Набор реагентов для выявления ДНК вируса герпеса человека 8 типа методом полимеразной цепной реакции (HHV8) по ТУ 9398-023-46482062-2009 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- Приказом Росздравнадзора Генеральный директор о т____________200 г № _________ ЗАО « Н Г ^ ДНК-Технология» Д.Ю.Трофимов fe 2009 г. УТВЕРЖДЕНА УТВЕРЖДАЮ ИНСТРУКЦ] по применению набора реагентов для выявления ДНК вируса герпеса человека 8 типа методом полимеразной цепной реакции ( HHV8) 1 НАЗНАЧЕНИЕ 1.1. Набор реагентов HHV8 предназначен для выявления ДНК вируса вируса герпеса человека 8 типа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в биологическом материале человека (лимфоцитах периферической крови, ^ сперме, секрете предстательной железы, биоптатах и др). у ^' 1.2. Набор может быть использован в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений и научно-исследовательской практике. 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1 ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ Набор реагентов IfflVS основан на использовании амплификации ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Процесс амплификации --- стр. 2 --- заключается в повторяющихся циклах: температурной денатурации ДНК, отжига праймеров (затравок) с комплементарными последовательностями и последующей достройке полинуклеотидных цепей ДНК-полимеразой. В наборе HHV8 в смесь для амплификации добавлен внутренний контрольный образец (ВК), предназначенный для оценки эффективности протекания полимеразной цепной реакции. В наборах в формате «с флуоресцентной детекцией по конечной точке» и «в режиме реального времени» в смесь для амплификации введены ДНК-зонды, каждый из которых содержит флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. В случае образования специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами. ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомого фрагмента генома вируса герпеса человека 8 типа и внутреннего контрольного образца (ВК), мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно, что позволяет раздельно регистрировать результаты амплификации фрагмента генома вируса герпеса человека 8 типа и внутреннего контрольного образца. Для анализа продуктов ПЦР можно использовать детектирующие амплификаторы, специализированные детекторы флуоресценции (ПЦР-детекторы) или метод электрофореза в агарозном геле. Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенных прослойкой из парафина. Смешение слоев и превращение их в амплификационную смесь --- стр. 5 --- - смесь для амплификации, запечатанную парафином - 100 пробирок (по 20 мкл); - раствор Taq-полимеразы - 2 пробирки (по 500 мкл); - ГТЦР-буфер - 1 пробирка (200 мкл); - минеральное масло - 2 пробирки (по 1,0 мл); - положительный контрольный образец «К-н» - 1 пробирка (150 мкл); д) комплект реагентов для ПЦР - амплификации ДНК вируса ^ герпеса человека 8 типа в режиме реального времени, включающий: - смесь для амплификации, запечатанную парафином - 100 пробирок (по 20 мкл)/12 стрипов по 8 пробирок (20 мкл); - раствор Taq-полимеразы - 2 пробирки (по 500 мкл); - минеральное масло - 2 пробирки (по 1,0 мл); - положительный контрольный образец «К+» - 1 пробирка (150 мкл); е) комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК вируса герпеса человека 8-го типа с детекцией методом электрофореза, включающий: - смесь для амплификации, запечатанную парафином - 100 пробирок (по 20 мкл); - раствор Taq-полимеразы - 2 пробирки (по 5(Х ) мкл); - минеральное масло - 2 пробирки (по 1,0 мл); - положительный контрольный образец «К+» - 1 пробирка (150 мкл); В состав смеси для амплификации входят: ПЦР-буфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, внутренний контрольный образец. В наборах форматов «с флуоресцентной детекцией по конечной точке» и «в --- стр. 6 --- режиме реального времени» в состав смеси для амплификации входят флуоресцентные ДНК-зонды. ПЦР-буфер включен только в комплекты для набора формата «с флуоресцентной детекцией по конечной точке». Комплект является специфичным для каждого формата («с флуоресцентной детекцией по конечной точке», «в режиме реального времени», «с детекцией методом электрофореза»). ж) комплект реагентов для детекции ДНК методом электрофореза включает: • смесь для электрофореза -1 пакет (16,9 г); • агарозный гель - 5 пластин. Комплект используется в наборе формата «с детекцией методом электрофореза». Время проведения анализа - 4 ч. Набор рассчитан на проведение 100 определений, включая анализ неизвестных образцов, положительных контрольных образцов и отрицательных контрольных образцов. 3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1 СПЕЦИФИЧНОСТЬ АНАЛИЗА В образцах биологического материала человека, содержащих ДНК вируса герпеса человека 8-го типа , ПЦР-детектор (формат «с флуоресцентной детекцией по конечной точке») или детектирующий амплификатор (формат «в режиме реального времени») должны регистрировать положительный результат. При использовании метода гель-электрофореза (формат «с детекцией методом электрофореза»), должна бьггь видна полоса оранжево-красного цвета, 6 --- стр. 7 --- соответствующая фрагменту генома вируса герпеса человека 8-го типа размером 293 п.