Набор реагентов для выявления кДНК вируса денге (субтипов 1-4) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Вектор-ПЦРРВ-Денге-RG» по ТУ 9398-033-05664012-2013 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления кДНК вируса денге (субтипов 1-4) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Вектор-ПЦРрп-Денге-RG» Вектор-ГЩРрв-Денге-RG --- стр. 2 --- НАЗНАЧЕНИЕ 1.1. Полное название набора Набор реагентов для выявления кДНК вируса денге (субтипов 1-4) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Вектор-ПЦРрв-Денге-RG» 1.2. Предназначение набора и его диагностическая роль Медицинское изделие для ин витро диагностики «Набор реагентов для выявления кДПК вируса денге (субтипов 1-4) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Вектор-ПЦРрв-Денге-RG» предназначено для качественного определения (скрининг, мониторинг) кДНК вируса денге в препаратах НК. выделенных из проб: клинических образцов, вируссодержащей суспензии, насекомых, биопсийного и аутопсийного материала. Диагностическая роль набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-Денге-RG» заключавюя в возможности его использования в поддержке диагностики специфических патологий (лихорадки денге) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА); как ускоренного предварительного теста при выполнении культурального и биологического методов исследования и идентификации подозрительных культур; для эпидемиологического мониторинга. 1.3. Область применения набора Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика лихорадки денге, специфическая индикация патогенных биологических агентов, эпидемиологический мониторинг, научные исследования. Набор может быть использован в лабораториях специализированных противоэпидемических бригад Роспотребнадзора (без накопления возбудителя вирусологическими методами), а также в изолированных лабораториях специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе Министерства Обороны. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1. СОСТАВ Набор «Вектор-ПЦРрв-Денге-RG» - комплект реагентов для выявления кДНК, предварительно синтезированной на матрице РНК вируса денге (субтипов 1-4) в реакции обратной транскрипции, состоит из 4 компонентов: Реактив Описание Объем (мл) Кол-во Реагент-1-DENV прозрачная бесцветная жидкость 0,20 1 пробирка 1 Реагент-2-DENV прозрачная бесцветная жидкость 0.20 1 пробирка ПКО-DENV прозрачная бесцветная жидкость 0,20 1 пробирка OKO-DENV прозрачная бесцветная жидкость 0.20 1 пробирка Вектор-ПЦРрггДенге-RG страница 2 из 15 --- стр. 3 --- / ■ ч Реакционная смесь, Реагент-1-DENV, расфасована в пробирку из полипропилена вместимостью 1.5 мл, состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, ПЦР- буфер. хлорид магния, восемь олигонуклеотидных праймеров, четыре флуоресцентных зонда. Реакционная смесь, Реагснт-2-DENV, расфасована в пробирку из полипропилена вместимостью 1,5 мл, состав: фермент Taq ДНК-полимераза. ПЦР-буфер, деионизованная вода. Положительный контрольный образец, ПКО-DENV. расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл, состав: рекомбинантная плазмида, иссушая специфическую вставку для вируса денге. Отрицательный контрольный образец, ОКО-ПОКС, расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл, состав: буфер ТЕ. Примечание: Ингредиентами, которые могут влиять на измерения, являются праймеры и флуоресцентные зонды, основной характеристикой которых для конечного пользователя является температура отжига, составляющая 52 °С. Данная характеристика реализуется с помощью температурно-временного режима амплификации, следовательно, его соблюдение является строго обязательным. 2,2 Количество анализируемых проб Набор реагентов рассчитан на проведение 20 реакций амплификации, включая контроля. Внимание1 Реагенты для выделения НК из биологического материала в состав набора не входят! Реагенты для проведения обратной транскрипции в состав набора не входят! Для полного анализа необходимо дополнительно использовать набор реагентов для выделения РНК/ДНК из биологического материала комплект реагентов для экстракции РНК/ДНК их клинического материала «АмплиПрайм РИБО-преп» производства ООО «НекстБио» (ФСР 2012/1407) или аналогичный, зарегистрированный в установленном порядке и Набор реагентов для проведения реакции обратной транскрипции (например, «Реверта-L» ФБУИ «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. Россия или аналогичные наборы реагентов других производителей). 