулыягм ана. 1иза поллежаг учету:
• в случае отсутствия регметраиии роста сигмам ОКО по каналам КМ. и
RC)\; ^
• в с.тучас регистрации роста сигнала по каналу ( ><•••, с любой величи
ной порогового цикла С|;
- в случае регистрации роста сигнала П1СО%Л311/ЛЛР по кана.там КйС: и
ROX. с любой величиной п<ч>огового uHicia Cl.
Регистрация роста сигнала по каиа-ту RMi в пробирках с препаратом НК
свидетельствует о на.1ичии в образце специфических фрагментов РНК генома
вируса лихорадки долины Рифт. Величина iioporoaoio цикля О при ттом не
имеет значения.
Рс»нстрация роста сиппза по кана-ту ROX в пробирках е прелатом НК
свилегсльствуст о наличии а образце специфических фрагментов РНК геном
вируса лихорадки Западного Нила. Величина порогового цикла С! при ттом не
нмссг значения.
Регистрация роста синила по каналу Гу5*** с пороговым никлом Ct х»с-
нес 37.0 свидетельствует об успешном прохождении обратной тракскрипцнн и
ПЦР-Р» ■ каждой конкретной мккропробнркс. большие значения Cl свидетель
ствуют о некотором нйгнбнроваиии ОТ-ПЦР-РВ
В слу'ие лобввлсяня ВПК-В-РНК на ттапе выделения НК:
- ре 1истраиия роста сигналя по канолу 1’ЛУ| с пороговым циклом менее
37.0. сямдегсльствует об успешном выделении РНК из пробы, большие зиаче-
П И Я Ct свилетсльств)пот о некоторых потерях иа зтапс яыделеиия РНК.
Иитерпрстяция результатов аналии осуществляется в соответствии с твб-
лицей 3.
••• Примечание: а пробирках, имеюших регистрацию роста сигиала по
кана-зам RMj и-ти ROX с пороговым шлезом реакции менее 30.0. допускается
огсутсттшс рсгистрацип роста сигнала либо низкая ампл»гтула кинетической
кривой по канхзам Губ и f ЧМ.
••• Примечание: а пробирках, имеюших регистрацию р»кгга сигнала по
каналам R6G или КОХ с по(ч»пи№1м циклом реакции менее 30,0, допускается
отсутствие ретистраини роста сигнала либо низкая яыплитуда кинетической
кривой по кана.1ам Суб и h \М.
Габлииа 3 Ингсрпрсгпция результнюв анализа пр»тб с помощью набора
реягентов wOM-Скрнн-ЛЗН 'ЛДР-Р В » ____________________
mtcTHveeicaii к'рнмя р1«ста С1
иа.1» ф.1згЧ*счзснции 1М» »«и»л> СХ>рвк
I I ROX Т t >6
Privn.TaTM всего яназн и яс иоллежат учёту • любом и > с.зсдзюшмх слу'
' мпАоА
PciVTI.TlT
Ложноатрмиательммй рету.ткг» .
шпчбмрлиниё О {• М ЦР - PH
Лтл*опожпгитс 1Ы1ый рпульел!.
я иропёссс кылсленил II
Лпяпмчтпожигезьнмй рету-зьтаг.
контямннвиия я ubtc тн.'1аиои1>'>1 ОТ-ГИ |Р-
I ана.1Н1л нс iitixicxai учету .гзл конкрстноГ! пробы
Лож<к1Птрнпаге.1Ьима резумы;
и»1Г>ЯЧ«роыиис ОТ-ПЦР-РВ
'|ох1юиф*'1|ат1С.зы1мй резумьтят.
