Тест-системы "ПЛАТЕЛИЯ" (PLATELIA) для серологической диагностики in vitro — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- PL AT EL IA ® C H M Y D I A IgG T M B Код: 62767 P L A T E L IA ® CHLAMYDIA Ig G T M B код 62767 Набор для определения IgG антител к хламидии методом ИФА IVD BIO-RAD LABORATORIES 3, Bd. Raymond Poincare корп. 14 92430 MARNES-LA-COQUETTE - FRANCE tel.(1) 47.95.60.00 fax.(1) 47.41.91.33 Адрес московского Представительства: БИО-РАД ЛАБОРАТОРИИ 125167, Москва, Ленинградский пр., тел: (095) 721 14 04 факс: (095) 721 14 12 Д.37А, Bio-Rad Laboratories Страница I --- стр. 3 --- СОДЕРЖАНИЕ 1 - КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ..............................................................................................................................3 2 -П Р И Н Ц И П МЕТОДА............................................................................................................................................. 3 3 - СОСТАВ НАБОРА PLATELIA™ CHLAMYDIA IGG ТМ В..............................................................................3 4 - ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБО ТЫ ................................................................................ 4 5 - ЗАБОР ПРОБ, ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЕРЕД ИССЛЕДОВАНИЯМИ И ХРАНЕНИЕ .........................5 6 - МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА............................................................................................................6 6.1 - НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ. НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ.............................................6 6.2 - РАЗВЕДЕНИЕ РЕАГЕНТОВ........................................................................................................................ 6 6.3 - ХРАНЕНИЕ ОТКРЫТЫХ И / ИЛИ РАЗВЕДЕННЫХ РЕАКТИВОВ.......................................................6 6 .4 -М Е Т О Д И КА 6 7 - ВЫЧИСЛЕНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................................... 7 7.1 - ПРОВЕРКА ПРАВИЛЬНОСТИ АНАЛИЗА................................................................................................7 7.2 - РАСЧЕТ ЗНАЧЕНИЯ ПОРОГОВОГО УРОВНЯ (П У ).............................................................................8 7.3 - в ы ч и с л е н и е СООТНОШЕНИЯ ОБРАЗЦОВ;......................................................................................8 8 - ОГРАНИЧЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ....................................................................................................................... 8 9 - ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................................................................................8 9.1 -ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ PLATELIA™ CHLAMYDIA I gG ТМВ 8 9.1.1 - ТОЧНОСТЬ МЕТОДА.................................................................................................................................8 9 .1 .2 - ИЗМЕРЕНИЕ КОРРЕЛЯЦИИ...................................................................................................................9 9.2 - ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ PLATELIA™ CHLAMYDIA I gG ТМВ 9 9.2.1 - ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ....................................................................................9 9.2.2 - ОЦЕНКА ПЕРЕКРЕСТНОЙ СЕРОКОНВЕРСИИ................................................................................. 9 10 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПРИЗВОДСТВА.......................................................................................................10 PL ATELIA® C H M Y D I A IgG Т М В ^2767 Bio-Rad Laboratories Страница 2 --- стр. 4 --- PLATELIA® C H M Y D I A IgG T M B Код; 62767 1 - КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Chlamydia trachomatis, виды этого возбудителя часто передаются половым путем, и вызывают заболевания, которые являются опасными из-за возникающих осложнений: бесплодие, эктопическая беременность, конъюктивит и пневмопатии у новорожденных. Chlamydia psittaci редко встречаемая у людей, вызывает пневмопатии и внутрисердечные нарушения. Chlamydia pneumoniae часто вызывает респираторные инфекции у людей. При респираторных инфекциях (вызываемых С. trachomatis, С. psittaci), при хронических формах заболеваний половой сферы и в случаях повторного заражения, всегда отмечается вьюокий титр антител IgG к хламидии. Значительное повышение уровня антител между двумя сывороточными образцами, полученных от пациента с интервалом в 3 недели, указывает на наличие инфекции. Диагностический набор PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG TMB предназначен для обнаружения в человеческой сыворотке антител IgG к хламидии (С. trachomatis, С. psittaci, С. Pneumoniae). С помощью этого теста можно определить иммунный статус, при наличии одного образца сыворотки, или обнаружить недавнее инфицирование, при наличии парных образцов сыворотки. 2 - ПРИНЦИП МЕТОДА Метод основан на твердофазном «прямом» иммуноферментном анализе (ELISA). Антигены Chlamydia trachomatis (L2 серотип) фиксированы на дне лунки. В качестве коньюгата используются меченные пероксидазой моноклональные антитела, специфичные к гамма-цепям иммуноглобулина (IgG) человека. Первая стадия: Контрольная и исследуемая сыворотка разбавляются 1 к 21 и последовательно наносятся в лунки микропланшета. В ходе этой инкубации (1 час ± 5 минут при 37°С ± 1 С) присутствующие в пробе антихламидийные IgG антитела связываются с хламидийными антигенами, фиксированные в лунках микропланшета. После окончания инкубационного периода неспецифические IgG и не связавшиеся сывороточные белки удаляют повторяемой промывкой. Вторая стадия: В каждую лунку вносят коньюгат (меченные пероксидазой моноклональные антитела, специфичные к человеческой гамма-цепи). В течение второй инкубации, продолжающейся 1 час ± 5 минут при 37°С ± 1°С, меченые антитела связываются с сывороточными IgG, которые прореагировали с хламидийными антигенами. Несвязавшийся коньюгат удаляется промыванием в конце этого инкубационного периода. Третья стадия: Добавление субстрата в каждую лунку окрашивает присутствующий иммунный комплекс (хламидийный антиген, сывороточный анти-хламидийный IgG, анти-IgG коньюгат). Четвертая стадия: После окончания 30 минутной (± 5 минут) инкубации, проводимой при комнатной температуре (+18-30°С), ферментная реакция останавливается добавлением раствора 1Н серной кислоты. Таким образом, оптическая плотность, зарегистрированная на длине волны 450/620 нм, будет прямо пропорциональна количеству анти-хламидийных IgG, обнаруженных в исследуемом материале. При получении данных, превышающих пороговое значение, можно с уверенностью говорить об инфицировании и определить количество хламидийных антител IgG в исследуемом образце. Интерпретация результатов при исследовании парных сывороток позволяет определить недавнее инфицирование. 3 - СОСТАВ НАБОРА PLATELIA^*" CHLAMYDIA IgG TMB МАРКИРОВКА РЕАГЕНТЫ ФОРМА ВЫПУСКА R 1 Микропланшет: 12 полосок по 8 лунок в каждой, покрытых инактивированными антигенами Chlamydia trachomatis (серотип L2). 1 микропланшет R2 Концентрированный промывочный раствор (10х): TRIS-NaCI буфер (pH 7,4), 1% Tween®20. Консервант; 0,01% Thimerosal 1 флакон 100 мл Bio-Rad Laboratories Страница 3 --- стр. 5 --- PLATELIA® CHMYDIA IgG TMB Код: R3 Отрицательный контроль: Человеческая сыворотка не содержащая хламидийных антител и не взаимодействующая с поверхностным антигеном гепатита В (MBs Ад), антитела к гепатиту С (HGV) и антитела к вирусу человеческого иммунодефицита (HIV1+2). Консервант: 0,01% Thimerosal 1 флакон 1 мл R4a Контроль с пороговым значением: Человеческая сыворотка, содержащая антитела IgG и не взаимодействующая с анти-Н!\/1+2 антителом, MBs антигеном и анти-HGV антителом. Консервант: 0,01%. 1 флакон 1 мл R4b Положительный контроль: Человеческая сыворотка, содержащая хламидийные антитела (IgG) и не взаимодействующая с анти-Н1\/1+2 антителом, HBs антигеном и анти-HCV антителом. Консервант: 0,01%. 1 флакон 1 мл R6 Коньюгат (ЮОх): Мышиные моноклональные антитела специфичные гамма- цепям иммуноглобулина человека, меченные пероксидазой хрена. Консервант: 0,01% Thimerosal 1 флакон 0,4 мл R7 Растворитель для проб и коньюгата (готов к использованию): TRIS-NaCI буфер (pH 7,6), бычий сывороточный альбумин (БСА), 0,1% Tween 20 и феноловый красный. 1 флакон 80 мл R8 ТМВ Субстратный буфер (готов к использованию): Раствор лимонной кислоты 0,05М (pH 5,6) и лимоннокислого натрия, содержащий 0.03% Н2О2. Консервант: 0,01% Thimerosal 1 флакон 60 мл R9 Хромоген: ТМВ раствор Хромоген: раствор тетраметилбензидина (ТМВ) 1 флакон 5 мл R 10 Стоп-реагент (готов к использованию): 1Н раствор серной кислоты 1 флакон 28 мл Липкая пленка для микропланшета 4 шт. 4 - ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ Для получения достоверных результатов должны соблюдаться правила GLP: • Не используйте реагенты с просроченным сроком годности. • Не смешивайте и не комбинируйте реагенты из наборов с разными сериями во время проведения одного исследования. Замечание: При необходимости, возможно использование реактивов из других партий набора, если эта партия используется в пределах данного исследования: промывочный раствор (R2, обозначение; 10х голубой раствор), субстратный буфер (R8, обозначение: ТМВ buf. голубого цвета), хромоген (R9, обозначение: ТМВ sol, зеленый) и стоп-реагент (R10, обозначение: 1Н, красный). Эти реактивы могут использоваться с некоторыми другими из наших комплектов. Свяжитесь с нашей технической службой для детальной информации. • Перед использованием реактивы необходимо выдержать при комнатной температуре в течение 30 минут для стабилизации. • Осторожно разводите реагенты, избегая любой контаминации. • Не проводите исследования в присутствии активных реагирующих веществ и паров (кислот, щелочей, альдегидов) или в загрязненных условиях, т.к. это может изменить ферментативную активность коньюгата. • Используемая стеклянная посуда должна быть тщательно промыта деионизированной водой, однако, предпочтительнее пользоваться одноразовыми материалами. • Ферментативная реакция очень чувствительна к присутствию ионов металлов. Следовательно, металлические предметы не должны соприкасаться с растворами, содержащими коньюгат или субстратный раствор. • П оявление ж е лто -о р а нж е во го окраш ивания через несколько минут после добавления OPD таблеток указывает на непригодность реагента и необходимость его замены свежеприготовленным. Приготовление этого раствора должно осуществляться в чистой одноразовой пластиковой или стеклянной посуде, обработанной 1Н HCI, потом тщательно промытой дистиллированной водой и высушенной. Раствор хранится в темном месте. Bio-Rad Laboratories Страница 4 --- стр. 7 --- P LATELIA® C H M Y D I A IgG T M B Код : 62767 6 - МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА 6.1 - НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ, НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ Дистиллированная или деионизированная вода. Бикарбонат натрия и гипохлорит натрия (отбеливатель). Фильтровальная бумага. Одноразовые резиновые перчатки. Защитные очки. Одноразовые пробирки. Автоматические/полуавтоматические пипетки с фиксированным или переменным объемом для раскапывания объемом 10 -1000 мкл и 1 мл, 2 мл, 10 мл. Мерные дозирующие цилиндры на 25 мл,50 мл, 100 мл, 1000 мл. Встряхиватель типа Vortex. Автоматическая, полуавтоматическая или ручная система для промывки микропланшет*. Инкубатор или водяная баня с регулируемой температурой инкубации (37°С ± 1°С). Специальный контейнер для биологически зараженных отходов. ИФА-ридер (спектрофотометр) для микропланшет (оснащенный фильтрами с длиной волны 450/620 нм)*. (*) Детальную информацию о рекомендованном оборудовании запрашивайте в техническом отделе. 6.2 - РАЗВЕДЕНИЕ РЕАГЕНТОВ R2: Растворите 100 мл реагента R2 в 900 мл дистиллированной или деионизированной воды для получения промывочного рабочего раствора. R6: Для приготовления рабочего раствора коньюгата на один микропланшет, смешайте 0,25мл концентрированного коньюгата с 25 мл растворителя (R7) (для одного стрипа возьмите десятую часть от полученного раствора). R8 + R9: Разведите 1:11 хромоген (R9) в субстратном буфере (R8) (например: 1 мл реактива R9 + 10 мл реактива R8). Гомогенизируйте. 6.3 - ХРАНЕНИЕ ОТКРЫТЫХ И / ИЛИ РАЗВЕДЕННЫХ РЕАКТИВОВ R1: Вскрытый пакет с неиспользованными полосками можно хранить при температуре +2-8 °С в течение 1 месяца в хорошо закрытой упаковке (проверьте наличие сорбента). R2: После приготовления раствор стабилен в течение 2 недель при температуре + 2 - 8 °С. Концентрированный раствор хранится при + 2-25 °С, при отсутствии контаминации может использоваться до конца срока годности, указанного на упаковке. R6: Приготовленный раствор сохраняет стабильность в течение 8 часов при комнатной температуре (+18-30°С) и свыше 24 часов при 4°С. R9: Разведённый раствор сохраняет свои свойства в течение 6 часов в темноте при комнатной температуре (+18-30°С). 6 .4 -М Е ТО Д И КА Точно следуйте указанной методике. Для получения достоверных результатов используйте контрольную сыворотку в каждой серии исследований. Непосредственно перед применением реактивы должны прогреться до комнатной температуры (+18-30°С). 1. Составьте схему нанесения на микропланшет контрольных и исследуемых сывороток, аналогично ниже приведенной. 2. Приготовьте рабочий промывной раствор (раствор R2) (см. раздел 6.2). 3. Извлеките рамку и необходимое количество стрипов из упаковки. 4. Один раз промойте стрипы рабочим промывочным раствором (R2). Переверните планшет и аккуратно стряхните оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу. 5. Разведите контрольные и исследуемые образцы 1:21 растворителем (R7) либо непосредственно в микропланшете, либо в разделительных пробирках: А) Разведение в планшете: Внесите 200 мкл растворителя (R7) в каждую лунку. Лунка А1 10 мкл отрицательной контрольной сыворотки (R3) Лунка В1, С1 10 мкл положительной сыворотки, стандарт I (R4a) Bio-Rad Laboratories Страница 6 --- стр. 8 --- Лунка D1 10 МКЛ положительной сыворотки, стандарт II (R4b) Пробы: внесите 10 мкл каждого образца в лунки, начиная с Е1. Важно избежать неспецифического связывания белка, для этого соблюдайте следующую последовательность: внесите сначала 200 мкл растворителя (R7) в лунку, добавьте 10 мкл пробы или контроля, последовательно перемешайте 5-7 раз. Б) Разведение в пробирках: Предварительно разведите контроли и образцы 1:21 (например: 25 мкл сыворотки + 500 мкл растворителя). Хорошо перемешайте. Внесите уже разведенные сыворотки по следующей схеме: Лунка А1 200 мкл разведенного отрицательного контроля (R3) Лунка В1, С1 200 мкл разведенной сыворотки с пороговым значением (R4a) Лунка D1 200 мкл разведенной положительной контрольной сыворотки (R4b) Пробы: внесите 10 мкл каждого образца в лунки, начиная с Е1. 6. Контроль с пороговым значением дублируется. Схема идентификации для двух стрипов: PLATELIA® C H M Y D I A IgG T M B : 62767 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А В С D Е F G Н R3 S5 R4a S6 R4a S7 R4b S8 51 S9 52 S10 53 S11 54 SI 2 7. Накройте микропланшет липкой лентой. Инкубируйте микропланшет в сухом инкубаторе при 37 ± 1°С в течение 1 часа ± 5 минут. 8. Перед окончанием первого инкубационного периода приготовьте рабочий раствор коньюгата (R6). Для одного микропланшета к 0,25 мкл коньюгата (R6) добавьте 25 мкл растворителя (R7). Хорошо перемешайте. 9. По окончании инкубации, удалите содержимое ячеек и промойте микропланшет 3 раза. 10. Добавьте 200 мкл рабочего раствора коньюгата (R6) в каждую лунку. Накройте микропланшет липкой лентой. 11. Инкубируйте микропланшет при 37 ± 1°С в течение 1 часа ± 5 минут. 12. Приготовьте субстратный хромогенный раствор (R8 + R9). 13. По окончании инкубации, удалите содержимое ячеек и промойте микропланшет 4 раза. 14. В каждую лунку добавьте 200 мкл субстратного хромогенного раствора (R8 + R9), при этом избегайте яркого света. 15. Инкубируйте микропланшет в темном месте при комнатной температуре (+18-30°С) в течение 30 ± 5 минут. 16. Добавьте по 100 мкл стоп-реагента (R10) в каждую лунку в той же последовательности и в тех же разведениях, как для субстратного раствора. 17. Осторожно вытрите дно плашки. 18. Определите оптическую плотность (0D ) в каждой лунке на длинах волн 450/620 нм. Результаты необходимо снять в течение 30 минут после остановки реакции. 