2.3. Метод исследования Метод основан на многократном увеличении числа копий фрагмента вирусных нуклеиновых кислот (комплементарной ДНК - кДНК) с одновременной гибридизационно- флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, что позволяет обнаружить специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации. Вектор-ПЦРрв-Денге-RG страница 3 из 15 --- стр. 4 --- / Для проведения ПЦР в режиме реального времени (ПЦРрв) и далее по тексту подобрана система, состоящая из пары праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, несущего на S'- конце флуоресцентный краситель, на З'-конце - гаситель. Праймеры обеспечивают специфичную амплификацию фрагментов кДНК. предварительно синтезированных па матрице РНК. Данные фрагменты соответствуют нуклеотидной последовательности участка генома вируса денге. Гибридизованный к матрице зонд во время элонгации цепи ДНК разрушается за счет 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, при этом происходит расхождение в пространстве флуорофора и гасителя, что ведет к накоплению флуоресценции. Накопление флуоресцентного сигнала, фиксируемого прибором, соответствует накоплению продуктов амплификации в реакции. 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1. Аналитические характеристики Исследования аналитических характеристик набора проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) и на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России (г. Москва) в рамках исследования эффективности набора и проведения технических испытаний. При проведении исследований наблюдалась полная внутрипостановочная, межпостановочпая и межсерийная воспроизводимость для всех исследуемых образцов 3.1.1. Чувствительность. Набор реагентов должен выявлять 104 копий кДНК вируса денге в 30 мкл реакционной смеси. 3.1.2. Специфичность. Набор реагентов не должен давать положительных результатов в ПЦР с образцами здоровых доноров или образцами, содержащими генетический материал вирусов клещевого энцефалита, желтой лихорадки, японского энцефалита, лихорадки Западного Нила. 3.2. Диагностические характеристики Клинические исследования набора проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области). При проведении исследований наблюдалась полная внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов. 3.2.1. Диагностическая чувствительность Диагностическая чувствительность - при исследовании 294 положительных образцов, содержащих кДНК вируса денге в концентрации не менее ЗМО5 копий/мл (соответствует 1х 104 копий в 30 мкл реакционной смеси), положительный результат в ПЦР получен для всех 294 образцов. Диагностическая чувствительность - не менее 98 % с доверительной Вектор-Г1ЦРрП-ДепгеЩО| страница 4 из 15 --- стр. 5 --- 3.2.2. Диагностическая специфичность Диагностическая специфичность - при исследовании 180 (2 по 90) отрицательных образцов, содержащих НК гетерологичных микроорганизмов (вирус клещевого энцефалита, вирус Западного Нила, вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита) и 8 (2 по 4) отрицательных образцов, содержащих ДНК человека отрицательный результат в ПЦР получен для 188 образцов. Диагностическая специфичность - не менее 98 % с доверительной вероятностью 90 %. 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. ПЦР- анализ выполняется в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности». Потенциальный риск применения набора - класс 3 (п. 9 приложения № 2 к приказу Минздрава России от 06.06.2012 № 4н). 4.1. Необходимость обучения персонала Для выполнения анализа с помощью данного набора реагентов необходимо участие специалистов не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончивших соответствующие курсы специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II групп патогенности, не имеющих противопоказаний к применению средств профилактики и лечения и к работе в средствах индивидуальной зашиты. Персонал должен иметь навыки работы с биохимическими реактивами и современным лабораторным оборудованием. 4.2. Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора При работе с набором соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности». Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными, вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует соблюдать обычные меры предосторожности для лабораторий: - пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные халаты: - не принимать пищу, пить или курить в лабораторных помещениях: - после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом. вероятностью 90 %. Вектор-ПЦРрв-Денге-ЯС страница 5 из I 5 --- стр. 8 --- При замораживании клинического материала его транспортировка также должна проводиться в замороженном состоянии. Допускается только однократное замораживание- оттаивание образцов. 6.3. Меры предосторожности к материалу исследования Учет, хранение, передача и транспортирование биологического материала, подозрительного на наличие вируса денге, должны осуществляться в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности) (СП 1.3.3118-13) и действующими санитарными правилами о порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. Клинический материал утилизируют по классу В, как чрезвычайно эпидемиологически опасные отходы в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами (СанПиН 2.1.7.2790-10) и СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-II групп патогенности (опасности)». 