Набор реагентов для выявления ДНК боррелии бургдорфери (Borrelia burgdorferi) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (БОРРЕЛИО-ГЕН) по ТУ 9398-013-46482062-2006 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
П риказом Росздравнадзора
от 200 г №
УТВЕРЖДЕНА
ый директор
К-Технология»
Д Ю .Т роф им ов
УТВЕРЖДАЮ
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для выявления ДНК
боррелии бургдорфери {Borrelia burgdorferi)
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
(БОРРЕЛИО-ГЕН)
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов БОРРЕЛИО-ГЕН предназначен для выявления in vitro
ДН К боррелии бургдорфери {Borrelia burgdorferi) методом полимеразной цепной
реакции (П ЦР) в биологическом материале (в образцах плазмы крови человека и
в иксодовы х клещах).
1.2. Н абор реагентов БОРРЕЛИО-ГЕН может быть использован в
клинической практике для диагностики болезни Лайма.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2.1. П РИ Н Ц И П ДЕЙСТВИЯ
П ринцип метода основан на использовании процесса амплификации ДНК,
заклю чаю щ ейся в повторяющихся циклах: темпера-д; |р н и ДНК,
--- стр. 2 ---
отж ига праймеров (затравок) с комплементарными последовательностями и
последую щ ей достройкой полинуклеотидных цепей Д Ж -полим еразой.
В наборе БОРРЕЛИО-ГЕН в смесь для амплификации добавлен внутренний
контрольный образец (ВК), предназначенный для оценки эффективности
протекания полимеразной цепной реакции.
В смесь для амплификаций введены ДНК-зонды, каждый из которых
содержит флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В случае
образования специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, что ведет к
возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными
приборами.
ДН К-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации
ф рагмента генома боррелии бургдорфери и внутреннего контрольного образца,
мечены флуоресцентными метками РАМ и HEX соответственно, что позволяет
раздельно регистрировать результаты амплификации искомой ДНК и
внутреннего контрольного образца.
Для анализа продуктов ПЦР можно использовать детектирующ ие
амплификаторы, специализированные детекторы флуоресценции (ПЦР-детекторы)
или метод электрофореза в агарозном геле.
Д ля повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено
-2 -
применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой
приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенных
прослойкой из парафина. Смешение слоев и превращ ение их в
амплификационную смесь происходит только при расплавлении п ^ а ф и н а , что
--- стр. 3 ---
исклю чает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном
прогреве пробирки.
2.2. СОСТАВ НАБОРА
Н абор состоит из следующих комплектов:
а) комплект реагентов для выделения нуклеиновых кислот включает:
• лизирую щ ий раствор - 1 флакон (30 мл);
• реагент для преципитации - 1 флакон (40 мл);
• промывочный раствор №1 “ 1 флакон (50 мл);
• промывочный раствор №2 - 1 флакон (30 мл);
• буфер для растворения - 4 пробирки (по 1,25 мл);
б) комплект реагентов для ПЦР-амплификации.
В ариант №1 включает:
• смесь для амплификации, запечатанную парафином - 100 пробирок (по
20 мкл);
• раствор Taq-полимеразы - 2 пробирки (500 мкл);
• буферный раствор «ПЦР-буфер» - 1 пробирка (200 мкл);
• минеральное масло - 2 пробирки (по 1,0 мл);
• положительный контрольный образец ДНК - 1 пробирка ( 150 мкл).
В ариант № 2 включает:
• смесь для амплификации высушенную - 1 0 0 пробирок;
• растворитель- 2 пробирки (по 1,5 мл);
• минеральное масло - 2 пробирки (по 1,0 мл);
• положительный контрольный образец ДНК - I пробирка (150 мкл).
Л
--- стр. 4 ---
в) комплект реагентов для детекции ДНК методом электрофореза включает:
• смесь для электрофореза - 1 пакет (16,9 г);
• агарозный гель - 5 пластин.
В состав смеси для амплификации входят: П ЦР-буфер,
дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентные ДНК-зонды,
внутренний контрольный образец.
2 3 . В рем я проведения анализа ' 5 ч.
2.4. Н абор рассчитан на проведение 100 определений, вклю чая анализ
неизвестны х образцов, положйтелып> 1х контрольных образцов и отрицательных
контрольных образцов.