19. Проверить соответствие между результатами считывания и планшетом, а также планом образцов и их реальным внесением в стрипы. 7 - ВЫЧИСЛЕНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ 7.1 - ПРОВЕРКА ПРАВИЛЬНОСТИ АНАЛИЗА Используйте контрольную сыворотку в каждом исследовании для каждого микропланшета. Для правильной интерпретации результатов должны быть соблюдены следующие критерии. - Величина оптической плотности (OD); 0D R 3< 0,175 OD R4a > 0,175 OD R4b > 0,500 - Соотношения: OD R4a/0D R3>1,3 Bio-Rad Laboratories Страница 7 --- стр. 9 --- PL AT EL IA ® C H M Y D I A IgG T M B Код: 62767 OD R4b / OD R4a > 2 Если критерии качества не соблюдены, следует провести повторный тест. 7.2 - РАСЧЕТ ЗНАЧЕНИЯ ПОРОГОВОГО УРОВНЯ (ПУ) Соответствует среднему значению оптической плотности ПУ сыворотки ПУ = среднее 0 D R4a 7.3 - ВЫЧИСЛЕНИЕ СООТНОШЕНИЯ ОБРАЗЦОВ: Оптическая плотность пробы Результат Интерпретация ОРп<ПУхО,8 Положительный Отсутствие хламидийной инфекции ПУхО,8<ООп<ПУ Сомнительный Результаты должны быть подтверждены спустя 15- 20 дней после первого анализа ____________________ ODn > ПУ Отрицательный Вероятное присутствие хламидийной инфекции: Результаты должны быть подтверждены спустя 15- 20 дней после первого анализа ____________________ 8 - ОГРАНИЧЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ Современная диагностика инфекционных заболеваний должна осуществляться на основе данных серологических и клинических исследований. Результаты только серологических исследований не могут однозначно подтвердить диагноз. Для постановки точного диагноза о наличии инфекции необходимо исследование более одного сывороточного образца. В случае подозрения на наличие инфекции или при получении результатов со значениями, близкими к пороговому уровню, рекомендуется исследовать сывороточные образцы от тех же пациентов, взятые через 15-20 дней и исследуемые по той же методике. 9 - ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ 9.1 _ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG TMB 9.1.1 - ТОЧНОСТЬ МЕТОДА • Воспроизводимость внутри исследований Анализ трех положительных образцов и одного отрицательного проводили 30 раз подряд. Для каждого образца определяли отношение порогового значения оптической плотности образца к среднему пороговому значению оптической плотности контроля (R4a). Значения соотношений оптической плотности, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждого из образцов представлены ниже в таблице. N = 30 Отрицательная проба Положительная проба 1 Положительная проба 2 Положительная проба 3 Отношение (0D пробы / 0D конторля) Среднее значение 0,43 1,45 2,65 4,96 Среднеквадратичное отклонение 0,05 0,11 0,19 0,32 Коэффициент вариации, % 11,79 7,51 7,16 6,41 • Воспроизводимость между исследованиями Те же 4 образца (один отрицательный и 3 положительных) были исследованы парно в течение 20 дней, по 2 исследования в день. Для каждого образца определяли отношение порогового значения оптической плотности образца к среднему пороговому значению оптической плотности контроля (R4a). Значения соотношений оптической плотности, стандартное отклонение и Bio-Rad Laboratories Страница 8 --- стр. 10 --- PLATELIA® CHMYDIA IgG TMB коэффициент вариации для каждого из образцов представлены ниже в таблице. Код: 62767 N = 30 Отрицательная проба Положительная проба 1 Положительная проба 2 Положительная проба 3 Отношение (0D пробы / 0 0 конторля) Среднее значение 0,32 1,07 2.17 4,32 Среднеквадратичное отклонение 0,03 0,13 0,37 0,67 Коэффициент вариации, % 9,10 12,62 17,21 15,53 Коэффициент вариации вычисленный для положительной сыворотки составляет менее 8% для воспроизводимости внутри исследований, и меньше чем 17,5% для воспроизводимости между исследованиями. 9.1.2 - ИЗМЕРЕНИЕ КОРРЕЛЯЦИИ Сравнительные исследования проводили между тест-системами PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG TMB (62767) и PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG OPD (62766) при исследовании 184 образцов доноров крови (отрицательных и положительных). Полученные результаты представлены в таблице: Platelia™ Chlamydia IgG (62766) Общее Отрицательные Сомнительные Положительные число проб 99 2* 1* 102 6* 7 3* 16 1* 0 65 66 106 9 69 184 < Platelia™ Chlamydia IgG TMB (62767) Отрицательные Сомнительные Положительные Общее число проб В ходе исследований у одного образца были получены различные результаты: тест-система OPD показала положительное значение, тогда как ТМВ - сомнительное. Отношение соответствия между тест-системами составляет; (172/173)х100=99 4%. Результаты показывают, что модификации, проведенные в комплекте Platelia Chlamydia IgG TMB (62767) не влияют на характеристики, представленные ниже, которые были получены для тест-системы Platelia™ Chlamydia IgG OPD (62766). 9.2 - ХАРАКТЕРИСТИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ PLATELIA™ CHLAMYDIA IGG TMB 9.2.1 - ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ Действия PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG были оценены в 2 различных местах методами иммунофлуоресценции и ИФА, используя проверочные препараты в сравнительном анализе. • Исследование специфичности Специфичность PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG была оценена на 212 пробах и составила 97,6% (207/212). • Исследование чувствительности При исследовании 196 проб, полученных от пациентов у которых была обнаружена инфекция, вызванная С. Pneumoniae или С. Trachomatis, чувствительность PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG составила 192/196=97,9% 9.2.2 - ОЦЕНКА ПЕРЕКРЕСТНОЙ СЕРОКОНВЕРСИИ С целью определения перекрестной сероконверсии были исследованы 120 проб, в которых были выявлены антитела к цитомегаловирусу, вирусу простого герпеса. Mycoplasma pneumoniae, Candida albicans, пробы, положительные к ревматоидному фактору, аутоантителам и Bio-Rad Laboratories Страница 9 --- стр. 11 --- гетерофильным антителам тест-системой PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG. Образцы, показавшие положительный результат с PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG, контролировали используя другой коммерческий ИФА тест. Если результаты были разными, эти образцы испытывали третьей ИФА тест-системой. Среди 120 исследованных образцов, 48 показали отрицательный результат, 64 образца положительный результат и 8 образцов, проверенных двумя другими тест-системами, выявили различие результатов. После исследования спорных результатов третьим ИФА тестом, PLATELIA™ CHLAMYDIA IgG не давала перекрёстных реакций с проверочными инфекционными препаратами. 10 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПРИЗВОДСТВА Все производственные и коммерческие реагенты, начиная со стадии получения неочищенных материалов и до последней стадии получения готового продукта, проходят в должных условиях. Каждая серия подвергается качественному контролю и в продажу поступают только те образцы, которые имеют допустимые показатели критериев. Данные относительно производства и контроля каждой серии хранятся в нашей компании. PLATELIA® C H M Y D I A IgG Т М В ^ 62767 Bio-Rad Laboratories Страница 10 --- стр. 12 --- I гш т ПЛАТЕЛИЯ™ ТОКСО IgA ТМБ 72737 Качественное определение amH-Toxoplasma gondii IgA в человеческой сыворотке иммуноферментным методом IVD Все произведенные реагенты изготавливаются в соответствии с нашей системой качества, начиная с получения сырья до конечной реализации продукта. Любой лот поступает на рынок только после прохождения строгой процедуры контроля на предмет соответствия определенным критериям. Вся информация относительно продукта и его контроля хранится в компании «Био-Рад». --- стр. 13 --- СОДЕРЖАНИЕ 1 . НАЗНАЧЕНИЕ 2. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ 3. ПРИНЦИП МЕТОДА 4. ИНФОРМАЦИЯ О ПРОДУКТЕ 5. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ И ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ 6. ОБРАЗЕЦ 7. ПРОЦЕДУРА 8. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ 9. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА Ю.ХАРАКТЕРИСТИКИ 11. ИСТОЧНИКИ --- стр. 14 --- 1. НАЗНАЧЕНИЕ ПЛАТЕЛИЯ^ТОКСО IgA ТМВ in-vitro диагностический набор обеспечивающий качественное определение анти-Гохор/азша g o n d ii (Т. g o n d ii) IgA. 2. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Т. g o n d ii - простейшее, вызывающее инфекции у млекопитающих разных видов и птиц. Токсоплазмоз, часто встречающийся у человека и животных, в основном асимптоматичен. Уровень распространения этой инфекции в популяции, установленный использованием серологических тестов, может отличаться в зависимости от страны возникновения и возраста. Токсоплазмоз в течении беременности влечет за собой серьезные врожденные аномалии (в частности, нарушение функций мозга) и иногда мертворождение. Обнаружение токсо IgG антител у женщины перед зачатием обеспечивает гарантированную внутриутробную защиту от возможного токсоплазмоза в течении беременности. Предрасположенность к тяжелым токсоплазмозным инфекциям часто встречается у людей болеющих СПИД или с другими ослаблениями иммунитета. Эти инфекции преимущественно в следствие того, что цисты Т. g o n d ii появляются перед ВИЧ инфекцией. Специфическое диагностирование Т. g o n d ii инфекции может быть сложным и выделение паразита встречается редко. Серологическое подтверждение Т. g o n d ii антител показывает на контакт с паразитом и стало широко принятым в качестве способа определения иммунного статуса и предрасположенности к инфекции. Изучение различных изотипов позволяет также датирование Т. g o n d ii и осуществление адекватной терапии в случае недавней инфекции или предложение профилактических рекомендаций: руководство по гигиене и диете для беременных женщин, химио-профилактика в иммунодефицитной популяции. 3. ПРИНЦИП МЕТОДА ПЛАТЕЛИЯ™ ТОКСО IgA ТМВ твердофазный иммуноферментный двух- слойный метод, с фиксированием IgA антител на твердой фазе (анти человеческие анти- цепочечные антитела нанесены на микропланшет). Пероксидаза-меченные моноклональные антитела специфичные к Т. g o n d ii направлены против поверхностного антигенного белка, РМ 30 О О О ,одной из главных целей гуморального иммунного ответа. Первая стадия. Отрицательный, граничных значений и положительные контроли и образцы растворяются 1/101 (1/20 для сывороток эмбриональных и новорожденных) и помещаются в лунки микропланшета. В течении инкубации 1 час при 37°С, IgA присутствующий в образце улавливается твердой фазой. После инкубации, IgG и другие протеины сыворотки удаляются промывкой. Вторая стадия. Раствор содержащий антиген Г . g o n d ii (Т. g o n d ii А д, RH штамм) и моноклональное антитело к Т. g o n d ii помеченное пероксидазой хрена (ACM-POD) вносятся в каждую лунку. В течении инкубации один час при 37°С IgA антитела Т. g o n d ii содержащиеся в образце, которые фиксируются на твердой фазе, образуют Т. g o n d ii антиген-конъюгт комплекс. Избыток Т. g o n d ii а т ш е и а и конъюгата удаляется промывкой. --- стр. 15 --- Третья стадия. Наличие иммунного комплекса (анти IgA твердая фаза, анти- Т. g o n d ii IgA, Т. g o n d ii Ag, анти-7. g o n d ii А д конъюгат) показывается добавлением раствора, содержащего пероксидазный суьстрат и хромоген инициирующий реакцию проявления цвета. Четвертый шаг. После получасовой инкубации при комнатной температуре (18-30°С), ферментативная реакция останавливается добавлением 1 Н серной кислоты. Оптическая плотность считывания при 450/620 нм пропорциональна количеству Т. g o n d ii IgG антител присутствующих в образце. Присутствие Т. g o n d ii IgA антител определяется сравнением оптической плотности считываемой для образца по отношению к оптической плотности считываемой для контрольной сыворотки предельного значения. 4. ИНФОРМАЦИЯ О ПРОДУКТЕ Все реактивы подготовлены предназначаются для in vitro диагностического использования. Маркировка Реактивы Количество R 1 Микропланшет Микропланшет (Готовы к использованию): 12 полос по 8 лунок в каждой, покрытых анти - альфа-цепочечными антителами 1 R 2 Концентрированный промывочный раствор (10х) Концентрированный промывочный раствор (10х): ТРИС-NaCI буфер (pH 7,4), 1 % Т В И Н ® 20. Консервант: 0,01% тимеросал. 1 сосуд 100 мл R 3 Отрицательный контроль Отрицательный контроль: человеческая сыворотка отрицательная для Т. g o n d ii IgA антител, и отрицательная для гепатита В Ад, для ВИЧ1 и ВИЧ2 антител и антител к вирусу гепатита С. Консервант: 0,01% тимеросал. 1 сосуд 1 мл R4a Контроль предельного значения Контроль предельного значения: Человеческая сыворотка положительная для Т. g o n d ii IgA антител, и отрицательная для гепатита В Ад, для ВИЧ1 и ВИЧ2 антител и антител к вирусу гепатита С. Консервант: 0,01% тимеросал. 1 сосуд 1 мл * 1 R4b Положительный контроль Положительный контроль: Человеческая сыворотка положительная для Г . g o n d ii IgA антител, и отрицательная для гепатита В Ад, для ВИЧ1 и ВИЧ2 антител и антител к вирусу гепатита С. Консервант: 0,01% тимеросал. 1 сосуд 1 мл --- стр. 16 --- R6a Антиген Токсоплазмозный антиген (лиофилизированный), RH штамм 4 сосуда по 3 мл R6b Конъюгат (80х) Конъюгат: мышиные моноклональные антитела анти- Т. g o n d ii соединенные с пероксидазой хрена. Концентрированные в 80 раз 1 сосуд 0,4 мл R7 Растворитель Растворитель для образцов и конъюгата (Готовый к использованию): ТРИС-NaCI буфер (pH 7,7±0,15), бычий альбумин, 0,1% ТВИ Н ® 20 и феноловый красный 2 сосуда по 80 мл R8 ТМБ субстратный буфер ТМБ субстратный буфер: Раствор лимонной кислоты и ацетата натрия (pH 4,0), содержащий 0,015% Н202 и 4% ДМСО. 1 сосуд 60 мл R9 ТМБ хромоген Хромоген: 0,25% тетраметилбензидин (ТМБ) раствор 1 сосуд 5 мл R10 Фиксирующий раствор Фиксирующий раствор (готов к использованию): раствор 1 Н серной кислоты 1 сосуд 28 мл Липкая пленка для микропланшета 4 5. БЕЗОПАСНОСТЬ И ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ Достоверность результатов зависит от правильного выполнения следующей надлежащей лабораторной практики: • Не используйте реактивы после окончания срока годности • Не смешивайте и не объединяйте реактивы из разных партий при проведении одного теста. Примечание: В о зм о ж н о и с п о л ь з о в а т ь д р у ги е п а р т и и чем т е , к о т о р ы е с о д е р ж а т с я в н а б о р е , в т о м сл учае, е с л и и с п о л ь з у е т с я т а ж е п а р т и я в д а н н о м и с с л е д о в а н и и : п р о м ы в о ч н ы й р а с т в о р (R2, и д е н т и ф и к а ц и о н н а я э т и к е т к а : Ю ^ с и н и й ), с у б с т р а т н ы й б у ф е р (R8, и д е н т и ф и к а ц и о н н а я э т и к е т к а : ТМ Б б уф е р синим ), х р о м а т о г е н (R9, и д е н т и ф и к а ц и о н н а я э т и к е т к а : Т М Б р а с т в о р зе л е н ы й ) и ф и к с и р у ю щ и й р а с т в о р (R 1 0 и д е н т и ф и к а ц и о н н а я э т и к е т к а : 1 Н кр а с н ы й ). Э т и р е а к т и в ы м о г у т и с п о л ь з о в а т ь с я с н е к о т о р ы м и н а ш и м и д р у ги м и п р о д у к т а м и . К о н т а к т и р у й т е с н а ш и м т е х н и ч е с к и м с е р в и с о м д ля п о л н о й п о д р о б н о й и н ф о р м а ц и и . • Перед использованием, если необходимо подождите 30 мин чтобы стабилизировать реагенты до комнатной температуры. • Осторожно восстановите реактивы исключая любую контаминацию. • Не проводите ваш тест в присутствии химически активных испарений (испарения кислот, щелочей, альдегидов) или в загрязненных условиях, это может изменить ферментативную активность конъюгата. • Используйте стеклянную посуду тщательно вымытую и ополоснутую деионизованной водой или предпочтительно одноразовые материалы. • Не допускайте высушивание микроплат между концом отмывки и внесением реагентов. --- стр. 20 --- • R6: Однажды разведенный раствор стабилен до 4 часов при комнатной температуре (+18-30°С). • R9: Однажды разведенный раствор стабилен 6 часов в темноте при комнатной температуре (+18-30°С). • R3, R4a, R4b, R7 и R10: реактивы хранятся при +2-8°С, при отсутствии контаминации, стабильны до даты окончания срока годности показанной на этикетке (даже если открыты). 7.4. Методика. Строго следуйте методике анализа. Используйте калибратор при каждой «пробежке» чтобы валидировать результаты анализа. Перед использованием, дайте реактивам достигнуть комнатной температуры (+18-30°С). 1 . Составьте схему нанесения и идентификации образцов. 2. Растворите R2 как предписано (см.