6.4. Обеззараживание проб и получение препарата кДНК Обеззараживание проб проводят в лаборатории в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лаборатории, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1V групп патогенности». Пробы, содержащие вирус денге, в объеме 1 мл переносят в микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 мл. добавляют натрия мертиолят до концентрации 1:10000 (0,01 %) и прогревают при (56± 1) °С в течение 30 минут. Затем в отдельные микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 мл переносят по 100 мкл обработанных мертиолятом натрия проб вирусов. Во все пробирки добавляют лизирующий буфер на основе 6М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения РНК, и инкубируют 15 минут при температуре (65±1)°С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным. Выделение РНК из клинических образцов и секционного материала осуществляют за пределами BSL-3 в ПЦР боксе в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками, с соблюдением правил выноса предметов из BSL-3 (внешняя обработка контейнера). Выделение осуществляют с использованием наборов «РИБО-сорб» или «РИБО- преп» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия), или аналогичных наборов реагентов других производителей, зарегистрированных в установленном порядке. Очищенные РНК можно хранить до 8 ч при температуре от 2 "С до 8 “С или в течение месяца при температуре не выше минус 16 "С, допускается более длительное хранение при температуре не выше минус 68 °С. Синтез кДНК проводится с использованием наборов Вектор-ПЦРрв-Денге-RG страница 8 из 15 --- стр. 9 --- / / реагентов для проведения реакции обратной транскрипции, например. «Реверта-L» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) или аналогичных наборов реагентов других производителей, в соответствии с инструкциями производителей наборов. После реакции обратной транскрипции готовый препарат кДНК можно хранить при температуре не выше минус 68 °С в течение года. Полученные ооразцы фрагментов кДНК амплифицируют в ГИДР с использованием набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-Денге-RG». 7. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ 7.1. Последовательность проведения этапов анализа Общий объем реакционной смеси 30 мкл, объем кДНК-пробы - 10 мкл. Внимание! Образцы кДНК, полученные в реакции обратной транскрипции, разбавляют равным ооъемом деионизованной воды (деионизованная вода не поставляется) или, в случае использования наборов «Реверта-L», ДНК-буфером, как это указано в инструкции к набору «Реверта-L» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Порядок работы А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР 1. Отобрать необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл в соответствии с количеством исследуемых и контрольных образцов и промаркировать. Внимание! При использовании амнлификатора планшетного тина следует избегать нанесения маркировки на крышки микропробирок. 2. Извлечь из холодильника реактивы. Встряхнуть пробирки с реагентами на вортексе и осадить капли на дно пробирки кратковременным центрифугированием. Все реакционные компоненты дооавлять отдельными наконечниками с помощью дозаторов переменного объёма: 0.5-10, 5-40 и 40-200 мкл. Б. Проведение амплификации 1. Приготовить реакционную смесь для проведения ПЦР и внести в пробирки. a) В пробирке объемом 1,5 мл приготовить смесь компонентов следующего состава (из расчета на одну пробу): Реагент-1-DENV 10 мкл Реагент-2-DENV 10 мкл перемешивают смесь пипетированием. b) Внести по 20 мкл смеси компонентов в заранее промаркированные пробирки. 2. Внести в пробирки отдельным наконечником с аэрозольным барьером по 10 мкл препарата кДНК-пробы, предварительно полученной в реакции обратной транскрипции. Вектор-ПЦРрв-Денге-RG страница 9 in 15 --- стр. 10 --- 3. Поставить контрольные реакции амплификации: a) отрицательный контроль - вместо кДНК-пробы в пробирку внести Юмкл ОКО- DENV. b) положительный контроль (вносят в последнюю очередь) - в пробирку внести Ю мкл ПКО-DENV. Общий (конечный) объём реакционной смеси в каждой пробирке должен составить 30 мкл. 4. Поставить пробирки в ячейки амплификатора и задать программу амплификации. а) При использовании прибора Rotor Gene 6000/3000 (Corbett Research. Австралия) или Rotor Gene Q (QIAGEN) задают следующие параметры в соответствующих диалоговых окнах: - ротор - 36-луночный; - объем реакционной смеси - 30 мкл; - температурно-временные режимы: Температура (°С) Время (минутьпсекунды) Количество циклов 95 05:00 1 95 00:10 4552 00:20 72 00:20 - измерение флуоресценции при шаге 52 °С на канале JOE/HEX/R6G/Yellow; - выполнение калибровки (оптимизации) по каналу JOE/HEX/R6G/Yellow при первом шаге детекции; - калибровка канала JOE/HEX/R6G/Yellovv от 5 FI до 10 FI. После чего запускают программу амплификации и вносят данные в таблицу исследуемых образцов. Ь) При использовании амплификатора планшетного типа задают следующую программу амплификации, руководствуясь инструкцией производителя прибора: Температура (°С) Время (минутьпсекунды) Количество циклов 95 05:00 1 95 00:10 4552 00:20 72 00:20 Измерение флуоресценции осуществляют при шаге 52 °С на канате JOE/HEX/R6G/Yellow; Вектор-ПЦРрв-Денге-RG страница 10 из 15 --- стр. 11 --- После чего запускают программу амплификации и вносят данные в таблицу исследуемых образцов. 