HCaucTrrosiMM 1ффек1яят«'и. яы.к-i
Рпулцтаты яиа.зиза сихялежлт учету при погучемии с.зслующих результатов
|Наввр |>саг1л м з б Ы »IIKO псинфичен в OTtioitiemnt
■НК яивусов .'ПН и ЛДР ____________
O M K R
ОКО
Кокгамипаиия (мсутегяутт
пйе не обняруастмы НК
янцусов Л 7Н щ ЛДР_______
Н np>4Sc присутезвуют НК вируса Л Ш
пробе присутствуют НК вирусов
|ЛДР н ЛЗН___ ___________
* 1 1римечамит. я случне лобавлом’* ВГ 1К-К-РИК чв «гаме яы:к.1с«ия ИК
9 Р.ЛСЧЕГЫ
9.t Ис 11и.'1ыусмые кпмпью 1ерпые про» римчы
Для прояслсиив ОТ-ПЦГ-РВ и оиенкн сС результатов ис 1юльзукп ciieiiH a-
лишровантге программное обсспечеиие. поставляемое прсттяоднтслсм прибо
ра. например программа AHK,Shell )»е|кия 33 и выше. |к>стаа. 1яемзя с прнбо-
рими «АМК-32М»», «АНК-48» или Bio-Rad CFX Manage» 2.0 н выше, ткгавляс-
мая с прибззром CFX-96 Работу с программным обеспечением гюу|цест*ляк>т
COI ласно руково.хству по тксплуатаиин мриОира.
1П УСЛОНИЯ ХРЛНКНИЯ, IPA1K 110Р1МР«»ВА11ИЯ И ж е п л у -
ЛТЛЦИИ НАБОРА
10.1 Условия храмсимя «яборв
И С01ЛЯС1С1Н И И с 1"У 939S-00M639599.'S-20I3 • в сухом, «изитсниом т
света месте, при температуре от плюс 2 до плюс И Ч‘. Суммарный срок хране
ния при температуре от плюс 9 ,v> плкч- 20 <' нс должен преяыпштз. 14 сутезк в
течение срззка голшигги набора решентоа
10.2 Ус.зпямя |ранспир 1ировяння набора
Тр;«ис|1орзи|хзва(жс набора peaieifioR «ОМ-<'крин-Л1Н/ЛДР-РВи должно
иронзволигься в соотнегегвни с ГУ 93ЧН-<Ю1-46395995-2013 крыгым грансиор-
Ю М (автомобнльиым. жс.1с»модорожным либо воздушным) при температуре от
плюс 2 до плюс К Ч'. Допускается трянспортир»>яание до 14 суток при темпера
туре до пл»ос 2 0 ®С
103 Срок И 1.1НОС1И набора
Грок гидиисдн па(юра pcaieinoa состаалаег 12 месяцев с даты выпуска
прслприятием-изгоювнтелсм. CqMH наборов реагсмпза с истекшим сроком
тгхдности применению не подлежат Срок годности «скрытых реагентов соот
ветствует сроку годиостн. указаииому и.з зтикстках лла певскры 1ых реаге|ттов.
если я шмлрукиии но указано итк. Срок годгюсти разведенных препарятон
111С(К'1'1Н/ЛДР и HIIK-B-PHK пе более месяца при температуре хранения нс
аышс минуз* 2 0 *С
10.4 Ииф«р« 1яиия но безвпасной .vih .(hiriihh
Испо.зыоаанныс пробирки с амплнконлми, пак'*нечмнки, перчатки, ве
тошь для обработки поверхностей в ПЦР-боксе. собирают в пластиковые за-
крываюшнеся емкости, выносят в рабочую зону 4-1 либо специально предна-
значениос вспомогатс.зыше помешенне (МУ 1.3.2.669-09) с целью поевелукипсЯ
ииакзипицип счилясио зробояапиям СанПиИ 2.1.7.2790-10.
Наборы с истекшим сроком годности, а также в слуз«е повреждения улв-
копки, утилизируют по классу А, как зпилемио.зогнчески безопасные отходы,
по сгктаву приближенные к ТЬО (СанИнН 2.1.7.2790-10),