п. 7.2). Возьмите рамку и полоски (R1) из упаковки. Промойте микропланшетную полоску один рас разведенным R2. Переверните микропланшет и осторожно тряхните на фильтровальную бумагу чтобы удалить оставшуюся жидкость. Растворите тестируемый образец и контроль в растворе R7 1/101: 10 мкл образца и 1 мл растворителя R7. Тщательно перемешайте (с помощью вортекса). Добавьте 200 мкл разведенных 1/101 контролей (R3, R4a, R4b) и разведенных 1/101 тестируемых образцов (S1, S2 и т.д.) в лунки как предлагается ниже: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 3 . 4 . 5 . 6. 12 R 3 S 5 R 5 a S 6 R 4 a S 7 R 4 bS 8 S I S 9 S 2 S 1 0 S 3 S 1 1 S 4 S 1 2 А В С D Е F G Н 7. Накройте планшет липкой пленкой, нажимая на плато, чтобы обеспечить полное прилегание пленки. Инкубировать планшет в термостате, контролируемой водяной бане или в микропланшетном инкубаторе при 37±1°С 1 час ± 5 минут. 8. До окончания инкубирования, подготовьте необходимое количествораствора конъюгата R6b и антигена R7a. Подготовьте рабочий раствор конъюгата (см.п. 7.2.). 9. В конце первого инкубационного периода удалите липкую ленту. Удалите содержимое лунок в контейнер для биологически опасных отходов (содержащий гипохлорид натрия). Промойте микропланшет 3 раза. Переверните микропланшет и аккуратно стряхните на фильтровальную бумагу чтобы удалить оставшеюся жидкость. 10. Добавьте 200 мкл рабочего раствора конъюгата (R6a+R6b) во все лунки. Раствор должен быть осторожно перемешан перед использованием. --- стр. 21 --- 11. Накройте планшет липкой пленкой, нажимая на плато, чтобы обеспечить полное прилегание пленки. Инкубировать планшет в термостате, контролируемой водяной бане или в микропланшетном инкубаторе при 37±1°С 1 час ± 5 минут. 12. Удалите липкую пленку, аспирируйте все лунки и отмойте 4 раза как описано выше. Переверните микропланшет и осторожно встряхните на фильтровальную бумагу, чтобы удалить остатки жидкости. 13. Подготовьте ферментативный проявляющий раствор (R8+R9) (см.п. 6.2.) и добавьте 200 мкл в каждую лунку. Позвольте реакции проявляться в темноте 30 мин ± 5 минут при комнатной температуре (+18-30°С). Не используйте липкую ленту для плат в течении этой инкубации. 14. Добавьте 100 мкл фиксирующего раствора (R10) в каждую лунку используя ту же самую последовательность и скорость как при внесении проявляющего раствора. 15. Тщательно вытрите нижнюю часть планшета. Считывайте оптическую плотность при 450/620 нм используя планшетный ридер в течении 30 мин после окончания реакции (полоски должны всегда храниться вдалиот сведа до считывания). 16. Проверьте все результаты для согласования между спектрофотометрическим и визуальным считаванием и на фоне микропланшета и внесения образца, схемы идентификации. 8.ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ 8.1. Валидация анализа Включайте все калибраторы для каждого повтора теста. Для валидации анализа следующие критерии должны соответствовать. • Значения ОП ОП R4b>0,500 • Нормы: Средняя величина ОП R4a/0H R3>1.500 on R4b/cpeднee веричине ОП R4a>1.500 Если спецификации не соответствуют, тест должен быть повторен. 8.2. Расчет предельного значения (ПЗ) П3=среднему значению ОП R4a 8.3. Расчет коэффициента образца Коэффициент образца= ОП образца/ПЗ (среднее значению ОП R4a) Результат должен так же выражаться расчетом установленного коэффициента. Установленный коэффициент образца=(ОПобразца- ОПср R4a)/(0H R4b- ОПср R4a)x10. Значение Результат Интерпретация >1.00 положительный Требовались определение специфического 1 д М и количественный анализ анти-7.дог?сУ // IgG. Результатам необходимо уточнение через 15-25 дней. >0,8 и < 1.00 сомнительный Эквивалентные результаты необходимо уточнить через 15-25 дней. Из такой же сыворотки определить 1 д М и IgG в T .g o n d ii --- стр. 22 --- <0,8 отрицательным Если тест отрицательный для 1 д М , вероятно старая инвазия паразита______________________________ Установленный коэффициент делает возможным полуколичественную интерпретацию результатов для 2 сывороток одного и того же пациента. Сыворотка у которой установленный коэффициент между О и 2 соответствует границе положительного контроля. 8.5. Выявление и устранение неисправностей Не валидированные или не воспроизводимые с высокой точностью часто являются следствием: • Недостаточной промывки микроплат, • Загрязнением отрицательных образцов сывороткой или плазмой с высоким титром антител, • Загрязнение проявляющего раствора окисляющими агентами (гипохлорид натрия, ионы металлов...), • Загрязнение закрепляющего раствора. 10. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА Диагностика недавней инфекции паразитом может быть установлена только на основании комбинации клинических и серологических данных. Результат единственного образца сыворотки не создает обоснованного доказательства для диагноза недавней инфекции. Только комбинация клинических и серологических данных (значительное увеличение в анти- Т. gondii IgG титре антител в двух образцах сыворотки полученное при минимальном интервале в три недели и протестированные в одном повторе, присутствие анти- Т. gondii IgM в значительном титре) позволяет диагностировать свежую инфекцию паразита. Необходимо определять анти- Т. gondii IgM в течении беременности, так как IgG может появляться немного позднее по сравнению с IgM (Плателия ^'^Токсо IgM ТМБ). Ю.РАБОЧИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Следующие рабочие характеристики Плателии™Токсо IgA ТМБ были установлены в 3 различных местах используя образцы из эмбрионов, новорожденных и беременных женщин. Специфичность и чувствительность исследований выполнены на Плателии™Токсо IgA (ОПД) (72733) используя клинически документированные образцы с известным IgG и IgM серологическими результатами. Позднее было сделано сравнительное исследование между Плателии™Токсо IgA (ОПД) (72733) и Плателии™Токсо IgA ТМБ (72737). Исследование специфичности Исследование было сделано на 430 образцах из 405 пациентов в числе которых 23 образцаиз 2 1 эмбриона и 73 образца из 50 новорожденных не показывали биологических или клинических симптомов токсоплазмоза, 143 образца из пациентов с хронической инфекцией и 191 образец из неиммунизированных пациентов. Общая специфичность этой популяции была 99,8% (429/430). В одном образце из новорожденного обнаружился сомнительный IgA, тогда как в отношении IgM был отрицательным Исследование чувствительности --- стр. 23 --- Исслдование делалось на 287 образцах из 118 клинически известных пациентов. • 13 образцов из 8 эмбрионов чьи матери заболели токсоплазмозом в течении беременности • 187 образцов получены из 23 новорожденных чьи матери были инфицированы в течении беременности (1 место) • 87образцов из пациентов с острой инфекцией (45 1 место и 42 2 место) IgA был определен в 4 случаях в 9 эмбрионах (присутствие IgA в эмбрионах зависит от даты материнской инфекции и забора эмбриональной крови. В новорожденных IgA был определен в 15 случаях при родах, в 2 случаях в матке и в 6 случаях через неделю после рождения. У 87 пациентов с острой инфекцией IgA был определен в 69 случаях. Сравнительные исследования Сравнительные исследования были сделаны между Плателии^'^Токсо IgA (ОПД) (72733) и Плателии^Токсо IgA ТМБ (72737) на 252 образцах из беременных женщин (отрицательных и положительных) Результаты следующие: Плателии^Токсо IgA ТМБ (72737) Плател ии^” Т оксо IgA (72733) отрицательные сомнительные положительные общие отрицательные 212 0 0 212 сомнительные 1* 0 0 1 положительные 0 1* 38 39 общие 213 1* 38 252 'после контроля в обоих тестах для 2 образцов дали одинаковые результаты ТОЧНОСТЬ • Воспроизводимость в пределах эксперимента 3 положительных и 1 отрицательных оразцы тестировались 30 раз в течении одного и того же анализа Образец Отрицательный Положительный 1 Положительный 2 Положительный 3 соотношение среднее 0,20 1,10 2.47 3,89 Ст. отклоне ние 0,03 0,04 0,06 0,10 Коэф. вариаци и 14,77 3,36 2,30 2,57 • Воспроизводимость между анализами Каждый из четырех образцов (один отрицательный и 3 положительных) был протестирован в повторностях, два повтора в день за двадцатидневный период --- стр. 26 --- 1. ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕ Плателия™ Токсо IgG - непрямой Элиза иммунологический анализ для количественного определения IgG антител к Toxoplasma gondii в человеческой сыворотке или плазме. 2. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Т. gondii - простейшее вызывающее инфекцию у многих видов млекопитающих и птиц. Токсоплазмоз часто встречающийся у человека и животных, наиболее типично не проявляет себя. Широкая распространенность этой инфекции в популяции, установленная с помощью серологических тестов, может отличаться в зависимости от страны происхождения и возраста. Токсоплазмоз в течении беременности влечет за собой серьезные врожденные аномалии (в частности нарушение функций мозга) и иногда мертворождение. Проявление Токсо IgG антител у женщин до зачатия обеспечивает гарантию эмбриональной защиты от возможного токсоплазмоза в течении беременности. Предрасположение к тяжелой токсоплазмозной инфекции обычно у людей с синтромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), или с другим ослаблением иммунитета. Эти инфекции в основном благодаря реактивации Т . gondii цист присутствующих до ВИЧ инфекции. Специфическая диагностика Т . gondii инфекции может быть усложненной, а изоляция паразита редка. Серологическое подтверждение Т. gondii антител указывает на контакт с паразиом и становится широко распространенным как средство определения иммунного статуса и восприимчивости к инфекции. Поиск некоторых изотипов позволяет также датирование Т. gondii и осуществление соответствующей терапии в случае свежей инфекции или предложение профилактических рекомендаций: рекомендации по гигиене и диете для беременных женщин, химиопрофилактика в популяции с ослабленным иммунитетом. 3. ПРИНЦИП Плателия™ Токсо IgG - тест для определения и титрования IgG антител к Toxoplasma gondii в человеческой сыворотке или плазме непрямым иммуноферментным методом Элиза. Т. gondii антитела используются для покрытия микроплат. Моноклональные антитела помеченные пероксидазой специфичные к человеческим гамма- цепочкам (анти- IgG) используются в качестве конъюгата. Тест использует следующие шаги: • Шаг1. Образцы пациентов и калибраторы разбавляется 1/21 и затем раскапываются в . лунки микроплата. В течении инкубации 1 час при 37^С, IgG антитела к Т . gondii присутствующие в образце связываются с Т gondii антигеном, покрывающим лунки микроплата. После инкубации, не связанные не специфические антитела и другие белки сыворотки удаляются отмывкой. --- стр. 27 --- • Шаг 2. Конъюгат (пероксидаза маркирующая моноклональные антитела специфичные к человеческим гамма-цепочкам) добавляется в лугки микроплат. В течении инкубации 1 час при 37^С, маркированные антитела связываются с IgG сыворотки захваченными Т. gondii антигеном. Не связанный антиген удаляется отмывкой в конце инкубации. • Ш агЗ. Присутствие иммунокомплекса (Т. gondii антиген, IgG антитела к Т. gondii, анти- IgG конъюгат) деонстрируется добавлением в каждую лунку биокаталитического раствора. • Шаг 4. После инкубирования при комнатной температруре (+18-30^С), ферментативная реакция останавливается добавлением 1 N раствора серной кислоты. Считываемая спектрофотометром при 450/620 нм оптическая плотность пропортциональна количеству антител к Т. gondii присутствующим в образце и переводятся в МЕ/мл с использованием стандартной калибровочной кривой против международного стандарта ВОЗ ТОКС-М. 4. ИНФОРМАЦИЯ О ПРОДУКТЕ Поставляемое количество реагентов рассчитано на 96 тестов. Все реактивы исключительно для in vitro диагностики. Маркировка Природа реактива Форма выпуска R1 Микроплато Микроплато: (готово к использованию): 12 стрипов с 8 соединенными лунками, покрытыми инактивированным Т. gondii- антигеном 1 R2 Концентрированный отмывочный раствор (20х) Концентрированный отмывочный раствор (20х): Трис-NaCl буфер (pH 7.4), 2% Твин® 20 Консервант: <1,5 % ProClin^'^ 300 1x70 мл R3 Калибратор 0 Калибратор 0: Отрицательная человеческая сыворотка к IgG антителам и отрицательная для гепатит В антигена, анти ВР1Ч1, анти ВИЧ2 и 1 хО,75 мл --- стр. 28 --- анти гепатит С. Консервант: <1,5 % РгоСИп™ 300 R4a Калибратор 6 Калибратор 6 МЕ/мл: Человеческая сыворотка, вступающая в реакцию с IgG антителами к Т. gondii и отрицательная для гепатит В антигена, анти ВИЧ 1, анти ВИЧ2 и анти гепатит С. Консервант: <1,5 % ProClin™ 300 1 хО,75 мл R4b Калибратор 60 Калибратор 60 МЕ/мл: Человеческая сыворотка, вступающая в реакцию с IgG антителами к Т. gondii и отрицательная для гепатит В антигена, анти ВИЧ1, анти ВИЧ2 и анти гепатит С. Консервант: <1,5 % РгоСИп^'^ 300 1 х0,75 мл R4c Калибратор 240 Калибратор 240 МЕ/мл: Человеческая сыворотка, вступающая в реакцию с IgG антителами к Т. gondii и отрицательная для гепатит В антигена, анти ВИЧ 1, анти ВИЧ2 и анти гепатит С. Консервант: <1,5 % РгоСИп^^ 300 1 х0,75 мл R6 Конъюгат (51X ) Конъюгат (51X ): Мышечные моноклональны антитела к человеческим гамма- цепочкам связанные с пероксидазой хрена Консервант: <1,5 % РгоСИп^*^ 300 1 х0,7 мл R7 Разбавитель Разбавитель для образцов и конъюгата (готов к использованию): Трис-NaCl (pH 7,7), глицерол, 0,1% твин® 20, феноловый красный 1 х80 мл --- стр. 36 --- калибраторов R3, R4a, R4b, R4c на вертикальную ось У, затем откладывая их соответствующие концентрации в МЕ/мл на горизонтальную ось X. Для каждого тестируемого образца, рассчитайте анти -Т. gondii IgG титр антител определением из построения стандартной кривой соответствующих концентраций к измеренным ОП. NB: если считанная ОП тестируемого образца разведенного 1/21>0П R4c, этот тестируемый образец должен быть разведен 1/210 в R 7 разбавителе и исследование повторено. Соответственные значения МЕ/мл должны затем умножаться на 10. 8.2. Контроль качества Включайте все калибраторы для каждого микроплата и для каждого опыта и анализируйте получены результаты. Для валидации исследования, следующие критерии должны сойтись: • Значения оптической плотности ОП R4a>0,2 ОП R4b>0,4 • Отношение оптических плотностей: ОП R 4a/0n R3>5,0 o n R4b/On R4a>2,2 ■ o n R 4c/0n R4b>l,15 Если эти критерии контроля качества не сходятся тест должен быть повторен. 12 Титр анти- Т. gondii антител (МЕ/мл) Результат Интерпретация Титр <6 МЕ/мл Отрицательный Отрицательный или сомнительный результат показывающий отсутствие приобретенного иммунитета, но не может исключить недавней инфекции. Если недавняя инфекция пациента заподозрена, второй образец должен исследоваться через две недели. 6 МЕ/мл > титр<9МЕ/мл Сомнительный Титр>9МЕ/мл Положительный Положительный результат обычно показывает прошедшую инфекцию. Тем не менее, недавняя инфекция не может быть исключена, особенно если антитела анти- Т. gondii IgM --- стр. 37 --- присутствуют ________________________ 13 Большие вариации титром могут наблюдаться при концентрациях выше 200 МЕ/мл. 8.4. Руководство по поиску ошибок Не валидируемые или не повторяющиеся реакции могут часто вызываться: • Неадекватной отмывкой микроплат. • Загрязнением отрицательных образцов сыворотки или плазмы с высоким титром антител. • Контаминация хромогенного раствора химическими окислительными агентами (гипохлорид натрия, ионы металлов...). • Контаминация стоп-раствора. 9. ХАРАКТЕРИСТИКИ Характеристики Плателия^*^ Токсо IgG были оценены в двух местах используя суммарно 1310 образцов от беременных женщин и доноров крови. В одном месте сравнительные исследования были выполнены с использованием Плателия^*^ Токсо IgG ТМБ (72741) ручным способом. Во втром месте характеристики Плателия^^ Токсо IgG были получены в сравнении с Плателия^^ Токсо IgG ТМБ (72741) на автоматизированном EIA микропланшетном анализаторе. 9.1. Широта распрострапепия Широта распространения анти-Toxoplasma gondii IgG антител испоьлзованием Плателия™ Токсо IgG была оценены на панели из 538 образцов в основном из беременных женщин наблюдаемых в течении их беременности из округа Парижа (Франция). 128 образцов были положительны для анти-токсоплазма IgG антител. Широта распространения измерялась Плателия^^ Токсо IgG признается 23,8% (128/538). 9.2. Сравнительное исследование (Место 1) “ Т К / !