7.3 Процедура измерения и оценки результатов анализа а) Анализ результатов при использовании амплификаторов Rotor Gene 6000/3000 (Corbett Research, Австралия) или Rotor Gene Q (Q1AGEN). Анализ результатов амплификации кДНК вируса лете проводят по каналу JOE/HEX/R6G/YelIovv, для этого: 1) нажать в меню кнопку «Analysis»/«AHarni3», выбрать режим анализа «Quantitation»/«Koan4ecTBeHHbiir», нажать кнопку «Cycling A. JOE»/ «Cycling A. Yellow»; 2) отменить автоматический выбор Threshold/Порог; 3) в меню основного окна (Quantitationanalysis/Количественный анализ) должны быть нажаты две кнопки «ОупагтсшЬе»/«Динамический фон» и «SlopeCorrect»/«KoppeKuna уклона»; 4) в меню основного окна «Moresetting»/ «OutlierRemoval»/ «Устранение выбросов» установить значение МТС threshold/Порог Фона — ПФ (NTC) 10 %; 5) в меню «СТ Calculation»/ «Вычисление СТ» (в правой части окна) выставить Threshold/nopor=0,05; 6) в таблице результатов (окно «Quant. Results»/ Количественные Результаты») появятся значения Ct. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов). b) Анализ результатов при использовании амплификаторов планшетного типа проводят по каналу JOE/HEX/R6G/Yellow. руководствуясь инструкцией производителя к прибору. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла “Ct” в соответствующей графе в таблице результатов). c) Результат подлежит учету в случае: появления пересечения кривых флуоресценции с пороговой линией на канале JOE/HEX/R6G/Yellovv в пробах с положительными контрольными образцами (ПКО); - отсутствия положительного сигнала на канале JOE/HEX/R6G/Yellow в пробе с отрицательными контрольными образцами (ОКО). Результат считать положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает страница 11 из 15Вектор-ПЦРрц-Денге-RG --- стр. 12 --- пороговую линию. При этом значение Ct для данного образца должно быть не оольше 40. Амплитуда сигнала при этом не имеет значения. Результат считать отрицательным, если значение C't на канале JOE/HEX/R6G/Yellow отсутствует. Если значение Ct больше 40, то ПЦРрв необходимо повторить и считать положительным в случае повторения результата или при значении Ct не больше 40. 8. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 8.1. Условия хранения набора В соответствии с ТУ 9398-033-05664012-2013 в холодильнике при температуре от 2 С до 8 °С 8.2. Условия транспортирования набора Транспортирование набора реагентов «Вектор-ПЦРрц-Дснге-RG» должно производиться крытым транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) в соответствии с ТУ 9398-033-05664012-2013 при температуре от 2 °С до 8 °С в термоконтейнере. 8.3. Срок годности набора Срок годности набора реагентов составляет 1 год с изготовления набора предприятием- изготовителем. Серии наборов реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежат. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов. 8.4. Информация по безопасной утилизации Использованные пробирки с ампликонами. наконечники, перчатки, ветошь для обработки поверхностей в ПЦР-боксе. собирают в пластиковые закрывающиеся емкости, выносят с целью последующей инактивации согласно требованиям СанПиН 2.1.7.2790-10 и МУ 1.3.2569-09. Наборы с истекшим сроком годности, вскрытые, но не использованные наборы, а также наборы с поврежденной упаковкой, утилизируют по классу А, как эпидемиологически безопасные отходы, по составу приближенные к ТБО (СанПиН 2.1.7.2790-10). 8.5. Гарантийные обязательства производители Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в течение установленного срока годности (1 год) при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора реагентов «Вектор-Г1ЦР|>ц-Денге^О» направлять на предприятие-изготовитель Федеральное бюджетное учреждение «Государственный научный Вектор-ПЦР|.1ГДемге-йС страница 12 из 15 --- стр. 13 --- центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»). 630559, Россия, Новосибирская область, Новосибирский район, р.п. Кольцово, тел. (383) 336-60-10, факс (383) 336-74-09. При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется направить сообщение на предприятие-изготовитель ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу, указанному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию в соответствии с действующим законодательством. Зав. лабораторией молекулярной эпидемиологии особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", к.б.н Зав. ОБТК ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», к.б.н. В.А. Терновой МП. Богрянцева Согласовано: Генеральный директор ООО «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР» Вектор-ПЦРрц-Денге-КО страниц;) 13 из 15