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ
ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
3.1 СПЕЦИФ ИЧНОСТЬ
В образцах биологического материала, содержащих ДН К боррелии
бургдорфери, после проведения реакции амплификации детектирующ ий
амплификатор или ПЦР-детектор должны регистрировать положительный
результат. П ри использовании метода электрофореза должна быть видна полоса
оранжево-красного цвета, соответствующая фрагменту геном а боррелии
бургдорфери размером 184 п.н. (пар нуклеотидов).
В образцах биологического материала, не содержащих ДН К боррелии
бургдорфери, детектирующий амплификатор или П Ц Р-детектор должны
регистрировать отрицательный результат. При использовании метода
электроф ореза полоса оранжево-красного цвета, соответствующ ая фрагменту
геном а боррелии бургдорфери размером 184 п .я , отсутствует, а полоса,
--- стр. 5 ---
быть отчетливо видна.
3.2 ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ
Чувствительность: не более 2000 геном-эквивалентов Д Н К боррелии
бургдорфери на 1,0 мл образца.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖ НОСТИ
4.1. П отенциальный риск применения набора - класс 2а (ГОСТ Р 51609-2000).
4.2. М ерам и предосторожности при работе с набором реагентов БОРРЕЛИО-
ГЕН является соблюдение «Правил устройства, техники безопасности,
производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной
гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-
эпидемиологических учреждений системы М инистерства здравоохранения
СССР» (М осква, 1981 г.).
4.3. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются
нетоксичными.
4.4. П ри работе с набором следует надевать одноразовые резиновые перчатки без
талька.
4.5. П ри работе с набором следует использовать только новые наконечники и
пробирки.
> г.
4.6. Н е допускается использование одних и тех же наконечников при обработке
различны х образцов биологического материала.
4.7. В ы деление Д Н К следует проводить в ПЦР-боксах или в ламинарных ппсафах
с выклю ченным ламинарным потоком.
соответствующая внутреннему контрольному образцу размером 560 п.н., должна
--- стр. 6 ---
4.8. Д ля предотвращения контаминации этапы выделения ДНК, ГЩР и
электрофореза следует проводить в раздельных помещениях или тщательно
изолированных зонах, снабженных комплектами полуавтоматических пипеток,
халатами, стеклянной посудой и прочими принадлежностями.
4.9. В се лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы,
лабораторная посуда, халаты, головные уборы и пр., а такж е растворы реагентов
долж ны быгь строго стационарными. Запрещается их перемещ едае из одного
помещ ения в другое.
4.10. О бработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-
99. В се рабочие поверхности в лаборатории (рабочие столы, штативы,
оборудование и др.) ежедневно подвергают влажной уборке с применением
дезинфицирую щ их/мою щ их средств, регламентированных санитарными
правилами.
4.11. П оверхности рабочих столов, а также рабочих помещ ений следует
обрабатывать бактерицидными облучателями до и после проведения работ в
течение 1 ч.
4.12. Химическая посуда и оборудование, которые использую тся при работе с
набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться
отдельно.
4.13. И спользованные одноразовые принадлежности (пробирки, наконечники)
долж ны сбрасываться в специальный контейнер, содержащий
дезинфицирую щ ий раствор.
4.14. Запрещ ается снимать крышку с электрофоретической камеры , если она
подклю чена к источнику питания.
--- стр. 7 ---
4.15. П ри работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться
защ итным экраном или специальной защитной маской
5. ОБОРУДОВАНИЕ И М АТЕРИАЛЫ
О рганизация работы ПЦР-лаборатории, оборудование и материалы должны
соответствовать М етодическим указаниям 1.3.1888-04.
П ри работе с набором реагентов БОРРЕЛИО-ГЕН требую тся следующие
оборудование и материалы:
• микроцентрифуга/вортекс;
• обычны й амплификатор или детектирующий амплификатор;
• ПЦР-детектор;
• терм остат твердотельный, поддерживающий температуру 65 °С;
• холодильник бытовой с морозильной камерой;
• центрифуга со скоростью вращения ротора 13000 об/мин;
• одноразовые наконечники с фильтром для полуавтоматических пипеток с
маркировкой “RNAase-free, DNAase-free” объемом 1-20 мкл; 1-50 мкл;
1-200 мкл; 100-1000 мкл;
• пестики-гомогенизаторы для пробирок пластиковых вместимостью 1,5 мл;
• пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объёмом,
позволяю щ ие отбирать объёмы жидкости 0,5-20 мкл, 20-200 мкл,^
♦
200-1000 мкл;
• пробирки пластиковые вместимостью 1,5 мл;
• перчатки резиновые;
• 96% этанол;
--- стр. 8 ---
• физиологический раствор (0,9% NaCl) стерильный;
• контейнер с дезинфицирующим раствором.