Характеристика Плателия Токсо IgG была получна на панели из 745 обазцов, сгруппированных следующим образом: • 606 сывороток от доноров крови • 139 сывороток от беременных женщин Результаты сравнивались с результатами полученными с использованием Плателия^Токсо IgG ТМБ (72741) использованной в качестве стандарта. --- стр. 38 --- 14 Плателия™ Токсо IgG ТМБ (72741) Отрица тельный Сомни тельный* Положи тельный Суммарный Плателия^” ^ Токсо IgG ТМБ (72840) Отрицательный 365 0 0 365 Сомнительный* 0 2 0 2 Положительный 0 0 378 378 Суммарный 365 Г" 2 365 745 • Общее соответствие: 743/743 100,0% [1C 95%=99,5%-100,0%] • Относительная специфичность: 365/365 100,0% [1C 95%=99,0%-100,0%] • Относительная чувствительность: 378/378 [1C 95%=99,0%-100,0%] * Сомнительные образцы не были включены в сувствительность, специфичность и соответствующие расчеты. [1С95%]=95% доверительный интервал 9.3. Характеристики (Место 2) Перспективные исследования проведены на 538 образцах в основном от беременных женщин, наблюдаемых в течении их беременности и тестированных в традиционной лаборатории. Эти образцы тестировались в параллели методами Плателия^*^ Токсо IgG и Плателия™ Токсо IgG ТМБ (72741). Кроме того, все образцы от неизвестных пациентов из лабораторной базы данных и имеющие итр ниже 100 МЕ/мл контролировались вторым методом: • Чувствительная агглютинация (Лабораторный антиген: Т. gondii, RH штамм) для сывороток с титром > 10 МЕ/мл. • Непрямая иммунофлюоресценция (лабораторный антиген: Т . gondii, RH штамм) для сывороток с титром 3-10 МЕ/мл. Пезультаты сравнивались с полученными с помощью Плателия^^ Токсо IgG ТМБ (72741) использованной в качестве стандарта. --- стр. 39 --- 15 1 j Плателия^'^ Токсо IgG ТМБ (72741) 1 Отрица тельный Сомни тельный* Положи тельный i Суммарный i T T l V y l Плателия Токсо IgG ТМБ ! (72840) Отрицательный 406 1 ! 0 407 Сомнительный* 3 0 t 0 3 I Положительный 1 7 1" 10 111 128 i Суммарный 1 416 11 111 538 • Общее соответствие: 517/524 98,7% [1C 95%=97,3%-99,5%] • Относительная специфичность: 406/413 98,3% [1C 95%=96,5%>-99,3%] • Относительная чувствительность: 111/111 100,0% [1C 95%>=96,8%- 100,0%] * Сомнительные образцы не были включены в сувствительность, специфичность и соответствующие расчеты. [1С95%]=95% доверительный интервал 7 противоречивых положительных образца исследованных с Плателией™ Токсо IgG все были подтверждены положительными дополнительными методами использованными в лаборатории (чувствительная агглютинация, непрямая иммунофлюоресценция. В дополнение, 9 сероконверсионных панелей, включающих 3 образца каждая были также протестированы с Плателия™ Токсо IgG (72840) и Плателия^'^ Токсо IgG ТМБ (72741). Для каждой панели, первый образец был отрицательным для обоих dLWiw-Toxoplasma gondii IgG и IgM антител. В 8 из 9 сероконверсионных панелях, оба исследования дали сходные результаты. В одной панели, 2-я сероконверсионная сыворотка была обнаружена положительной с с Плателия™ Токсо IgG, но сомнительной с Плателия™ Токсо IgG ТМБ. 9.4. Перекресная реактивность Панель из 197 образцов включающая 159 положительных образцов для краснухи, ЦМВ, ЭБВ, ВПГ, ВВО, Мампс, кори и вируса иммунодефицита человека и 38 положительных образцов для ревматоидного фактора, авто- --- стр. 40 --- антител и гетерофильных антител была протестирована с Плателия’ ^ ^ Токсо IgG (72840) и Плателия^^ Токсо IgG ТМБ (72741). 141 образец был найден негативным, 55 образца были обнаружены позитивными и 1 образец был найден сомнительным с Плателия*^ Токсо IgG. Все положительные образцы были обнаружены позитивными с Плателия™ Токсо IgG ТМБ. 9.5. Воспроизводимость • Воспроизводимость в ходе анализа (повторяемость): Для того чтобы определить повторяемость в пределах исследования, один отрицательный и два положительных образца были протестированы 32 раза в течении одного анализа. Концентрация (МЕ/мл) определялась для каждого образца). Средние контцентрации (МЕ/мл), стандартное отклонение (СО) и коэффициент вариации (% КВ) для каждого образца приведелены ниже в таблице. Воспроизводимость в ходе анализа (повторяемость). 16 N=32 Отрицательный образец Низко положитель ный образец Положитель ный образец Высоко положитель ный образец Концентрация (МЕ/мл) Среднее 0,15 16,0 39,8 167,5 СО 0,01 2,3 2,7 23.1 % КВ 7,2% 14,4% 6,9% 13,8% • Воспроизводимость между анализами (воспроизводимость) Для того чтобы проверить воспроизводимость между анализами, четыре образца (один отрицательный и три положительных) тестировались в повторах в две постановки анализа в день в течении 20 дневного периода. Концентрация (МЕ/мл) определялась для каждого образца. Среднее значение концентраций (МЕ/мл), стандартное отклонение (СО) и коэффициент вариации (%КВ) для каждого образца приведены ниже в таблице: Воспроизводимость между анализами (воспроизводимость). --- стр. 41 --- 17 N=80 Отрицательный образец Низко положитель ный образец Положитель ный образец Высоко положитель ный образец Концентрация (МЕ/мл) . Среднее 0,15 15,2 41,7 166,5 СО 0,05 2,4 4,2 21,0 % КВ 32,6% 15,5% 10,1% 12,6% 9.6. Точность и линейность Для того чтобы проверить точность калибрации, несколько разведений международного стандарта ВОЗ ТОХ-М тестировались. Получены результаты TIV 1 демонстрируют, что Плателия Токсо IgG точно калибрована против международного стандарта ВОЗ ТОХ-М для значений до 30 МЕ/мл. Более 30 МЕ/мл, полученные результаты не соответствуют номинальным около 25-50 % . Исользуя серийные разведения 5 положительных образцов, исследуемый ряд Плателия Токсо IgG был установлен между 7 и 200 МЕ/мл. 10. ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ Диагноз инфекции Т. gondii может быть получен на основании комбинации клинических и биологических данных. Результат отдельного теста титрования анти-Г. gondii IgG антител не дает достаточного количества доказательств для диагностики недавней инфекции Т. gondii. • Диагностика недавней инфекции может быть сделана только с полной информацией о пациенте включая клинические и биологические данные (значительное увеличение анти- Т. gondii IgG антител на двух сыворотках пациентов вычертилось в 3-х недельном интервале и тестировалось при остановке одного анализа. Присутствие анти-Г. gondii IgM в значительном уровне, демонстрация низкой анти-Г. gondii IgG авидности). • Присутствие анти-Г. gondii IgM антител не составляет достаточного доказательства для подтверждения недавней инфекции, потому что IgM может сохраняться несколько месяцев или даже лет после инфекции. Когда IgM определяется, количественное определение анти-Г. gondii IgG --- стр. 42 --- антител должно выполняться так же как и последующее наблюдение за ростом анти-Г. gondii антител по крайней мере на повторных сыворотках отобранных через 3 недели. • Если образец тестировалдся слишком рано в течении недавней первичной инфекции, анти-Т” . gondii IgM антитела могут еще не присутствовать! Если существует подозрение, повторный образец должен быть отобран тремя неделями позже для повторного IgM тестирования. 11. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ Все произведенные реагенты подготавливаются в соответстии с нашей системой качества, начиная с приемки сырого материала до коммерциализации конечного продукта. Каждая выпущенная партия подвергается контролю качества и выпускается на рынок только после подтверждения предписанных приемочных критериев. Протоколы производства и контроля каждой отдельной партии хранятся в Био-Рад. 11. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ См. французскую версию. ; 18 --- стр. 44 --- Конъюгат (смесь антигенов Т . g o n d i i и меченных пероксидазой моноклональных антител к антигенам токсоплазмы) вносят в лунки микропланшета. При инкубации в течение 1 часа при температуре 37°С конъюгат связывается со специфическими антителами IgM к токсоплазме, которые оказались фиксированными на микропланшете. Несвязанный конъюгат удаляют промывками по окончании инкубации. • Э т а п 3 Наличие иммунных комплексов (антитела к ц-связям человека/IgM к Т . gowJ/7/антигены Т . g o n d i i /моноклональные антитела к Т . g o n d i i ^ меченные пероксидазой) подтверждают добавлением ферментативного рабочего раствора в каждую лунку. • Э т а п 4 После инкубации при комнатной температуре (+18-30°С) ферментативную реакцию прерывают при помоши добавления 1N раствора серной кислоты. Оптическая плотность, полученная на спектрофотометре в диапазоне 450/620 нм, пропорциональна содержанию антител IgM к токсоплазме в образце сыворотки. 4 . О П И С А Н И Е Н А Б О Р А Набор реактивов рассчитан на проведение 96 тестов. Все реактивы предназначены исключительно для диагностики in vitro. Н а и м е н о в а н и е Х и м и ч е с к и й с о с т а в р е а к т и в аФ о р м а в ы п у с к а R1 М и к р о п л а н ш е т :М и к р о н л а н ш е т : (готовый к использованию): 12 стрипов с 8 отламываемыми лунками, покрытыми антителами к ц-связям человека. 1 R2 К о н ц е н т р и р о в а н н ы й п р о м ы в о ч н ы й р а с т в о р ( 2 0 х к о н ц е н т р а т К о н ц е н т р и р о в а н н ы й п р о м ы в о ч н ы й р а с т в о р ( 2 0 х к о н ц е н т р а т ) : трис-NaCi- буферный раствор (pH 7.4), 2% Твин® 20 Консервант: < 1.5% РгоСИп'^^ 300 1 X 70 мл R3 О т р и ц а т е л ь н ы й к о н т р о л ь О т р и ц а т е л ь н ы й к о н т р о л ь : отрицательная человеческая сыворотка по антителам IgM к Т . g o n d i i , отрицательная по HBs антигену, антителам к ВИЧ1, ВИЧ2 и HCV. Консервант: < 1.5% ProClin'^'^ 300 1 X 0.75 мл R4 К а л и б р а т о рК а л и б р а т о р : человеческая сыворотка положительная по антителам IgM к Т . g o n d i i , отрицательная по HBs антигену, антителам к ВИЧ1, ВИЧ2 и HCV. Консервант: < 1.5% ProClin™ 300 1 X 0.75 мл R5 П о л о ж и т е л ь н ы й к о н т р о л ь П о л о ж и т е л ь н ы й к о н т р о л ь : положительная человеческая сыворотка по антителам IgM к Т/ gondii, отрицательная по HBs антигену, антителам к ВИЧ1, ВИЧ2 и HCV. Консервант: < 1.5% ProClin™ 300 1 X 0.75 мл R6a А н т и г е н А н т и г е н ы Т . g o n d i i : Лиофилизированные антигены Т . g o n d i i . Консервант : < 1.5% РгоСИп™ 300 4 X qs 8.0 мл --- стр. 45 --- R6b К о н ъ ю г а т ( l O l x к о н ц е н т р а т ) К о н ъ ю г а т ( l O l x к о н ц е н т р а т ) : Мышиные моноклональные антитела к Т. g o n d i i (РЗО), меченные пероксидазой. Консервант: < 1.5% ProClin™ 300 _______ 1 X 0.4 мл R7 Р а с т в о р и т е л ьР а с т в о р и т е л ь д л я о б р а з ц о в и к о н ъ ю г а т а (готовый к использованию): трис-ЫаС1-буферный раствор (pH 7.7), бычий сывороточный альбумин, 0.1% Твин® 20, фенол красный. Консервант: < 1.5% ProClin™ 300 _______ 1 X 80 мл R9 Х р о м о г е н Т М БХ р о м о г е н (готовый к использованию): 3.3’.5.5’тетраметилбензидин (< 0.1%), Н 2 О 2 ( < 1 % ) . ____________________________________ 1 X 28 мл R10 С т о н - р е а г е н тСтоп-реагент (готов к использованию): 1N раствор серной кислоты _____________ 1 X 28 мл Материал для микропланшетов запечатывания Условия хранения и срок годности, см. на упаковке. 5 . О С О Б Ы Е У К А З А Н И Я И М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И Достоверность результатов зависит от строгого соблюдения следующих стандартов «Надлежащей лабораторной практики»: • Не используйте просроченные реактивы. • Не смешивайте и не используйте во время одного исследования реактивы из разных партий. О С О Б Ы Е У К А З А Н И Я : Для промывочного раствора (маркировка R2: 20х концентрату зеленого цвета), хромогена (маркировка R9: ТМБ бирюзового цвета) и стоп-реагента (маркировка R10: 1N красного цвета) допустимо использовать не только те партии реактивов, которые входят в набор, при условии, что используемые реактивы будут строго эквивалентны и в ходе одного исследования будут взяты из одного и того же комплекта. ОСОБЫЕ УКАЗАНИЯ: Промывочный раствор (маркировка R2: 20х концентрат, зеленого цвета) допустимо смешивать с двумя другими промывочными растворами из различных наборов реактивов компании «Био-Рад» (маркировка R2: 10х концентрат голубого цвета или 10х концентрат оранжевого цвета). При этом растворы должны быть надлежащим образом восстановлены, и в ходе одного исследования их можно смешивать только один раз. • Перед использованием подождите 30 минут для того, чтобы реактивы нагрелись до комнатной температуры (+18-30°С). • Аккуратно восстанавливайте и разводите реактивы, избегая попадания каких-либо примесей. • Не проводите исследование в присутствии химически активных паров (пары кислот, щелочей, альдегидов) и пыли, которые могут изменить активность ферментов в составе конъюгата. --- стр. 46 --- • Используйте стеклянные емкости, тщательно в ы м ы т ы е и промытые деионизированной водой, однако предпочтительнее использовать одноразовый материал. • Пр о м ы в к а микропланшета является р е ш а ю щ и м этапом исследования: соблюдайте рекомендуемое количество промывок и проверяйте, чтобы все лунки вначале были полностью заполнены, а затем полностью опорожнены. Ненадлежащая промывка может привести к л о ж н ы м результатам. • Следите за тем, чтобы поверхность микропланшета не высыхала в промежутке между промывкой и внесением реактивов. • Никогда не используйте один и тот же контейнер для внесения конъюгата и ферментативного раствора. • Ферментативная реакция очень чувствительна к примесям металлов и их ионам. Поэтому не допускайте контакта металлических предметов с л ю б ы м и растворами, содержащими конъюгат или хромоген. • Раствор хромогена (R9) должен быть бесцветным. Появление синего оттенка говорит о том, что реактив использовать нельзя и следует заменить. • Используйте новый наконечник дозатора для каждого образца сыворотки. • Проверяйте исправность дозаторов и другого инструментария. ИНСТРУКЦИИ п о ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ Компоненты человеческого материала, используемые в составе реактивов, были проверены и являются отрицательными к наличию поверхностного антигена гепатита В (HBsAg), антител к гепатиту С (HCV) и к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ1 и ВИЧ2). Однако, поскольку ни один метод не может абсолютно гарантировать отсутствие инфекционных возбудителей, работайте с реактивами человеческого происхождения и с образцами сыворотки пациентов как с в о з м о ж н ы м и источниками инфекционных заболеваний: • Л ю б о й материал, в том числе и промывочные растворы, непосредственно контактирующий с образцами сыворотки и реактивами, содержащими человеческий материал, должен рассматриваться как возможный источник инфекции. • Работайте с реактивами и образцами в одноразовых перчатках. • Не набирайте реактивы в дозатор ртом. • Старайтесь не разливать образцы и растворы с сывороткой. Пролитую жидкость необходимо смыть осветлителем, разведенным до 10 %. Если пролилась кислота, ее следует вначале нейтрализовать бикарбонатом натрия, а затем очистить 10% раствором осветлителя и просушить поверхность фильтровальной бумагой. Материал, использованный для очистки, утилизируется в контейнер для загрязненных отходов. • Образцы сыворотки пациентов, реактивы, содержащие человеческий материал, а также загрязненный материал и вещества д о л ж н ы быть утилизированы только после обеззараживания: - либо погружением в осветлитель с итоговой 5 % концентрацией гипохлорита натрия на 30 минут. - либо при п о м о щ и автоклавирования при температуре 121 °С в течение м и н и м у м 2 часов. ОСТОРОЖНО: не ставьте в автоклав растворы, содержащие гипохлорит натрия. • Избегайте попадания реактивов, в том числе и тех, которые считаются безопасными, на кожу и слизистые оболочки. • Работать с химическими и биологическими отходами, а также проводить их утилизацию необходимо в соответствии со стандартами «Надлежащей лабораторной практики». --- стр. 47 --- Все реактивы в наборе предназначены исключительно для диагностики in vitro. О с т о р о ж н о : X i - I r r i t a n t Н е к о т о р ы е р е а к т и в ы с о д е р ж а т к о н с е р в а н т P r o C l i n ^ ' ^ 3 0 0 < 1 . 5 % R43: При контакте с кожей может вызвать раздражение. S28-37: При попадании на кожу немедленно промойте большим количеством воды с мылом. Работайте в специальных перчатках. 6 . О Б Р А З Ц Ы 1. Сыворотка и плазма крови (этилендиаминтетрауксусная кислота, гепарин, цитрат) являются рекомендуемыми типами образцов. 2. При работе с образцами крови, их исследовании и хранении соблюдайте следующие рекомендации: • Забор образцов крови осуществляйте с соблюдением стандартных мер предосторожности при венепункции. • Дождитесь завершения тромбообразования в сыворотке перед центрифугированием. • Всегда держите пробирки закрытыми. • После центрифугирования отделите сыворотку или плазму от тромба или эритроцитов в плотно закрывающуюся пробирку для хранения. • При проведении анализа не позднее, чем в течение 7 дней, образцы можно хранить при температуре +2-8°С. • Если в течение 7 дней анализ проведен не был, а также для транспортировки, образцы замораживают при температуре -20°С и ниже. • Не используйте образцы, размороженные более 5 раз. После того, как замороженные образцы оттаяли, перед постановкой исследования их необходимо тщательно перемешать (при помощи вортекса). 