п. (пар нуклеотидов). В образцах биологического материала, не содержащих ДНК вируса герпеса человека 8-го типа, детектирующий амплификатор или ПЦР-детектор должны регистрировать отрицательный результат. При использовании метода электрофореза полоса оранжево-красного цвета, соответствующая фрагменту генома вируса герпеса человека 8-го типа размером 293 п.н., отсутствует, а полоса, соответствующая внутреннему контрольному образцу размером 560 п.н., должна быть отчетливо видна. 3.2 ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ АНАЛИЗА: 1000 геном-эквивалентов ДНК вируса герпеса человека 8 типа на 1 мл образца. 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 4.1 Меры предосторожности - соблюдение «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно- эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.). 4.2 Потенциальный риск применения набора - класс 2а (ГОСТ Р 51609- 2000). 4.3 Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. 4.4 При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые перчатки без талька. --- стр. 9 --- 4.12 Поверхности рабочих столов, а также помещений, в которых проводится ПЦР, следует обрабатывать бактерицидными облучателями до и после проведения работ в течение 1 часа. 4.13 Запрещается снимать крышку с электрофоретической камеры, если она подключена к источнику питания. 4.14 При работе с включенным трансиллюминатором необходимо пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской. 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ Организация работы ПЦР-лаборатории, оборудование и материалы должны соответствовать Методическим указаниям МУ 1.3.1888-04. При работе с набором реагентов HHV8 требуются следующие оборудование и материалы: • амплификатор (для форматов «с детекцией методом электрофореза» и «с флуоресцентной детекцией по конечной точке») или детектирующий амплификатор (для формата «в режиме реального времени»); • центрифуга со скоростью вращения ротора 13000 об/мин; • термостат твердотельный на 50 °С; • микроцентрифуга/вортекс со скоростью вращения 10(Ю-30(Ю об/мин; • холодильник бытовой; • пробирки одноразовые пластиковые объемом 1,5 мл; • пипетки автоматические одноканальные с переменным объёмом 0,5- 10 мкл, 2,0-20 мкл, 20-2СЮ мкл, 2(Ю -10(Ю мкл; --- стр. 10 --- • одноразовые наконечники с фильтром для автоматических пипеток с маркировкой “RNAase-free, DNAase-free” объемом 1-20 мкл; 1-200 мкл; 100-1000 мкл; • одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для автоматических пипеток объёмом 1>20 мкл; • одноразовые перчатки медицинские; • физиологический раствор (0,9% NaCl) стерильный. При работе с набором в формате «с флуоресцентной детекцией по конечной точке» для детекции результатов требуется: • ПЦР-детектор. При детекции методом электрофореза (формат «с детекцией методом электрофореза») требуются; источник постоянного тока; камера для электрофореза; трансиллюминатор; колба мерная вместимостью 1,0 л; дистиллированная вода; стальная проволока диаметром 1,0 мм. 6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ 6.1 Взятие периферической крови проводится в пластиковые пробирки объемом 2,5 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2 мг/мл. В качестве антикоагулянта допускается также использование цитрата натрия. Для 10 --- стр. 11 --- перемешивания содержимого пробирку переворачивают 2-3 раза после взятия материала. ВНИМАНИЕ! Не допускается использование гепарина в качестве антикоагулянта. 6.2 Слюну (примерно 500 мкл) перенести в стерильную посуду и плотно закрыть крышкой. 6.3 Порцию (примерно 50 мл) утренней мочи следует собрать в стерильную посуду и плотно закрыть крышкой. ^ Допускается хранение образцов при температуре 2-8 °С не более 24 ч. Примечание: перед взятием соскоба из цервикального канала необходимо удалить слизь стерильным ватным тампоном. 7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1 ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА К ВЫДЕЛЕНИЮ ДНК 7.1.1 Подготовка периферической крови (выделение лимфоцитов). ^ Внимание! Одновременно с выделением лимфоцитов из биологического материала необходимо провести пробоподготовку отрицательного контрольного образца «К-». 7.1 Л Л Промаркировать для каждого образца (в том числе для отрицательного контрольного образца) по две пробирки пластиковые объемом 1,5 мл («А» и «В») и по одной пробирке с раствором для выделения лимфоцитов (фиколл-урографин). 