П ри детекции методом электрофореза:
• источник постоянного тока;
• камера для электрофореза;
• трансиллюминатор;
• колба мерная вместимостью 1,0 л;
• дистиллированная вода;
• стальная проволока диаметром 1,0 мм.
6. А Н А Ж ЗИ РУ Е М Ы Е ОБРАЗЦЫ
6.1 О бразцы плазмы крови человека.
6Л .1. Взятие крови проводится в пластиковые пробирки вместимостью 2,5 мл
с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью
этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2 мг/мл. Для
перемеш ивания содержимого пробирку переворачивают 2-3 раза после взятия
материала.
В качестве антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия.
В Н И М А Н И Е! Н е допускается использование гепарина в качестве
антйкоахулянта.
♦
Транспортировать и хранить образцы крови до начала исследования следует
при температуре 2-8 °С.
6.1.2. Центрифугировать пробирки с кровью при 3000 об/мин в течение
20 мин при комнатной температуре (18-25 °С).
--- стр. 9 ---
6 .1 3 . Отобрать верхнюю фракцию (плазма) и перенести в пластиковую
пробирку вместимостью 1,5 мл.
ВНИМ АНИЕ! Время от взятия крови до получения плазмы не должно
превыш ать 6 часов.
Х ранить полученную плазму можно при температуре минус 20 °С не более
3 мес.
6.2. И ксодовые клещи.
6.2.1. Ж ивого клещ а поместить в чистую посуду, в которую предварительно
необходимо положить кусок влажной ткани или смоченную водой салфетку
(чтобы не допустить высыхания клеща).
Транспортировать и хранить живого клещ а до начала исследования
рекомендуется при температуре 2-8 °С в увлажненной среде не более 48 часов.
6.2.2. Для исследования поместить клеща в пластиковую пробирку
вместимостью 1,5 мл.
6.2.3. Добавить 1,0 мл 96% этанола в пробирку с клещом, встряхнуть
пробирку в течение 3-5 с и центрифугировать в течение 3-5 с на
микроцентрифуге/вортексе.
6.2.4. П олностью удалить надосадочную жидкость.
6.2.5. Добавить 1,0 мл физиологического раствора стерильного, встряхнуть
пробирку в течение 3-5 с и центрифугировать в течение 3-5 с на
микроцентрифуге/вортексе.
6.2.6. П олностью удалить надосадочную жидкость.
П одготовленный материал необходимо сразу использовать для выделения
ДН К.
--- стр. 15 ---
Таблица 3. Режим амплификации
П рограмма считывания динамических факторов лунок dynam icwf.tmo
№ № п.п. Температура Время Регистратщя
результатов
Количество
1№ КЛО В
1. 80 °С
94 "С
1 мин
1 мин 30 с 1
2. 94 °С
64 °С
30 с
45 с
5
3. 80 °С 30 с * 2
Режим ам пж ф икации
Температура Время Регистрация
результатов
Количество
циклов
1.
94
64 "С
Ю с
45 с * 45
2. 10 Режим «Hold» прибора
П осле прохождения реакции амплификации пробирки (в том числе пробирки,
маркированные ФОН) поместить в ПЦР-детектор, оформить протокол и провести
регистрацию результатов в соответствии с инструкцией к прибору (пороговые
значения для специфического продукта составляют 1,75-2,10, для внутреннего
контрольного образца - 2,50).
8.2. Регистрация результатов амплификации с использованием
детектирую щ его амплификатора ДТ-322 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»).
Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во
время амплификации. Оформление протокола (тип анализа «Качественный») и
анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору (см.^
♦
«Руководство по эксплуатации» для ДТ-322).
8.3. Регистрация результатов амплификации с использованием
детектирую щ его амплификатора iCycler iQ (Bio-Rad).
Регастрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во
время амплификации. Оформление протокола и анализ результатов проводится в
.1 5
--- стр. 16 ---
соответствии с инструкцией к прибору (см. «Руководство пользователя» для
iCycIer iQ).
8.4. Регистрация результатов амплификации с использованием электрофореза.