3. Образцы с содержанием альбумина до 90 г/л или неконъюгированного билирубина до 100 мг/л, образцы с содержанием липидов, эквивалентных 36 г/л триолеина (триглицерида), а также гемолизированная сыворотка с гемоглобином до 10 г/л не влияют на результат. 4. Не нагревайте образцы. 7 . П О Р Я Д О К П Р О В Е Д Е Н И Я Х И М И Ч Е С К О Г О А Н А Л И З А 7 . 1 Д о п о л н и т е л ь н ы е м а т е р и а л ы , н е в х о д я щ и е в к о м п л е к т • Центрифуга/вортекс. • Автоматический считыватель для микропланшета с фильтрами 450 нм и 620 нм (*). • Инкубатор для микропланшета с термостатом, настроенным на 37±1 °С (*). • Автоматический, полуавтоматический или ручной промывочный аппарат для микропланшета (*). • Стерильная дистиллированная или деионизированная вода. • Одноразовые перчатки. • Лабораторные или защитные очки. • Фильтровальная бумага. --- стр. 48 --- • Автоматические или полуавтоматические, регулируемые или с заданными параметрами дозаторы или мультидозаторы для дозирования и разведения объемов от 10 мкл до 1000 мкл, а также 1 мл, 2 мл и 10 мл. • Мензурки емкостью 25 мл, 50 мл, 100 мл и 1000 мл. • Натрия гипохлорит (осветлитель) и натрия бикарбонат. • Контейнер для биологически опасных отходов. • Одноразовые пробирки. (*) Для получения дополнительной информации по рекомендованному оборудованию Вы можете связаться с нашей технической службой. 7 . 2 В о с с т а н о в л е н и е р е а к т и в о в • R 1 : Перед тем, как открыть контейнер, оставьте его на 30 минут при комнатной температуре (+18-30°С). Выньте рамку-держатель, сразу же положите обратно в контейнер неиспользуемые стрипы и проверьте, чтобы там был влагопоглотитель. Тщательно запечатайте контейнер и поместите его на хранение при температуре +2- 8°С. • R 2 : Разведите промывочный раствор R2 в дистиллированной воде 1/20 (например, 50 мл R2 и 950 мл дистиллированной воды), чтобы получить готовый к использованию промывочный раствор. Подготовьте 350 мл разведенного промывочного раствора на один 12-стриповый микропланшет для ручной промывки. • R 3 , R 4 , R 5 : разведите 1/21 Раствором для разведения (R7) (пример: 300 мкл R7 + 15 мкл Калибратора или Контроля). • R 6 a : Лиофилизированные Антигены Т . g o n d i i . Для 6 стрипов восстановите 1 флакон лиофилизированных антигенов, добавив 14 мл Растворителя (R7). Тщательно перемешайте. После разведения раствор антигенов (R6a+R7) должен быть абсолютно прозрачным. • R 6 ( R 6 a + R 6 b ) :Рабочий раствор конъюгата: добавьте 140 мкл конъюгата (R6b) в каждый флакон восстановленных антигенов Т . g o n d i i (разведенный R6a). Тщательно перемешайте. Рабочий раствор конъюгата необходимо восстановить как минимум за 1 час до использования. 7 . 3 Х р а н е н и е и с р о к г о д н о с т и о т к р ы т ы х и / и л и в о с с т а н о в л е н н ы х р е а к т и в о в . Набор реактивов следует хранить при температуре +2-8°С. При хранении набора при температуре +2-8°С все реактивы можно использовать до истечения срока годности, указанного на этикетке на упаковке набора. • R 1 : После вскрытия упаковки стрипы остаются стабильными в течение 8 недель при хранении при температуре +2-8°С в той же плотно закрытой упаковке (проверьте наличие влагопоглотителя). • R 2 : После разведения Промывочный раствор можно хранить 2 недели при температуре +2-30°С. После вскрытия концентрированный Промывочный раствор, хранящийся при +2-30°С и без примесей остается устойчивым до истечения срока годности, указанного на этикетке. • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 b , R 7 : После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при температуре +2-8°С реактивы остаются стабильными до 8 недель. • R 6 ( R 6 a + R 6 b ) : После разведения рабочий раствор конъюгата остается стабильным до 8 часов при комнатной температуре (+18-30°С) или в течение 2 недель при температуре +2-8 °С. --- стр. 49 --- • R 9 ; После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при +2-8°С реактив остается стабильным до 8 недель. • R 1 0 : После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при +2-8°С реактив остается стабильным до истечения срока годности, указанного на этикетке. 7 . 4 П о р я д о к р а б о т ы Строго соблюдайте порядок химического анализа, а также стандарты «Надлежащей лабораторной практики». Перед использованием реактивы должны нагреться до комнатной температуры (20 - 30°С). При отламывании и работе с лунками соблюдайте особую аккуратность. Используйте калибратор и контроли при каждой постановке анализа для подтверждения результатов исследования. 1. Внимательно составьте план распределения и маркировки калибратора, контролей и образцов сыворотки пациентов. 2. Подготовьте разведение Промывочного раствора (R2) [см. Раздел 7.2]. 3. Выньте рамку-держатель и стрипы (R1) из защитной упаковки [см. Раздел 7.2]. 4. Подготовьте Рабочий раствор конъюгата R6 (R6a+R6b) [см. Раздел 7.2]. 5. В индивидуально промаркированных пробирках разведите Калибратор (R4), Контроли (R3, R5) и образцы пациентов (S1, S2...) при помощи Растворителя (R7) до концентрации 1/21: 300 мкл Растворителя (R7) и 15 мкл образца. Перемещайте при помощи вортекса разведенные образцы. 6. Строго соблюдайте указанную ниже последовательность, вносите в каждую ячейку по 200 мкл разведенного калибратора, контролей и образцов пациентов: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 А R 3 S 5 S 1 3 В R 4 S 6 С R 4 S 7 D R 5 S 8 Е S 1 S 9 F S 2 S 1 0 G S 3 S 1 1 Н S 4 S 1 2 7. Накройте микропланщет адгезионным материалом, плотно прижмите, чтобы обеспечить герметичность. Сразу же поставьте микропланщет в водный термостат или в суховоздущный инкубатор на 1 час ± 5 минут при 37°С ± 1°С. 8. По окончании первой инкубации снимите адгезионный материал и аспирируйте содержимое из всех лунок в контейнер для биологически активных отходов (содержащий натрия гипохлорит). Промойте микропланщет 4 раза 350 мкл Промывочного раствора (R2). Переверните планщет и, аккуратно постукивая по фильтровальной бумаге, стряхните остатки реагентов. 9. Сразу же добавьте 200 мкл рабочего раствора конъюгата (R6+R7) во все лунки. Перед использованием раствор следует аккуратно взболтать. 10. Накройте микропланщет адгезионным материалом, плотно прижмите, чтобы обеспечить герметичность. Сразу же поставьте микропланщет в водный термостат или в суховоздущный инкубатор на 1 час ± 5 минут при 37°С ± 1°С. --- стр. 50 --- 11. По окончании второй инкубации снимите адгезионный материал и аснирируйте содержимое из всех лунок в контейнер для биологически активных отходов (содержащий натрия гипохлорит). Промойте микропланшет 4 раза 350 мкл Промывочного раствора (R2). Переверните микропланшет и, аккуратно постукивая по фильтровальной бумаге, стряхните остатки реагентов. 12. Быстро ( н е н а с в е т у ) распределите в каждую лунку по 200 мкл Раствора хромогена (R9). Р е а к ц и я д о л ж н а п р о х о д и т ь в т е м н о т е в т е ч е н и е 3 0 ± 5 м и н у т п р и к о м н а т н о й т е м п е р а т у р е ( + 1 8 - 3 0 ° С ) . При данной инкубации адгезионный материал не используется. 13. Остановите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл стоп-реагента (R10) в каждую лунку. Придерживайтесь той же последовательности и схемы распределения как и для ферментативного раствора. 14. Тщательно протрите рабочую поверхность сканера. На спектрофотометре определите оптическую плотность в диапазоне 450/620 нм в течение 30 минут после остановки реакции. Перед считыванием стрипы необходимо все время держать в темноте. 15. Перед описанием результатов проверьте, соответствуют ли друг другу данные считывания и схемы сканера и распределения образцов. 8 . И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В 8 . 1 В ы ч и с л е н и е п о р о г о в о г о з н а ч е н и я ( 0 3 ) Пороговое значение (ПЗ) соответствует среднему значению показателей оптической плотности (ОП) пороговых значений повторов Контроля (R4): ПЗ = среднее ОП R4. 8 . 2 В ы ч и с л е н и е к о э ф ф и ц и е н т а о т н о ш е н и я о б р а з ц а Результат образца выражается через коэффициент отношения по следующей формуле: Коэффициент отношения = ОП образца/ПЗ образца 8 . 3 К о н т р о л ь к а ч е с т в а Процедура включает калибратор и контроли для каждого микропланшета для каждой постановки теста и анализ полученных результатов. Для верификации исследования должны быть соблюдены следующие критерии: • Показатели оптической плотности: ПЗ > 0.300 0.80 X ПЗ < ОП R4 повтор 1 < 1.20 х ПЗ 0.80 X ПЗ < ОП R4 повтор 2 < 1.20 х ПЗ (Показатель ОП каждой пробы порогового значения контроля (R4) не должен отличаться более, чем на 20% от порогового значения). • Коэффициенты отношения оптической плотности: Коэффициент отношения R3 (ОП R3 / ПЗ) < 0.30 Коэффициент отношения R5 (ОП R5 / ПЗ) > 1.80 Если результат не соответствует данным критериям контроля качества, исследование следует повторить. 8 . 4 И н т е р п р е т а ц и я р е з у л ь т а т о в К о э ф ф и ц и е н т о т н о ш е н и яР е з у л ь т а т И н т е р п р е т а ц и я Коэффициент < 0.80 Отрицательный Образец считается химически неактивным в отношении наличия --- стр. 63 --- • Старайтесь не разливать образцы и растворы с сывороткой. Пролитую жидкость необходимо смыть осветлителем, разведенным до 10 %. Если пролилась кислота, ее следует вначале нейтрализовать бикарбонатом натрия, а затем очистить 10% раствором осветлителя и просушить поверхность фильтровальной бумагой. Материал, использованный для очистки, утилизируется в контейнер для загрязненных отходов. • Образцы сыворотки пациентов, реактивы, содержащие человеческий материал, а также загрязненный материал и вещества должны быть утилизированы только после обеззараживания: - либо погружением в осветлитель с итоговой 5 % концентрацией гипохлорита натрия на 30 минут. - либо при помощи автоклавирования при температуре 121 °С в течение минимум 2 часов. О С ТО Р О Ж Н О : н е ст а вьт е в а вт о к ла в раст воры , содерж ащ ие ги п о х л о р и т нат рия. • Избегайте попадания реактивов, в том числе и тех, которые считаются безопасными, на кожу и слизистые оболочки. • Работать с химическими и биологическими отходами, а также проводить их утилизацию необходимо в соответствии со стандартами «Надлежащей лабораторной практики». • Все реактивы в наборе предназначены исключительно для диагностики in vitro. О сторож но: Xi - Irritant Некоторы е реактивы содержат консервант РгоСИп^’^ 300 < 1.5% R43: При контакте с кожей может вызвать раздражение. S28-37: При попадании на кожу немедленно промойте большим количеством воды с мылом. Работайте в специальных перчатках. 6. О БРАЗЦ Ы 1. Сыворотка и плазма крови (этилендиаминтетрауксусная кислота, гепарин, цитрат) являются рекомендуемыми типами образцов. 2. При работе с образцами крови, их исследовании и хранении соблюдайте следующие рекомендации: • Забор образцов крови осуществляйте с соблюдением стандартных мер предосторожности при венепункции. • Дождитесь завершения тромбообразования в сыворотке перед центрифугированием. • Всегда держите пробирки закрытыми. • После центрифугирования отделите сыворотку или плазму от тромба или эритроцитов в плотно закрывающуюся пробирку для хранения. • При проведении анализа не позднее, чем в течение 7 дней, образцы можно хранить при температуре +2-8°С. • Если в течение 7 дней анализ проведен не был, а также для транспортировки, образцы замораживают при температуре -20°С и ниже. • Не используйте образцы, размороженные более 5 раз. После того, как замороженные образцы оттаяли, перед постановкой исследования их необходимо тщательно перемешать (при помощи вортекса). 3. Образцы с содержанием альбумина до 90 г/л или неконъюгированного билирубина до 100 мг/л, образцы с содержанием липидов, эквивалентных 36 г/л триолеина --- стр. 64 --- (триглицерида), а также гемолизированная сыворотка с гемоглобином до 10 г/л не влияют на результат. 4. Не нагревайте образцы. 7. П О Р Я Д О К П Р О В Е Д Е Н И Я Х И М И Ч Е С К О Г О А Н А Л И З А 7.1 Дополнительны е материалы, не входящие в ко м п л е кт • Центрифуга/вортекс. • Автоматический считыватель для микропланшета с фильтрами 450 нм и 620 нм (*). • Инкубатор для микропланшета с термостатом, настроенным на 37±1°С (*). • Автоматический, полуавтоматический или ручной, промывочный аппарат для микропланшета (*). • Стерильная дистиллированная или деионизированная вода. • Одноразовые перчатки. • Лабораторные или защитные очки. • Фильтровальная бумага. • Автоматические или полуавтоматические, регулируемые или с заданными параметрами дозаторы или мультидозаторы для дозирования и разведения объемов от 10 мкл до 1000 мкл, а также 1 мл, 2 мл и 10 мл. • Мензурки емкостью 25 мл, 50 мл, 100 мл и 1000 мл. • Контейнер для биологически опасных отходов. • Одноразовые пробирки. (*) Для получения дополнительной информации по рекомендованному оборудованию Вы можете связаться с нашей технической службой. 7.2 Восстановление реактивов • R1: Перед тем, как открыть контейнер, оставьте его на 30 минут при комнатной температуре (+18-30°С). Выньте рамку-держатель, сразу же положите обратно в контейнер неиспользуемые стрипы и проверьте, чтобы там был влагопоглотитель. Тщательно запечатайте контейнер и поместите его на хранение при температуре +2-8°С. • R2: Разведите промывочный раствор R2 в дистиллированной воде 1/20 (например, 50 мл R2 и 950 мл дистиллированной воды), чтобы получить готовый к использованию промывочный раствор. Подготовьте 350 мл разведенного промывочного раствора на один 12-стриповый микропланшет для ручной промывки. • R3, R4a, R4b, R4c: разведите 1/21 Растворителем (R7) (пример: 300 мкл R7 + 15 мкл Калибратора). • R6+R7: Конъюгат (R6) находится в виде 51х концентрата, и его необходимо гомогенизировать перед использованием. Разведите 1/51 в Растворителе (R7). На один планшет разведите 0.5 мл Конъюгата (R6) в 25 мл Растворителя (R7). Разделите полученные объемы на 10, чтобы задать объем для одного стрипа. 7.3 Хранение и срок годности о ткр ы ты х и/или восстановленных реактивов Набор реактивов следует хранить при температуре +2-8°С. При хранении набора при температуре +2-8°С все реактивы можно использовать до истечения срока годности, указанного на этикетке на упаковке набора. • R1: После вскрытия упаковки стрипы остаются стабильными в течение 8 недель при хранении при температуре +2-8°С в той же плотно закрытой упаковке (проверьте наличие влагопоглотителя). • R2: После разведения Промывочный раствор можно хранить 2 недели при температуре +2-30°С. После вскрытия концентрированный Промывочный раствор. --- стр. 65 --- хранящийся при +2-30°С и без примесей остается устойчивым до истечения срока годности, указанного на этикетке. • R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при температуре +2-8°С реактивы остаются стабильными до 8 недель. • R6+R7: После разведения рабочий раствор конъюгата остается стабильным до 8 часов при комнатной температуре (+18-30°С) или в течение 2 недель при температуре +2-8°С. • R9: После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при +2-8°С реактив остается стабильным до 8 недель. • R10: После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при +2-8°С реактив остается стабильным до истечения срока годности, указанного на этикетке. 7.4 П орядок работы Строго соблюдайте порядок химического анализа и стандарты «Надлежащей лабораторной практики». Перед использованием реактивы должны нагреться до комнатной температуры (+18- 30°С). При отламывании и работе с лунками следует соблюдать особую аккуратность. Используйте все калибраторы при каждой постановке анализа для подтверждения результатов. 1. Внимательно составьте план распределения и маркировки калибраторов и образцов сыворотки пациентов. 2. Подготовьте разведение Промывочного раствора (R2) [см. Раздел 7.2]. 3. Выньте рамку-держатель и стрипы (R1) из защитной упаковки [см. Раздел 7.2]. 4. В индивидуально промаркированных пробирках разведите Калибраторы (R3, R4a, R4b, R4c) и образцы пациентов (S1, S 2 ...) с Растворителем (R7) до концентрации 1/21: 300 мкл Растворителя (R7) и 15 мкл образца [см. Раздел 7.2]. Перемещайте разведенные образцы при помощи вортекса. 5. Строго соблюдайте указанную ниже последовательность, вносите в каждую ячейку по 200 мкл разведенных калибраторов и образцов пациентов: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А R3 S5 S13 В R4a S6 С R4b S7 D R4c S8 Е SI S9 F S2 SIO G S3 S ll Н S4 S12 6. Накройте микропланщет адгезионным материалом, плотно прижмите, чтобы обеспечить герметичность. Сразу же поставьте микропланшет в водный термостат или в суховоздущный инкубатор на 1 час ± 5 минут при 37°С ± 1°С. 7. Перед окончанием первой инкубации подготовьте рабочий раствор конъюгата (R6+R7) [см. раздел 7.2]. 