Набор реагентов для выявления кДНК вируса желтой лихорадки методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Вектор-ПЦРРВ-YFV» по ТУ 9398-051-05664012-2015 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 ---
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Полное название набора
Набор реагентов для выявления кДНК вируса желтой лихорадки методом
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени «Вектор-ПЦРрв-
YFV» по ТУ 9398-051-05664012-2015.
1.2. Предназначение набора и его диагностическая роль
Набор реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV» предназначен для выявления
кДНК вируса Желтой лихорадки, предварительно синтезированных на матрице
РНК вируса Желтой лихорадки в реакции обратной транскрипции, и
гибридизационно-флуорецентной детекции продуктов амплификации в режиме
реального времени на приборах Rotor-Gene 6000/3000 (Corbett Research,
Австралия), CFX96 (BioRad, США) или аналогичных приборах других
производителей.
Диагностическая роль набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV»
заключается в возможности его использования для ранней диагностики желтой
лихорадки (конец инкубационного периода и начальная стадия заболевания) и
индикации патогенных биологических агентов (ПБА); как ускоренного
предварительного теста при выполнении культурального и биологического
методов исследования и идентификации подозрительных культур; для
эпидемиологического мониторинга.
1.3. Область применения набора
Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика
вируса желтой лихорадки, специфическая индикация патогенных
биологических агентов, эпидемиологический мониторинг.
Набор реагентов может быть использован в учреждениях медицины и
здравоохранения, вирусологических лабораториях Центров гигиены и
эпидемиологии Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах, имеющих
Лицензию на деятельность в области использования возбудителей
--- стр. 3 ---
инфекционных заболеваний человека и животных I-IV групп патогенности, дл^
расшифровки вспышек арбовирусных инфекций, а также, стационарных i
мобильных лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическо(
заключение на проведение работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
Компоненты набора являются одноразовыми.
Набор реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV» не требует технического обслуживанш
и калибровки.
2.1. Состав набора
Набор реагентов состоит из 4 реагентов.
№ Состав комплекта Описание Объем (мл) Кол-во
1. Реагент-1-YFV прозрачная
бесцветная жидкость
0,20 1 пробиркг
2. Реагент-2-YFV прозрачная
бесцветная жидкость 0,20 1 пробиркг
3. Положительный
контроль-ный образец,
ПКО- YFV
прозрачная
бесцветная жидкость 0,20 1 пробиркг
4. Отрицательный
контроль-ный образец,
ОКО- YFV
прозрачная
бесцветная жидкость 0,20 1 пробиркг
Реагент-1-YFV расфасован по 200 мкл в микропробирку с
завинчивающейся крышкой объемом 1,0-2,0 мл. Состав: ЮхПЦР-буфер; 5 мМ
дНТФ - водный раствор дезоксирибонуклеозид-трифосфатов; ЮОмМ MgCb;
Праймеры PrF и PrR ;зонд флуоресцентно-меченный.
Реагент-2-YPV расфасован по 200 мкл в микропробирку с
завинчивающейся крышкой объемом 1,0-2,0 мл. Состав: ЮхПЦР-буфер;
Smart Taq ДНК-полимераза.
Положительный контрольный образец расфасован по 200 мкл в
микропробирку с завинчивающейся крышкой объемом 1,0-2,0 мл. Состав:
--- стр. 4 ---
раствор рекомбинантной бактериальной плазмиды в ТЕ-буфере, несущей
вирусспецифическую вставку.
Отрицательный контрольный образец расфасован по 200 мкл в
микропробирку с завинчивающейся крышкой объемом 1,0-2,0 мл. Состав:
деионизованная вода.
Набор реагентов упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой.
Вторичной упаковкой может быть пакет с застежкой или пакет, вложенный в
коробку. В этом случае пакет и инструкцию по применению вкладывают в
коробку.