8.4.1. Открыть крышки пробирок с продуктами амплификации и проколоть в
парафине отверстие диаметром примерно 2-3 мм с помощью стальной проволоки.
П осле прокалывания каждой пробирки проволоку промыть в емкости с
водопроводной водой.
8.4.2. Для приготовления буферного раствора для электрофореза содержимое
пакета со смесью для электрофореза перенести в мерную колбу объёмом 1,0 л,
добавить приблизительно 700 мл дистиллированной воды, перемешать до полного
растворения и довести дистиллированной водой до метки.
П римечание. Буферный раствор для электрофореза можно хранить при
комнатной температуре (18-25 °С) в течение 1 недели или при температуре 2-8 °С в
течение 1 мес.
8.4.3. Заполнить камеру для электрофореза буферным раствором для
электроф ореза и поместить пластину с агарозным гелем в камеру для
электрофореза.
П римечание. Буферный раствор для электрофореза долж ен покрывать
пластину с гелем слоем приблизительно 3-5 мм. При работе с агарозным гелем
следует обязательно надевать резиновые перчатки!
8.4.4. О сторожно внести 7,0 мкл продуктов амплификации из каждой
амплификационной пробирки в соответствующую лунку агф о зн о го геля под
буферный раствор.
16
--- стр. 17 ---
8.4.5. Установить крышку камеры для электрофореза и подключить источник
постоянного тока. Электрофорез проводить при напряжении 20 вольт/см в течение
10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение, устанавливаемое в источнике
постоянного тока, должно быть приблизительно равно 200 В).
8.4.6. П осле окончания электрофореза отключить источник постоянного тока,
снять крыш ку с камеры.
8.4.7. Вынуть пластину с агарозным гелем из камеры для электрофореза, снять
гель с пластины, подцепив его с края, и поместить на экран трансиллюминатора.
8.4.8. Н адеть защитную маску или установить защитный экран, включить
трансиллю минатор и проанализировать полученные результаты. Продукт
амплификации виден в ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм или 310 нм) в
виде светящ ейся полосы красно-оранжевого цвета.
9. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
9.1. У чет результатов амплификации с использованием П ЦР-детектора или
детектирую щ его амплификатора.
9.1.1. Учет результатов реакции осуществляется автоматически с помощью
программного обеспечения, поставляемого с П ЦР-детектором или
детектирую щ им амплификатором.
9.1.2. В биологических образцах, содержащих искомый фрагмент генома
боррелии бургдорфери, программа фиксирует положительный результат
(экспоненщ«альный рост 1фивой). Результат амплификации внутреннего
контрольного образца в этом случае в учет не принимается.
9.1.3. В биологических образцах, не содержапдах искомый ф |^ гм ен т генома
6q)penHM бургдсффери, в котх^ых пш учея п о л о ж ш ^ ы ш й р е ^ л ь т а т
Л 7
--- стр. 18 ---
амплификации внутреннего контрольного образца, программа фиксирует
отрицатепькы й результат.
9.1.4. В случае отрицательного результата на наличие искомого фрагмента
геном а боррелии бургдорфери и отрицательного результата амплификации
внутреннего контрольного образца, программа фиксирует результат как
недостовернъш.
Это может быть вызвано присутствием ингибиторов в препарате ДНК,
полученном из биологического материала; неверным въгполнением протокола
анализа, несоблюдением температлфного режима амплификации и др В этом
случае требуется либо повторная постановка амплификации препарата ДНК, либо
повторное выделение ДНК, либо повторное взятие материшта.
9.1.5. При использовании ПЦР-детектора программа фиксирует
сомнительный результат в слу'чае, если значение для специфики (наличие генома
боррелии бургдорфери) попадает в зону неопределенности результатов i результат
амплификации внутреннего контрольного образца в учет не принимается). В этом
с-ту^ае необходимо повторить исследование данного образца (см .п.9 .1 4 ).
9.1.6. П ри получении положительного результата на наличие генома боррелии
бургдорфери для отрицательного контрольного образца (К-), результаты всей
постановочной серии бракуют. В этом случае необходимо проведение
♦
специальны х мероприятий для устранения контаминации.
9.2. У чет результатов реакции с помощью электрофореза.
9.2 1. В положительных образцах должны быть видны полосы оранжево
красного цвета на уровне полосы положительного контрольного образца,
соответствую щ ие фрагменту генома боррелии бургдорфери размером 184 п.н.
18 ^ ^