8. По окончании первой инкубации снимите адгезионный материал и аспирируйте содержимое из всех лунок в контейнер для биологически активных отходов (содержащий натрия гипохлорит). Промойте микропланщет 4 раза 350 мкл Промывочного раствора (R2). Переверните планщет и, аккуратно постукивая по фильтровальной бумаге, стряхните остатки реагентов. --- стр. 66 --- 9. Сразу же добавьте 200 мкл рабочего раствора конъюгата (R6+R7) во все лунки. Перед использованием раствор следует аккуратно взболтать. 10. Накройте микропланшет адгезионной пленкой, плотно прижмите, чтобы обеспечить герметичность. Сразу же поставьте микропланшет в водный термостат или в суховоздушный инкубатор на 1 час ± 5 минут при 37°С ± 1°С. 11. По окончании второй инкубации снимите адгезионный материал и аспирируйте содержимое из всех лунок в контейнер для биологически активных отходов (содержащий натрия гипохлорит). Промойте микропланшет 4 раза 350 мкл Промывочного раствора (R2). Переверните микропланшет и, аккуратно постукивая по фильтровальной бумаге, стряхните остатки реагентов. 12. Быстро (не на свету) распределите в каждую лунку по 200 мкл Раствора хромогена (R9). Хим ическая реакция должна проходить в темноте в течение 30 ± 5 м инут при комнатной температуре (+18-30°С). При данной инкубации адгезионный материал не используется. 13. Остановите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл стоп-реагента (R10) в каждую лунку. Придерживайтесь той же последовательности и схемы распределения как и для ферментативного раствора. 14. Тщательно протрите рабочую поверхность сканера. При помощи спектрофотометра определите оптическую плотность в диапазоне 450/620 нм в течение 30 минут после остановки реакции. Перед считыванием стрипы необходимо все время держать в темноте. 15. Перед описанием результатов проверьте, соответствуют ли друг другу данные считывания и схемы сканера и распределения образцов. 8. И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В 8.1 Построение стандартной калибровочной кривой Наличие и концентрация антител IgG к вирусу краснухи в образце сыворотки определяется путем сравнения оптической плотности (ОН) образца и концентрации в М еждународных Единицах на миллилитр (МЕ/мл) калибраторов стандартной калибровочной кривой. Platelia'^'^ Rubella IgG стандартизирована по М еждународному стандарту ВОЗ RUBI 1-94. Постройте стандартную калибровочную кривую [ОН = функция (МЕ/мл)], расположив показатели ОП калибраторов R3, R4a, R4b, R4c по вертикальной оси (Y), а их соответствующие концентрации в МЕ/мл - по горизонтальной оси (X). Для каждого образца рассчитайте титр антител IgG к вирусу краснухи, определив по построенной стандартной калибровочной кривой концентрации, соответствующие полученным значениям ОП. В А Ж Н О : Е с л и зн а ч ен и е О П образца, р а звед ен н о го 1/21 > О П R4c, эт о т образец следует р а звест и до 1/210 р а с т во р и т е ле м R 7 и п о вт о р и т ь пробу. З н а ч е н и я М Е /м л за т ем н ео б хо д и м о у м н о ж и т ь на 10. 8.2 Контроль качества Процедура включает все калибраторы для каждого микропланшета для каждой пробы и анализ полученных результатов. Для верификации исследования должны быть соблюдены следующие критерии: • Показатели оптической плотности: ОП R 4a> 0.200 ОП R4b > 0.400 • Коэффициенты отношения оптической плотности: ОП R 4 a / 0 n R 3 > 5 .0 0 o n R 4 b / 0 n R 4 a> 1.50 o n R 4 c /O H R 4 b > 1.20 --- стр. 67 --- Если результат не соответствует данным критериям контроля качества, исследование следует повторить. 8.3 И нтерпретация результатов Т и тр антител к вирусу краснухи (М еж дународны е единицы /м л) Результат Интерпретация Титр < 10 МЕ/мл Отрицательный 10 МЕ/мл < Титр < 15 МЕ/мл Сомнительный Отрицательный или сомнительный результат говорит об отсутствии приобретенного иммунитета, что не исключает наличие текущей инфекции. При подозрении на текущую инфекцию пациент должен сдать повторный анализ через две недели. Титр > 15 МЕ/мл Положительный Положительный результат обычно указывает на ранее перенесенное заболевание. Однако наличие текущей инфекции исключить нельзя, особенно при наличии антител IgM к вирусу краснухи. __________ Более высокие отклонения титров наблюдаются при концентрациях выше 150 МЕ/мл. 8.4 П оиск и устранение ош ибок Недостоверные реакции или реакции с низкой повторяемостью обычно происходят в результате: • Ненадлежащей промывки микропланшета. • Попадания в отрицательные образцы примесей сыворотки или плазмы с высоким титром антител. • Попадания в ферментативный раствор химических окислителей (осветлитель, ионы металлов...). • Попадания примесей в раствор стоп-реагента. 9. Э К С П Л У А Т А Ц И Я Эксплуатация диагностической системы Platelia™ Rubella IgG осуществлялась на 2 базах, и всего было обработано 952 образца, взятых у беременных женщин и доноров крови. На первой базе проводилось сравнительное исследование с Platelia'^'^ Rubella IgG ТМВ (72912). На второй - оценивались эксплуатационные параметры Platelia’ ’ ''’ ^ Rubella IgG по сравнению с другой диагностической системой ИФА, имеющейся на рынке. 9.1 Распространенность Распространенность антител IgG к вирусу краснухи по данным Platelia^’ ^ Rubella IgG оценивалась по выборке из 322 образцов, взятых у беременных женщин, находящихся под наблюдением в течение беременности и проживающих на севере Франции. 289 образца оказались положительными по наличию антител IgG к вирусу краснухи. По данным Platelia™ Rubella IgG, распространенность составила 89.8% (289/322). 9.2 Сравнительное исследование (база 1) --- стр. 68 --- Параметры эксплуатации Platelia™ Rubella IgM оценивались по выборке из 534 образцов, распределенных по группам: • 414 образцов сыворотки доноров крови • 120 образцов сыворотки беременных женщин Результаты сравнивали с полученными по Platelia™ Rubella IgG ТМВ (72912), взятой в качестве эталона. Platelia^*^ Rubella IgG Т М В (72912) Отрицательный Сомнительный* Положительный Всего Platelia тм Rubella IgG (72850) Отрицательный 149 О О 149 Сомнительный* Положительный 377 379 Всего 153 377 534 Совокупное соответствие 526/526 100.0% [ДИ 95% = 99.3% - 100.0%] Относительная специфичность 149/149 100.0% [ДИ 95% = 97.5% - 100.0%] Относительная чувствительность 377/377 100.0% [ДИ 95% = 99.0% - ЮО.0%] "^сомнительные результаты при расчетах чувствительности, специфичности и соответствия не учитывались [ДИ 95%] = 95% доверительный интервал. Также при помощи двух диагностических наборов было протестировано 50 образцов сыворотки после 7 отсроченных вакцинаций (2 с вакциной MERUVAX II, 5 с вакциной RUDIVAX): • Выявление антител IgG к вирусу краснухи совпало в 6 случаях из 7. • Выявление антител IgG к вирусу краснухи с Platelia''"'^ Rubella IgG было отсрочено на 5 дней в одном случае. 9.3 Параметры эксплуатации (база 2) 368 образцов, требующих серологического исследования на вирус краснухи, были проверены по Platelia'^’ ^ Rubella IgG (72850): • 44 образца сыворотки детей до 18 лет (27 девочек, 17 мальчиков) • 323 образца сыворотки взрослых (1 мужчина, 322 женщины). Образцы сыворотки взрослых женщин были взяты либо у беременных, либо у наблюдавшихся постнатально спустя несколько недель после родов. • 1 образец сыворотки из Французского национального исследования контроля качества. Результаты сравнивали с полученными по другой диагностической системе ИФА, имеющейся на рынке и взятой в качестве эталона. Д иагностический набор И Ф А Отрицательный Сомнительный* Положительный Всего Platelia тм Rubella IgG (72850) Отрицательный 32 2 3 37 Сомнительный* 7 7 6 20 Положительный 1 11 299 311 Всего 40 20 308 368 Совокупное соответствие 331/335 98.8% Относительная специфичность 32/33 97.0% Относительная чувствительность 299/302 99.0% [ДИ 95% = 97.0% - 99.7%] [ДИ 95% = 84.2% - 99.9%] [ДИ 95% = 97.1% - 99.8%] --- стр. 69 --- ^сомнительные результаты при расчетах чувствительности, специфичности и соответствия не учитывались [ДИ 95%] = 95% доверительный интервал. Несовпадающие образцы были протестированы при помощи третьей диагностической системы ИФА. Для всех 4 образцов подтвердился отрицательный результат. 9.4 Перекрестная реактивность Исследование на выявление антител к вирусу краснухи с помощью Platelia™ Rubella IgG (72850) и Platelia™ Rubella IgG TMB (72912) проводилось no выборке из 177 образцов, включая 147 образцов, положительных по токсоплазмозу, ЦМВ, ЭБВ, вирусу герпеса, вирусу Варицелла-Зостер, эпидемическому паротиту, кори и ВИЧ, а также 30 образцов, положительных по ревматоидному фактору, аутоантителам и гетерофильным антителам. Из 10 образцов, отрицательных по данным Platelia'^'^ Rubella IgG TMB (72912), 8 образцов оказались отрицательными и 2 - сомнительными по данным Platelia'^'^ Rubella IgG. 9.5 Точность • Внутрианалитическая сходимость (повторяемость) Для оценки повторяемости химического анализа один отрицательный и три положительных образца были протестированы 32 раза в ходе одного исследования. Концентрацию (МЕ/мл) определяли для каждого образца. Ниже приведено среднее значение концентраций (МЕ/мл), стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (%CV) для каждого образца: В н у т р и а н а л и т и ч е ск а я схо д и м о ст ь (повт оряем ост ь) N=32 О трицательные образцы Слабо положительные образцы Положительные образцы Резко положительные образцы Концентрация (МЕ/мл) среднее 2.8 26.4 56.1 171.4 SD 0.1 1.4 2.8 14.0 % C V 3.8% 5.2% 5.0% 8.2% • М ежаналитическая сходимость (воспроизводимость) Для оценки воспроизводимости химического анализа четыре образца (один отрицательный и три положительных) были протестированы в повторах в ходе двух исследований в день в течение 20 дней. Концентрация (МЕ/мл) определялась для каждого положительного образца. Ниже приведено среднее значение концентраций (МЕ/мл), стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (%CV) для каждого образца: М еж а н а л и т и ч ес к а я схо д и м о ст ь (воспроизводим ост ь) N=80 О трицательные образцы Слабо положительные образцы П оложительные образцы Резко положительные образцы Концентрация (МЕ/мл) среднее 2.4 24.0 56.4 159.4 SD 0.8 2.7 4.6 19.9 % C V 35.6% 11.2% 8.2% 12.5% 9.6 Калибровка и линейность Для определения точности калибровки было протестировано несколько разведений Международного стандарта ВОЗ RUBI 1-94. Полученные результаты показали, что химический анализ, проводимый с Platelia™ Rubella IgG, точно откалиброван в --- стр. 75 --- раствором осветлителя и просушить поверхность фильтровальной бумагой. Материал, использованный для очистки, утилизируется в контейнер для загрязненных отходов. • Образцы сыворотки пациентов, реактивы, содержащие человеческий материал, а также загрязненный материал и вещества должны быть утилизированы только после обеззараживания: - либо погружением в отбеливатель с итоговой 5 % концентрацией гипохлорита натрия на 30 минут. - либо при помощи автоклавирования при температуре 121°С в течение минимум 2 часов. О С ТО Р О Ж Н О : н е ст а вьт е в а вт о к ла в раст воры , содерж ащ ие ги п о х л о р и т нат рия. • Избегайте попадания реактивов, в том числе и тех, которые считаются безопасными, на кожу и слизистые оболочки. • Работать с химическими и биологическими отходами, а также проводить их утилизацию необходимо в соответствии со стандартами «Надлежащей лабораторной практики». • Все реактивы в наборе предназначены исключительно для диагностики in vitro. О сторож но: Xi - Irritant Н екоторы е реактивы содержат консервант ProCIin^''^ 300 < 1.5% R43: При контакте с кожей может вызвать раздражение. S28-37: При попадании на кожу немедленно промойте большим количеством воды с мылом. Работайте в специальных перчатках. 6. О Б Р А ЗЦ Ы 1. Сыворотка и плазма крови (этилендиаминтетрауксусная кислота, гепарин, цитрат) являются рекомендуемыми типами образцов. 2. При работе с образцами крови, их исследовании и хранении соблюдайте следующие рекомендации: • Забор образцов крови осуществляйте с соблюдением стандартных мер предосторожности при венепункции. • Дождитесь завершения тромбообразования в сыворотке перед центрифугированием. • Всегда держите пробирки закрытыми. • После центрифугирования отделите сыворотку или плазму от тромба или эритроцитов в плотно закрывающуюся пробирку для хранения. • При проведении анализа не позднее, чем в течение 7 дней, образцы могут храниться при температуре +2-8°С. • Если в течение 7 дней анализ проведен не был, а также для транспортировки, образцы замораживают при температуре -20°С и ниже. • Не используйте образцы, размороженные более 5 раз. После того, как замороженные образцы оттаяли, перед постановкой исследования их необходимо тщательно перемешать (при помощи вортекса). 3. Образцы с содержанием альбумина до 90 г/л или неконъюгированного билирубина до 100 мг/л, образцы с содержанием липидов, эквивалентных 36 г/л триолеина (триглицерида), а также гемолизированная сыворотка с гемоглобином до 10 г/л не влияют на результат. 4. Не нагревайте образцы. --- стр. 76 --- 7. П О Р Я Д О К П Р О В Е Д Е Н И Я Х И М И Ч Е С К О Г О А Н А Л И З А 7.1 Дополнительны е материалы, не входящие в ко м п л е кт • Центрифуга/вортекс. • Автоматический считыватель для микропланшета с фильтрами 450 нм и 620 нм (*). • Инкубатор для микропланшета с термостатом, настроенным на 37±1°С (*). • Автоматический, полуавтоматический или ручной промывочный аппарат для микропланшета (*). • Стерильная дистиллированная или деионизированная вода. • Одноразовые перчатки. • Лабораторные или защитные очки. • Фильтровальная бумага. • Автоматические или полуавтоматические, регулируемые или с заданными параметрами дозаторы или мультидозаторы для дозирования и разведения объемов от 10 мкл до 1000 мкл, а также 1 мл, 2 мл и 10 мл. • Мензурки емкостью 25 мл, 50 мл, 100 мл и 1000 мл. • Натрия гипохлорит (осветлитель) и натрия бикарбонат. • Контейнер для биологически опасных отходов. • Одноразовые пробирки. (*) Для получения дополнительной информации по рекомендованному оборудованию Вы можете связаться с нашей технической службой. 7.2 Восстановление реактивов • R1: Перед тем, как открыть контейнер, оставьте его на 30 минут при комнатной температуре (+18-30°С). Выньте рамку-держатель, сразу же положите обратно в контейнер неиспользуемые стрипы и проверьте, чтобы там был влагопоглотитель. Тщательно запечатайте контейнер и поместите его на хранение при температуре +2-8°С. • R2: Разведите промывочный раствор R2 в дистиллированной воде 1/20 (например, 50 мл R2 и 950 мл дистиллированной воды), чтобы получить готовый к использованию промывочный раствор. Подготовьте 350 мл разведенного промывочного раствора на один 12-стриповый микропланшет для ручной промывки. • R3, R4, R5: разведите 1/21 Раствором для разведения (R7) (пример: 300 мкл R7 + 15 мкл Калибратора или Контроля). • R6a: Лиофилизированные Антигены вируса краснухи. Для 3 стрипов восстановите 1 флакон лиофилизированных антигенов, добавив 8 мл Растворителя (R7). Тщательно перемешайте. После разведения раствор антигенов (R6a+R7) должен быть абсолютно прозрачным. • R6 (R6a+R6b):Paбoчий раствор конъюгата: добавьте 80 мкл конъюгата (R6b) в каждый флакон восстановленных антигенов вируса краснухи (разведенный R6a). Тщательно перемешайте. Рабочий раствор конъюгата необходимо восстановить как минимум за 1 час до использования. 7.3 Хранение и срок годности о ткр ы ты х и/или восстаповленпых реактивов Набор реактивов следует хранить при температуре +2-8°С. При хранении набора при температуре +2-8°С все реактивы можно использовать до истечения срока годности, указанного на этикетке на упаковке набора. • R1: После вскрытия упаковки стрипы остаются стабильными в течение 8 недель при хранении при температуре +2-8°С в той же плотно закрытой упаковке (проверьте наличие влагопоглотителя). --- стр. 77 --- (R2). Переверните планшет и, аккуратно постукивая по фильтровальной бумаге, стряхните остатки реагентов. 9. Сразу же добавьте 200 мкл рабочего раствора конъюгата (R6+R7) во все лунки. Перед использованием раствор следует аккуратно взболтать. 10. Накройте микропланшет адгезионным материалом, плотно прижмите, чтобы обеспечить герметичность. Сразу же поставьте микропланшет в водный термостат или в суховоздушный инкубатор на 1 час ± 5 минут при 37°С ± 1°С. 11. По окончании второй инкубации снимите адгезионный материал и аспирируйте содержимое из всех лунок в контейнер для биологически активных отходов (содержаший натрия гипохлорит). Промойте микропланшет 4 раза 350 мкл Промывочного раствора (R2). Переверните микропланшет и, аккуратно постукивая по фильтровальной бумаге, стряхните остатки реагентов. 