Примечание. Ингредиентами, которые могут влиять на измерения,
являются праймеры и флуоресцентные зонды, основной характеристикой
которых для конечного пользователя является температура отжига,
составляющая 54 °С. Данная характеристика реализуется с помощью
температурно-временного режима амплификации, следовательно, его
соблюдение является строго обязательным.
2.2. Количество анализируемых проб
Набор реагентов рассчитан на проведение 20 определений, включая
контроли.
2.3. Метод исследования
Обнаружение фрагментов нуклеиновых кислот вируса желтой лихорадки
основано на использовании метода обратной транскрипции, и
гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в
режиме реального времени.
Метод основан на многократном увеличении числа копий фрагмента
вирусных нуклеиновых кислот (комплементарной ДНК - к ДНК) с
одновременной гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов
амплификации, что позволяет обнаружить специфичный участок генома
возбудителя с целью его идентификации. Для проведения HTTP в режиме
реального времени используют специфические праймеры (прямой и обратный)
--- стр. 5 ---
и флуоресцентно-меченый зонд. Специфические праймеры обеспечивают
амплификацию фрагментов кДНК, предварительно синтезированной на
матрице РНК, соответствующих нуклеотидной последовательности участка
генома вируса желтой лихорадки.
2.3. Ограничения метода
В инфицированном материале РНК вирусов может быть не обнаружена
по причине ингибирования обратной транскрипции, ПЦР-РВ и/или
недостаточной эффективности выделения нуклеиновых кислот. Для
достижения показателей аналитической чувствительности используемый набор
для выделения должен обеспечивать эффективность выделения НК на уровне
не менее 20 %.
Причиной получения ложноположительного результата является
контаминация на этапе выделения НК либо проведения реакций ОТ, ПЦР-РВ.
Ложноположительный результат выявляется с помощью отрицательных
контрольных образцов выделения и ОТ-ПЦР-РВ (п. 8.3 настоящей инструкции).
Причиной получения ложноотрицательного результата является
ингибирование ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточная эффективность выделения
ЬЖ. Ложноотрицательный результат выявляется с помощью положительных
контрольных образцов вьщеления РНК и ОТ-ПЦР-РВ
(п. 8.3 настоящей инструкции).
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1.АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Исследования аналитических характеристик набора проведены на базе
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) и в
испытательной лаборатории ООО «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР» (г. Москва) в
рамках исследования эффективности набора и проведения технических
испытаний.
При проведении исследований наблюдалась полная
внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость
для всех исследуемых образцов.
5
--- стр. 6 ---
♦
3.1.1. Чувствительность
Набор реагентов должен выявлять 1хЮ^ копий кДНК вируса желтой
лихорадки в 30 мкл реакционной смеси.
3.1.2. Специфичность
Набор реагентов не должен давать положительных результатов с
образцами здоровых доноров или образцами, содержащими генетический
материал гетерологичных вирусов.
3.2. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Исследования аналитических характеристик набора проведены на базе
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Новосибирской области) и в
испытательной лаборатории ООО «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР» (г. Москва) в
рамках исследования эффективности набора и проведения технических
испытаний.
При проведении исследований наблюдалась полная
внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость
для всех исследуемых образцов.
3.2.1. Диагностическая чувствительность
Диагностическая чувствительность - не менее 98 % с доверительной
вероятностью 90 %. При исследовании 448 положительных образцов,
содержащих РНК вируса желтой лихорадки в концентрации 1,0x10^ копий
кДНК в 30 мкл реакционной смеси, положительный результат в ПЦР получен
для 448 образцов.
3.2.2. Диагностическая специфичность
Диагностическая специфичность — не менее 98 % с доверительной
вероятностью 90 %.
При исследовании 448 отрицательных образцов, содержащих НК
гетерологичных микроорганизмов отрицательный ответ в ПЦР получен во всех
100 % случаях.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ
--- стр. 7 ---
Вирус желтой лихорадки относится ко II группе патогенности (СП
1.3.3118-13).