7.1.1.2 Внести: 11 --- стр. 23 --- с инструкцией к прибору (пороговые значения для специфического продукта составляют 1,75-2,10, для внутреннего контроля - 2,50), 8.2 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕТЕКТИРУЮЩИХ АМПЛИФИКАТОРОВ ДТ-322, ДТ-96 Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во время амплификации. Оформление протокола (тип анализа «Качественный») и анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору (см. «Руководство по эксплуатации» для ДТ-322, ДТ-96), ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации фрагмента вируса герпеса человека 8 типа и внутреннего контрольного образца, мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно. 8.3 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДЕТЕКТИРУЮЩЕГО АМПЛИФИКАТОРА ICYCLER IQ, IQ5 (ВЮ-RAD LABORATORffiS) Регистрация сигнала флуоресценции проводится приборюм автоматически во время амплификации. Оформление протокола и анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору (см. «Руководство пользователя» для iCycler iQ, iQ5). ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации фрагмента вируса герпеса человека 8 типа и внутреннего контрольного образца, мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно. 23 --- стр. 24 --- < f ' 'у V . 8.4 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА 8.4.1 Открыть крышки пробирок с продуктами амплификации и проколоть в парафине отверстие диаметром примерно 2>3 мм с помощью стальной проволоки. После прокалывания каждой пробирки проволоку промыть в емкости с водопроводной водой. 8.4.2 Для приготовления буфера для электрофореза содержимое пакета со смесью для электрофореза перенести в мерную колбу объёмом 1 л, добавить приблизительно 700 мл дистиллированной воды, перемешать до полного растворения и довести дистиллированной водой до метки. Примечание. Буферный раствор для электрофореза можно хранить при комнатной температуре (18-25 °С) в течение 1 недели или при температуре 2-8 °С в течение 1 мес. 8.4.3 Заполнить камеру для электрофореза буферным раствором для электрофореза и поместить пластину с агарозным гелем в камеру для электрофореза. Примечание. Буферный раствор для электрофореза должен покрывать пластину с гелем слоем приблизительно 3-5 мм. При работе с агарозным гелем следует обязательно надевать резиновые перчатки! 8.4.4 Осторожно внести 7,0 мкл продуктов амплификации из каждой амплификационной пробирки в соответствующую лунку агарозного геля под буферный раствор. 8.4.5 Установить крышку камеры для электрофореза и подключить источник постоянного тока. Электрофорез проводить при напряжении 20 вольт/см 24 --- стр. 25 --- в течение 10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение, устанавливаемое в источнике постоянного тока, должно быть приблизительно равно 200 В). 8.4.6 После окончания электрофореза отключить источник постоянного тока, снять крышку с камеры. 8.4.7 Вынуть пластину с агарозным гелем из камеры для электрофореза, снять гель с пластины, подцепив его с края, и поместить на экран трансиллюминатора. 8.4.8 Надеть защитную маску или установить защитный экран, включить трансиллюминатор и проанализировать полученные результаты. Продукт амплификации виден в ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм или 310 нм) в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. 9 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ 9.1 УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ С ПОМОЩЬЮ ПЦР<ДЕТЕКТОРА ИЛИ ДЕТЕКТИРУЮЩЕГО АМПЛИФИКАТОРА 9.1.1 Учет и интерпретация результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с ПЦР- детектором или детектирующим амплификатором. 9.1.2 В биологических образцах, содержащих ДНК вируса герпеса человека 8 типа (специфический продукт): • программа ПЦР-детектора при положительном результате амплификации внутреннего контрольного образца фиксирует отрицательный результат. 25 --- стр. 26 --- • детектирующий амплификатор регистрирует экспоненциальный рост уровня флуоресценции внутреннего контрольного образца и отсутствие экспоненциального роста кривой для специфического продукта, 9.1.3 В биологических образцах, не содержащих ДНК вируса герпеса человека 8 типа: • программа ПЦР-детектора при положительном результате амплификации внутреннего контрольного образца фиксирует отрицательный результат; • детектирующий амплификатор регистрирует экспоненциальный рост уровня флуоресценции внутреннего контрольного образца и отсутствие экспоненциального роста кривой для специфического продукта. 9.1.4 Результат оценивается как недостоверный в случае: • отрицательного результата на наличие ДНК вируса герпеса человека 8 типа и отрицательного результата амплификации внутреннего контрольного образца (ПЦР-детектор); • отсутствия экспоненциального роста уровня флуоресценции для специфического продукта и для внутреннего контрольного образца (детектирующий амплификатор). Недостоверный результат может быть вызван присутствием ингибиторов в препарате ДНК, полученном из клинического материала; неверным выполнением протокола анализа; несоблюдением температурного режима амплификации и др. В этом случае требуется либо повторная постановка амплификации препарата ДНК, либо повторное выделение препарата ДНК, либо повторное взятие клинического материала. 26