12. Быстро (не на свету) распределите в каждую лунку по 200 мкл Раствора хромогена (R9). Реакция должна проходить в темноте в течение 30 ± 5 м инут при комнатной температуре (+18-30°С). При данной инкубации адгезионный материал не используется. 13. Остановите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл стоп-реагента (R10) в каждую лунку. Придерживайтесь той же последовательности и схемы распределения, как и для ферментативного раствора. 14. Тщательно протрите рабочую поверхность сканера. На спектрофотометре определите оптическую плотность в диапазоне 450/620 нм в течение 30 минут после остановки реакции. Перед считыванием стрипы необходимо все время держать в темноте. 15. Перед описанием результатов проверьте, соответствуют ли друг другу данные считывания и схемы сканера и распределения образцов. 8. И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В 8.1 Вычисление порогового значения (ПЗ) Пороговое значение (ПЗ) соответствует среднему значению показателей оптической плотности (ОП) пороговых значений повторов Контроля (R4): ПЗ = среднее ОН R4. 8.2 Вычисление коэффициента отнош ения образца Результат образца выражается через коэффициент отношения по следующей формуле: Коэффициент отношения = ОП образца/ПЗ образца 8.3 Контроль качества Процедура включает калибратор и контроли для каждого микропланшета для каждой постановки теста и анализ полученных результатов. Для верификации исследования должны быть соблюдены следующие критерии: • Показатели оптической плотности: П 3 > 0.300 0.80 X ПЗ < ОП R4 повтор 1 < 1.20 х ПЗ 0.80 X ПЗ < ОП R4 повтор 2 < 1.20 х ПЗ (Показатель ОП каждой пробы порогового значения контроля (R4) не должен отличаться более, чем на 20% от порогового значения). • Коэффициенты отношения оптической плотности: Коэффициент отношения R3 (ОП R3 / ПЗ) < 0.30 Коэффициент отношения R5 (ОП R5 / ПЗ) > 1.50 Если результат не соответствует данным критериям контроля качества, исследование следует повторить. 8.4 Интерпретация результатов --- стр. 78 --- Коэффициент отнош ения Результат Интерпретация Коэффициент < 0.80 Отрицательный Образец считается химически неактивным в отношении наличия антител IgM к вирусу краснухи.__________ 0.80 < Коэффициент < 1.00 Сомнительный Образец считается сомнительным в отношении наличия антител IgM к вирусу краснухи. Результат следует подтвердить, взяв повторный анализ минимум через 3 недели после первого обследования. Коэффициент > 1.00 Положительный Образец считается химически активным в отношении наличия антител IgM к вирусу краснухи. ________________________ 8.5 П оиск и устранение ош ибок Недостоверные реакции или реакции с низкой повторяемостью обычно происходят в результате: • Ненадлежащей промывки микропланшета. • Попадания в отрицательные образцы примесей сыворотки или плазмы с высоким титром антител. • Попадания в ферментативный раствор химических окислителей (осветлитель, ионы металлов...). • Попадания примесей в раствор стоп-реагента. 9. Э К С П Л У А Т А Ц И Я 9.1 Раснространенность Распространенность антител IgM к вирусу краснухи по данным Platelia''’ ’ ^ Rubella IgM (72851) оценивалась по выборке из 347 образцов, взятых у беременных женщин. 2 образца оказались положительными по наличию антител IgM к вирусу краснухи. По данным исследования с Platelia™ Rubella IgM, распространенность составила 0.6% (2/347). Эксплуатация диагностической системы Platelia'^'^ Rubella IgM осуществлялась на 2 базах, и всего было обработано 809 образцов, взятых у беременных женщин и доноров крови. На первой базе проводилось сравнительное исследование с Platelia'^’ ^ Rubella IgM ТМВ (72922). На второй - сравнивались эксплуатационные параметры Platelia'^'^ Rubella IgM с другой диагностической системой ИФА, имеющейся на рынке. 9.2 Сравнительное исследование (база 1) Эксплуатационные параметры Platelia™ Rubella IgM оценивались по выборке из 399 образцов, распределенных по группам: • 172 образца сыворотки доноров крови • 151 образец сыворотки беременных женщин • 76 образцов сыворотки, положительных по антителам IgM к вирусу краснухи из коммерческой Plate iaT>* Rubella Ig M Т М В (72922) Отрицательный Сомнительный Положительный Всего Platelia^'^ Отрицательный 319 0 1 320 Rubella Сомнительный* 2 0 0 2 Ig M Положительный 0 0 77 77 (72851) Всего 321 0 78 399 Совокупное соответствие 396 / 399 99.25% [Д] И 95% = 97.82% - 99.84%] Относительная специфичность 31 9 /3 2 1 99.38%* [ДИ 95% = 97.77 - 99.92%] --- стр. 79 --- Относительная чувствительность 77 / 78 98.72% ^сомнительные результаты оценивались как положительные [ДИ 95%] = 95% доверительный интервал. [ДИ 95% = 93.06-99.97% ] Также при помощи двух диагностических наборов было протестировано 60 образцов сыворотки после 7 отсроченных вакцинаций (использовались вакцины двух типов): выявление антител IgM к вирусу краснухи в обоих случаях совпало. 9.3 Параметры эксплуатации (база 2) Эксплуатационные параметры Platelia™ Rubella IgM оценивалась по выборке из 350 образцов, распределенных по группам: • 47 детей в возрасте от 15 лет и младше (27 девочек и 20 мальчиков) • 299 взрослых (298 женщин - беременных или только что родивших - и 1 мужчина) • 1 образец сыворотки из Французского национального исследования по контролю качества Результаты сравнивали с полученными по другой диагностической системе ИФА, имеющейся на рынке и взятой в качестве эталона. ________________________________________ Диагностическая система И Ф А Отрицательный Сомнительный Положительный Всего Platelia^^ Rubella Ig M (72851) Отрицательный 344 О О 344 Сомнительный* 1 Положительный О 1 Всего 345 1 350 Относительная специфичность 3 4 4 /3 4 5 99.71%* [ДИ 95% = 98.40 - 99.99%] "^сомнительные результаты оценивались как положительные [ДИ 95%] = 95% доверительный интервал. Из 5 положительных сывороток: • 4 конкордантных положительных образца были взяты у одного человека в разное время, • Несовпадающий положительный образец был подтвержден по данным третьей диагностической системы ИФА, имеющейся на рынке, и соответствовал анализу, взятому через 4 месяца после вакцинации. 9.4 Перекрестная реактивность Исследование на выявление антител к вирусу краснухи с помощью Platelia™ Rubella IgM (72851) и Platelia™ Rubella IgM TMB (72922) проводилось no выборке из 212 образцов, включая 164 образца, положительных по ЦМВ, токсоплазмозу, ЭБВ, вирусу герпеса, вирусу Варицелла-Зостер, эпидемическому паротиту, кори и ВИЧ, а также 48 образцов, положительных по ревматоидному фактору, аутоантителам, гетерофильным антителам и миеломной болезни. Из этих образцов 1 оказался несовпадающим положительным по IgM к ЦМВ, и 6 образцов были расценены как положительные или сомнительные по ревматоидному фактору по данным обеих систем. Четыре из этих 6 образцов оказались отрицательными по данным других наборов ИФА, имеющихся в коммерческой продаже. 9.5 Точность • Внутрианалитическая сходимость (повторяемость) Для оценки повторяемости химического анализа один отрицательный и три положительных образца были протестированы 30 раз в ходе одного исследования. Коэффициент отношения (ОП образца/ПЗ образца) определяли для каждого образца. Ниже приведено среднее значение коэффициента отношения, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (%CV) для каждого образца: --- стр. 80 --- В н у т р и а н а л и т и ч е с к а я схо д и м о ст ь (повт оряем ост ь) N=30 О трицательные образцы Слабо положительные образцы Положительные образцы Резко положительные образцы Коэффициент отнош ения (О П образца/ПЗ образца) среднее 0.07 1.73 2.51 4.06 SD 0.002 0.03 0.06 0.11 % C V 2.7% 1.8% 2.5% 2.7% • М ежаналитическая сходимость (воспроизводимость) Для оценки воспроизводимости химического анализа четыре образца (один отрицательный и три положительных) были протестированы в повторах в ходе двух исследований в день в течение 20 дней. Коэффициент отношения (ОП образца/ПЗ образца) определяли для каждого образца. Ниже приведены среднее значение коэффициента отношения, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариации (%CV) для каждого образца: М еж а н а ли т и ч ес к а я схо д и м о ст ь (воспроизводим ост ь) N=80 О трицательные образцы Слабо положительные образцы П оложительные образцы Резко положительные образцы Коэффициент отнош ения (О П образца/ПЗ образца) среднее 0.04 1.19 2.24 3.60 SD 0.005 0.03 0.06 0.10 % c v 12.7% 2.8% 2.6% 2.8% 10. О Г Р А Н И Ч Е Н И Я М Е Т О Д А Диагноз краснухи может быть поставлен только по совокупности клинических и лабораторных данных. Результатов единственного анализа с наличием титра антител IgM к вирусу краснухи не достаточно для подтверждения течения данной инфекции. Диагноз текущего инфекционного заболевания подтверждается только при наличии полной информации о пациенте, включая клинические и лабораторные данные (значимое нарастание антител IgM к вирусу краснухи по 2 образцам сыворотки, взятым с интервалом в 3 недели и обработанным одновременно; наличие диагностически значимого титра антител IgM к вирусу краснухи; низкая авидность IgG). Наличие IgM не является достаточным подтверждением диагноза текушей краснухи, поскольку IgM могут циркулировать в крови в течение нескольких месяцев и даже лет после перенесенного заболевания. При обнаружении IgM необходимо провести количественный анализ антител IgG к вирусу краснухи, а также отсроченный анализ динамики антител к вирусу как минимум еще в одном образце сыворотки через 3 недели. Если анализ был взят в слишком ранние сроки первичной инфекции, антитела IgM к краснухе могут еще не появиться. При сохраняющихся подозрениях, необходимо сделать повторный анализ через 3 недели и еще раз определить титр IgM. Образцы, положительные по ревматоидному фактору, могут давать ложноположительные результаты. 11. К О Н Т Р О Л Ь К А Ч Е С Т В А П Р О И ЗВ О Д И ТЕ Л Я Все промышленные реактивы производятся в соответствии с нашей Системой контроля качества от момента заготовки сырья до выпуска готовой формы. Каждое наименование проходит контроль качества и поступает в продажу только при соответствии --- стр. 81 --- установленным критериям приемки. Компания «Био-Рад» располагает документацией о производстве и контроле качества каждого конкретного наименования. 12. Л И Т Е Р А Т У Р А См. инструкцию на английском языке. --- стр. 82 --- • R2: После разведения Промывочный раствор можно хранить 2 недели при температуре +2-30°С. После вскрытия концентрированный Промывочный раствор, хранящийся при +2-30°С и без примесей, остается устойчивым до истечения срока годности, указанного на этикетке. • R3, R4, R5, R6b, R7: После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при температуре +2-8°С реактивы остаются стабильными до 8 недель. • R6 (R6a+R6b): После разведения рабочий раствор конъюгата остается стабильным до 6 часов при комнатной температуре (+18-30°С) или в течение 2 недель при температуре +2-8°С. • R9: После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при +2-8°С реактив остается стабильным до 8 недель. • R10: После вскрытия, в отсутствии примесей и при хранении при +2-8°С реактив остается стабильным до истечения срока годности, указанного на этикетке. 7.4 П орядок работы Строго соблюдайте порядок химического анализа, а также стандарты «Надлежащей лабораторной практики». Перед использованием реактивы должны нагреться до комнатной температуры (20 - 30°С). При отламывании и работе с лунками соблюдайте особую аккуратность. Используйте калибратор и контроли при каждой постановке анализа для подтверждения результатов исследования. 1. Внимательно составьте план распределения и маркировки калибратора, контролей и образцов сыворотки пациентов. 2. Подготовьте разведение Промывочного раствора (R2) [см. Раздел 7.2]. 3. Выньте рамку-держатель и стрипы (R1) из защитной упаковки [см. Раздел 7.2]. 4. Подготовьте Рабочий раствор конъюгата R6 (R6a+R6b) [см. Раздел 7.2]. 5. В индивидуально промаркированных пробирках разведите Калибратор (R4), Контроли (R3, R5) и образцы пациентов (S1, S 2 ...) Растворителем (R7) до концентрации 1/21: 300 мкл Растворителя (R7) и 15 мкл образца. Перемещайте при помощи вортекса разведенные образцы. 6. Строго соблюдайте указанную ниже последовательность, вносите в каждую ячейку по 200 мкл разведенного калибратора, контролей и образцов пациентов: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А R3 S5 S13 В R4 S6 С R4 S7 D R5 S8 Е S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 Н S4 S12 7. Накройте микропланщет адгезионным материалом, плотно прижмите, чтобы обеспечить герметичность. Сразу же поставьте микропланшет в водный термостат или в суховоздущный инкубатор на 1 час ± 5 минут при 37°С ± 1°С. 8. По окончании первой инкубации снимите адгезионный материал и аспирируйте содержимое из всех лунок в контейнер для биологически активных отходов (содержащий натрия гипохлорит). Промойте микропланщет 4 раза 350 мкл Промывочного раствора --- стр. 83 --- Platelia™ CMV IgG 72810 96 тестов Обнаружение антител класса IgG к цитомегаловирусу в сыворотке кровн или плаз>1е человека иммуноферментным методом --- стр. 93 --- Начертите кривую калибровки [ОП = функция (ЕОП/мл)], отмечая значения ОП для калибраторов R3, R4a, R4b, R4c и R4d на вертикальной оси (оси Y) и затем соответствующие концентрации в ЕОП/мл на горизонтальной оси (оси X). Для каждого тестируемого образца вычислите титр антител к ЦМВ класса IgG, определив по полученной кривой калибровки соответствующую концентрацию для измеренной ОП. 8.2 Контроль качества Используйте калибраторы на каждом микропланщете всякий раз при проведении теста и с их помощью анализируйте полученные результаты. Для подтверждения анализа должны быть удовлетворены следующие критерии: • Значения оптической плотности ОП R 4 a> 0.150 ОП R 4 b > 0.300 ОП R4d > 0 D R4c • Соотношение оптических плотностей ОП R 4a/0n R3>3.50 o n R4b/OHR4a> 1.50 o n R 4c/0n R4b> 1.50 Если данные критерии не выполнены, следует провести ещё одну серию тестов. 8.3 И нтерпретация результатов Т и тр антител к Ц М В (ЕО П /мл) Результат Интерпретация Титр < 0.25 ЕОП/мл Отрицательный Отрицательный или сомнительный результат указывает на отсутствие приобретенного иммунитета, но не может исключить недавнее инфицирование. Если возникает подозрение на такое инфицирование, следует повторить тестирование пациента 2 недели спустя. 0.25 ЕОП / мл < Титр < 0.5 ЕОП / мл Сомнительный Титр > 0.5 ЕОП / мл Положительный Положительный результат, как правило, указывает на прошедшую инфекцию. Однако недавнее инфицирование также не может быть исключено, особенно если в образце присутствуют антитела к ЦМВ класса IgM. Если возникло подозрение на недавнее инфицирование, то для подтверждения диагноза могут пригодиться другие серологические тесты, например, измеряющие авидитет антител класса IgG. При концентрации свыще 4 ЕОП/мл наблюдается большой разброс титров. Образцы с концентрацией, превышающей наибольший калибратор кривой калибровки, можно развести в разбавителе R7 для получения результата в пределах 1 1 --- стр. 94 --- диапазона линейности анализа. В такой ситуации конечная концентрация достигается умножением измеренного результата на степень разбавления. 8.4 Руководство по поиску и устранению неисправностей Неподтвержденные или неповторяющиеся реакции, как правило, вызваны: • Некорректной промывкой микропланшетов • Контаминированием отрицательных образцов сывороткой крови или плазмой с высоким титром антител. • Контаминированием раствора субстрата химическими окислителями (дезинфектантами, ионами металлов...). • Контаминированием стоп-раствора. 9 - Э К С П Л У А Т А Ц И О Н Н Ы Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И Эксплуатационные характеристики анализа Platelia™ CMV IgG оценивались на основе исследования 1096 образцов, взятых у беременных женщин и доноров, проведенного в 2 лабораториях. 9.1 Распространенность Распространенность антител к ЦМВ класса IgG при использовании анализа Platelia^’ ^ CMV IgG была оценена на основе 300 образцов, взятых у беременных женщин, проживающих в районе Парижа (Франция). 145 образцов дали положительный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgG. Распространенность, полученная по результатам анализа Platelia'^'^ CMV IgG, признана равной 48.3% (145/300). 9.2 Специфичность Относительная специфичность была оценена в 2 лабораториях, расположенных во Франции, на основе 490 образцов, из которых • 61 содержали сыворотку крови доноров • 429 - сыворотку крови беременных женщин Результаты прощли сравнение с результатами, полученными при использовании коммерческого ИФА-теста в качестве эталона. Группа тестировавшихся пациентов / клиника Количество образцов сыворотки крови Отрица тельные Сомнитель ные Положите льные Специфичность Клини ка 1 Б ерем енны е ж енщ ины 81 81 0 0 100.0% (81/81) [96.3% -100.0% 1 Д оноры 61 61 0 0 100.0% (61/61) [95.2% -100.0% ] Клини ка 2 Б ерем енны е ж енщ ины 348 348 0 0 100.0% (348/348) [99.1% -100.0% 1 Всего 490 490 0 0 100.0% ИФА - иммуноферментный анализ 12 --- стр. 95 --- (490/490) [99.4%-100.0%1 [Д И 95% ] = 95% -ы й доверит ельны й интервал. 9.3. Чувствительность Относительная чувствительность была оценена на основе 606 образцов в 2 лабораториях, расположенных во Франции, из них: • 136 образцов сыворотки крови, взятых у доноров • 470 образцов сыворотки крови, взятых у беременных женщин Результаты прошли сравнение с результатами, полученными при использовании коммерческого ИФА-теста* в качестве эталона. Группа тестировавшихся пациентов / клиника Количество образцов сыворотки крови Отрица тельные Сомнител ьные Положител ьные Специфичность Клин ика 1 Беременные женщины 123 0 2 121 98.4% (121/123) [94.2%-99.8%] Доноры 136 3 1 132 97.1% (132/136) [92.6%-99.2%1 Клин ика 2 Беременные женщины 347 0 4 343 98.8% (343/347) [97.1%-99.7%] Всего 606 3 7 596 98.4% (596/606) [97.0%-99.2%1 [Д И 95% ] = 95% -ы й доверит ельны й интервал. 9.4. Перекрестная реактивность На наличие антител к ЦМВ класса IgG был протестирован набор из 103 образцов, включая 77 образцов, показавших положительный результат на наличие токсоплазмоза, краснухи, вируса Эпштейна-Барра, вируса простого герпеса, вируса ветряной оспы, свинки и ВИЧ, и 26 образцов, показавших положительный результат на наличие ревматоидного фактора, аутоиммунных антител и гетерофильных антител. При тестировании помимо анализа Platelia™ CMV IgG использовался коммерческий ИФА-тест в качестве эталона. Среди перечисленных образцов 37 дали отрицательный результат, аналогичный полученному при использовании ИФА-набора для сравнения, что подтверждает невозможность потенциальных перекрестных реакций. 9.5. Точность Точность в пределах серии тестов (воспроизводимость): ИФА - иммуноферментный анализ Сомнительные результаты рассматривались как отрицательные при подсчете чувствительности. 13 --- стр. 107 --- контаминированных отходов (содержащую гипохлорит натрия/жавелевую воду). Промойте микропланшет 4 раза с использованием 350 мкл промывочного раствора (R2). Переверните микропланшет и осторожно постучите им по фильтровальной бумаге, чтобы удалить оставшуюся жидкость. 9. Сразу после этого внесите 200 мкл рабочего раствора конъюгата (R6) в каждую лунку. Перед использованием раствор следует аккуратно взболтать. 10. Накройте микропланшет клейкой пленкой, прижимая ее ко всей поверхности для обеспечения герметичности. Сразу после этого произведите инкубацию микропланшета в термостатически регулируемой водяной бане или в сухом инкубаторе в течение часа ± 5 минут при температуре 37°С ± 1°С. 11. В конце второго инкубационного периода снимите клейкую пленку. Выполните забор содержимого каждой лунки и поместите его в емкость для продуктов контаминированных отходов (содержащую гипохлорит натрия/жавелевую воду). Промойте микропланшет 4 раза с использованием 350 мкл промывочного раствора (R2). Переверните микропланшет и осторожно постучите им по фильтровальной бумаге, чтобы удалить оставшуюся жидкость. 12. Вдали от яркого света быстро внесите 200 мкл раствора хромогена (R9) в каждую лунку. Вы полните инкубацию микропланш ета в темноте при ком натной температуре (+18-30°С) в течение 30 ± 5 минут. Не используйте клейкую пленку во время этой стадии инкубации. 13. Прекратите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл стоп-раствора (R10) в каждую лунку. Внесение выполните в той же последовательности и в том же ритме, что и для раствора субстрата. 14. Тщательно протрите дно микропланшета. С помощью сканера микропланшетов считайте значение оптической плотности каждой лунки при длине волны 450/620 нм в течение 30 минут с момента прекращения реакции. Стрипы всегда следует держать вдали от прямого света перед процедурой считывания. 15. Проверьте соответствие между выходными данными считывающего устройства и графиком внесения растворов на микропланшет перед расшифровкой результатов. 8 - И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В 8.1 Вычисление граничны х/отсекаем ы х значений (СО) Г раничное значение (СО) соответствует среднему значению оптических плотностей (ОН) экземпляров граничного контрольного образца (R4): СО = mean o f OD R4 8.2 Вычисление отнош ения образцов (Sample Ratio) Результат, полученный для каждого образца, выражается в виде пропорции по следующей формуле: Sample Ratio = ОН образца/СО 8.3 Контроль качества Используйте калибратор и контрольные образцы на каждом микропланшете всякий раз при проведении теста и с их помощью анализируйте полученные результаты. Для подтверждения анализа должны быть удовлетворены следующие критерии: 10 --- стр. 108 --- • Значения оптической плотности СО > 0.200 0.80 X СО < ОП R4 Экз.1 < 1.20 х СО 0.80 X СО < ОП R4 Экз.2 < 1.20 х СО (Значения оптической плотности каждого экземпляра граничного контрольного образца (R4) не должны отличаться от значения СО более чем на 20%.) • Соотношение оптических плотностей Отношение R3 (ОП R3 / СО) < 0.50 Отношение R5 (ОП R5 / СО) > 1.60 Если данные критерии не выполнены, следует провести ещё одну серию тестов. 8.4 И нтерпретация результатов Отношение образцов Результат И нтерпретация Отношение < 0.90 Отрицательный Образец признается дающим отрицательный результат на наличие антител класса IgM к ЦМВ. 0.90 < Отношение <1.10 Сомнительный Образец признается дающим промежуточный результат на наличие антител класса IgM к ЦМВ. Результат следует подтвердить повторным тестированием пациента минимум 3 недели спустя с момента первоначального исследования. Отношение >1.10 Положительный Образец признается дающим положительный результат на наличие антител класса IgM к ЦМВ. Если возникло подозрение на недавнее инфицирование, то для подтверждения диагноза могут пригодиться другие серологические тесты, например, измеряющие авидитет антител класса IgG. 8.4 Руководство по поиску и устранению неисправностей Неподтвержденные или неповторяющиеся реакции, как правило, вызваны: • Некорректной промывкой микропланшетов • Контаминированием отрицательных образцов сывороткой крови или плазмой с высоким титром антител. • Контаминированием раствора субстрата химическими окислителями (дезинфектантами, ионами металлов...). • Контаминированием стоп-раствора. 9 - Э К С П Л У А Т А Ц И О Н Н Ы Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И Эксплуатационные характеристики анализа Platelia'’ '’ '^ CMV IgM оценивались на основе исследования 824 образцов, взятых у беременных женщин и доноров, проведенного в 2 лабораториях. 9.1 Распространенность 1 1 --- стр. 109 --- Распространенность антител к ЦМВ класса IgM при использовании анализа Platelia™ CMV IgM была оценена на основе 300 образцов, взятых у беременных женщин, проживающих в районе Парижа (Франция). 5 образцов дали положительный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgM. Распространенность, полученная по результатам анализа Platelia'*’ ’ ^ CMV IgM, признана равной 1.7% (5/300). 9.2 Специфичность Относительная специфичность была оценена в 2 лабораториях, расположенных во Франции, на основе 740 образцов, из которых • 252 содержали сыворотку крови доноров • 488 - сыворотку крови беременных женщин Результаты прощли сравнение с результатами, полученными при использовании коммерческого ИФА-теста в качестве эталона. Группа тестировавшихся пациентов / клиника Количество образцов сыворотки крови Отрица тельные Сомнитель ные Положите льные Специфичность Клини ка 1 Б ерем енны е ж енщ ины 205 203 99.0% [96.5-99.9] (203/205) Д оноры 252 249 98.8% [96.6-99.7] (249/252) Клини ка 2 Б ерем енны е ж енщ ины 283 282 99.7% [98.1-100.0] (282/283) Всего 740 734 99.2% [98.2-99.7] (734/740) Сомнительные образцы рассматривались как полож ительные при вычислении специфичности. [Д И 95Уо] = 95%-ый доверительный интервал. 9.3. Чувствительность Относительная чувствительность была оценена на основе И З образцов в 2 лабораториях, расположенных во Франции, из них: • 35 образцов, взятых у 16 различных пациентов, показывающих динамику первичной инфекции ЦМВ (лаборатория 2) • 49 образцов из 3 коммерческих наборов с сероконверсией (лаборатория 1) • 29 отдельных образцов, дающих положительный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgM (лаборатория 1) Результаты прощли сравнение с результатами, полученными при использовании коммерческого ИФА-теста в качестве эталона. ИФА - иммуноферментный анализ ИФА - иммуноферментный анализ 12 --- стр. 121 --- 16. Прекратите ферментативную реакцию, добавив 100 мкл стоп-раствора (R10) в каждую лунку. Внесение выполните в той же последовательности и в том же ритме, что и для проявляющего раствора. 17. Тщательно протрите дно микропланшета. С помощью сканера микропланшетов считайте значение оптической плотности каждой лунки при длине волны 450/620 нм в течение 30 минут с момента прекращения реакции. Стрипы всегда следует держать вдали от прямого света перед процедурой считывания. 18. Проверьте соответствие между выходными данными считывающего устройства и графиком внесения растворов на микропланшет перед расшифровкой результатов. 8 - И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В 8 . 1 В ы ч и с л е н и е п о к а з а т е л я а в и д и т е т а Показатель авидитета (AI) образца представляет собой отношение оптических плотностей (ОП), измеренных при помощи диссоциирущего раствора (R13) и контрольного раствора (R12): AI = ООобразца R13 / ООобразца R12 Вычисление AI образца возможно, только если ОП, полученная при помощи контрольного раствора, превышает 0.2. Для образцов, разведенных в пропорции 1/101, для которых полученная при помощи контрольного раствора ОП меньше либо равна 0.2, рекомендуется провести повторное тестирование, но с разведением в пропорции 1/21. Для образцов, разведенных в пропорции 1/21, для которых полученная при помощи контрольного раствора ОП меньше либо равна 0.2, концентрация антител к ЦМВ класса IgG слишком мала, и авидитет посчитать невозможно. 8 . 3 К о н т р о л ь к а ч е с т в а Используйте контрольные образцы на каждом микропланшете всякий раз при проведении теста и с их помощью анализируйте полученные результаты. Для подтверждения анализа должны быть удовлетворены следующие критерии: • З н а ч е н и я о п т и ч е с к о й п л о т н о с т и , п о л у ч е н н ы е с к о н т р о л ь н ы м р а с т в о р о м ( R 1 2 ) : ОП R 5 a> 0.250 ОП R 5 b > 0.750 • П о к а з а т е л и а в и д и т е т а AI R5a < 0.35 AI R5b > 0.60 Если данные критерии не выполнены, следует провести ещё одну серию тестов. 8 . 4 И н т е р п р е т а ц и я р е з у л ь т а т о в П о к а з а т е л ь а в и д и т е т а ( A I )И н т е р п р е т а ц и я AI < 0.40 Зона низкого авидитета --- стр. 122 --- 0.40 <AI< 0.55 Серая авидитетная зона AI > 0.55 Зона высокого авидитета Показатели авидитета со значением ниже 0,40 более характерны для недавней первичной инфекции, возникшей менее 3 месяцев назад. Однако такой результат не позволяет подтвердить диагноз с абсолютной точностью. Показатели авидитета со значением 0,55 и выше более характерны для прошлой инфекции, перенесенной более 3 месяцев назад. Однако такой результат не позволяет с абсолютной точностью исключить наличие недавней первичной инфекции, возникшей менее 3 месяцев назад. Если возникло подозрение на недавнее инфицирование или показатель авидитета находится в серой зоне, то для подтверждения диагноза рекомендовано повторное тестирование (обратитесь к действующему законодательству касательно контроля над пациентами). 8 . 4 Р у к о в о д с т в о п о п о и с к у и у с т р а н е н и ю н е и с п р а в н о с т е й Неподтвержденные или неповторяюшиеся реакции, как правило, вызваны: • Неправильной температурой реагентов. • Некорректной промывкой микропланшетов. • Неверным разведением образцов. • Контаминированием отрицательных образцов сывороткой крови или плазмой с высоким титром антител. • Контаминированием проявляющего раствора химическими окислителями (дезинфектантами, ионами металлов...). • Контаминированием стоп-раствора. 9 - Э К С П Л У А Т А Ц И О Н Н Ы Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И 9 . 1 К л и н и ч е с к и е и с с л е д о в а н и я Эксплуатационные характеристики анализа Platelia™ CMV IgG AVIDITY оценивались на основе исследования 366 образцов, взятых преимущественно у беременных женщин, проведенного в одной из лабораторий Франции. Перспективное исследование было проведено на основе 144 образцов, которые изначально дали положительный результат при тестировании анализом Platelia'^'^ CMV IgG (72810). Результаты анализа Platelia™ CMV IgG AVIDITY прошли сравнение с результатами, полученными при использовании коммерческого ИФА- теста на авидитет IgG в качестве эталона. Процент совпадений между тестами составил 98.6% (142/144). Два образца продемонстрировали мелкие несоответствия: средний авидитет у анализа Platelia''’ ’ ^ CMV IgG AVIDITY и высокий авидитет у коммерческого теста (п=1); высокий авидитет у анализа Platelia™ CMV IgG AVIDITY и средний авидитет у коммерческого теста (п=1). Ретроспективное исследование было проведено на основе 200 образцов пациентов с прошлой инфекцией ЦМВ, из них: • 100 образцов, выявивших положительный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgG и отрицательный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgM, а также высокий показатель авидитета при диагностике коммерческим ИФА- тестом на авидитет IgG; • 100 образцов, выявивших положительный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgG и класса IgM, а также высокий показатель авидитета при диагностике коммерческим ИФА-тестом на авидитет IgG. 10 --- стр. 123 --- Все образцы пациентов с прошлой инфекцией, давшие отрицательный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgM, продемонстрировали высокий показатель авидитета при тестировании Platelia™ CMV IgG AVIDITY (100/100). Среди образцов пациентов с прошлой инфекцией, положительных на наличие антител к ЦМВ класса IgM, у 97 был выявлен высокий показатель авидитета, подтвержденный результатами коммерческого ИФА-теста на авидитет IgG. Для 3 остальных образцов было получено среднее значение авидитета при тестировании набором PlateliaTM CMV IgG AVIDITY. Также были проанализированы 22 образца с первичной инфекцией ЦМВ, включая 4 образца с сероконверсией. 21 из них имели низкий показатель авидитета. Только один образец продемонстрировал средний показатель авидитета (А1=0.41). У предыдущего образца данного пациента, взятого 48 днями ранее, был обнаружен низкий показатель авидитета. Помимо этого, тестирование было проведено на 3 коммерческий наборах образцов с сероконверсией (РТС901, RP003 и RP019). Образцы, взятые в течение 80- дневного периода с момента последнего отрицательного результата на наличие антител класса IgG, продемонстрировали низкий показатель авидитета. 9 . 2 Т о ч н о с т ь Исследование точности тестирования было проведено на примере 6 образцов, показавших положительный результат на наличие антител к ЦМВ класса IgG, при этом 3 из них были разведены в пропорции 1/101 и 3 - в пропорции 1/21. • Точность в пределах серии тестов (повторяемость): Чтобы оценить повторяемость результатов в пределах анализа, в ходе одной серии были протестированы шесть образцов 30 раз. Для каждого образца был определен показатель авидитета. Среднее значение AI, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариативности (%CV) для каждого из 6 образцов приведены в следующей таблице: Т очност ь в п р ед ела х од н о й сер и и т ест о в (п о вт оряем ост ь) N = 3 0Н и з к и й A I 1 / 1 0 1 С р е д н и й А Х 1 / 1 0 1 В ы с о к и й A I 1 / 1 0 1 Н и з к и й А 1 1 / 2 1 С р е д н и й A I 1 / 2 1 В ы с о к и й А Х 1 /2 1 С р е д н е е0.25 0.55 0.88 0.20 0.49 0.70 S D 0.018 0.015 0.037 0.008 0.020 0.015 % С У 7 . 3 % 2 . 7 % 4 . 3 % 4 . 0 % 4 . 1 % 2 . 2 % • Точность в пределах серии тестов (воспроизводимость): Чтобы оценить воспроизводимость в пределах одного теста, шесть образцов были протестированы в двух экземплярах в двух сериях тестов в день в течение 20- дневного периода. Для каждого образца был определен показатель авидитета. Среднее значение Ai, стандартное отклонение (SD) и коэффициент вариативности (%CV) для каждого из образцов приведены в следующей таблице: Т очност ь в п р ед ела х сер и и т ест о в (воспроизводим ост ь) N = 8 0Н и з к и й А ХС р е д н и йВ ы с о к и й А Х Н и з к и й А ХС р е д н и й А ХВ ы с о к и й А Х 1 / 1 0 1 A I 1 / 1 0 1 1 / 2 1 1 / 2 1 1 /2 1 1 1