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦР) исследования биологического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-
эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 «Безопасность работ с
микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими
отходами».
В соответствии с п.2.1.6 СП 1.3.3118-13 «Безопасность работ с
микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)»:
- диагностика молекулярно-генетическими методами (без накопления
возбудителя) по детекции в клиническом материале возбудителей
инфекционных болезней могут проводиться в лабораториях, имеющих
санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с
микроорганизмами III группы патогенности в соответствии с требованиями
санитарных правил "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп
патогенности и гельминтами", утвержденных постановлением Главного
государственного врача Российской Федерации от 28.01.2008 N 4
(зарегистрировано Минюстом России 21 февраля 2008 г. N 11197);
- исследования по детекции нуклеиновых кислот проводятся в
боксированных помещениях, оборудованных системами приточной и вытяжной
вентиляции или боксах микробиологической безопасности II класса.
Материал для исследований подлежит предварительной обработке в
соответствии методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы
лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
При работе необходимо всегда выполнять следующие требования:
- Рассматривать исходные исследуемые образцы биологического
материала как инфекционно-опасные.
--- стр. 12 ---
0
диагноз, дату поступления, вакцинный статус и пр. указывают в
сопроводительной карточке (см. ниже раздел 5).
После завершения сбора образцов от больного (больных) все
инструменты и подсобные материалы, а также использованные средства
индивидуальной защиты (перчатки, халат и пр.) дезинфицируют согласно
требованиям СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II
групп патогенности (опасности)».
Выделение РНК из клинических образцов осуществляют при соблюдении
требований МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих
методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом,
содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и СП 1.3.3118-13
«Безопасность работ с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
Работа по выполнению стадии выделения Р1Ж проводится в BSL-3 с
использованием наборов реагентов для выделения РНК вируса из клинических
образцов и секционного материала, например, «Рибо-сорб» (ЦНИИЭ, Россия)
или аналогичных, в соответствии с инструкциями производителей наборов.
Отбор проб насекомых осуществляют в соответствии с МУ 3.1.1027-01
«Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих
членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций».
6.3. Ограничения по использованию анализируемого материала
Для выделения РНК используют зарегистрированные наборы реагентов.
Для достижения показателей аналитической чувствительности объем аликвоты
исходного материала (пробы) должен составлять не менее 100 мкл. Для
получения кД1Ж используют зарегистрированные наборы реагентов и
полученный препарат РНК. Полученную кДНК используют для проведения
анализа с помощью набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV ».
6.4. Условия транспортирования и возможного хранения
анализируемых образцов
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят
при температуре от 2 °С до 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036-
12
--- стр. 13 ---
95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов
I-IV групп патогенности».
Исследуемые пробы хранят при температуре от 2 °С до 8 °С не более 2
суток, при температуре от минус 16 °С до минус 20 °С не более одного месяца,
при температуре минус 70 °С или в жидком азоте в течение 1 года, не допуская
его оттаивания до проведения исследования.
При замораживании клинического материала его транспортировка также
должна проводиться в замороженном состоянии. Допускается только
однократное замораживание-оттаивание образцов.
6.5. Меры предосторожности к материалу исследования
Учет, хранение, передача и транспортирование биологического материала,
подозрительного на наличие вируса желтой лихорадки, должны осуществляться
в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами
по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности
(опасности) (СП 1.3.3118-13) и действующими санитарными правилами о
порядке учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV
групп патогенности.
Клинический материал утилизируют по классу В, как чрезвычайно
эпидемиологически опасные отходы в соответствии с Санитарно-
эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами
(СанПиН 2.1.7.2790-10) и СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с
микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
7. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
«RNase-free», «DNase-free».
7.1. Процедура приготовления образцов
7.1.1. Приготовление реакционной смеси: в отдельной микропробирке
объемом 1,5 мл готовят смесь компонентов следующего состава (из расчета на
одну пробу):
13
--- стр. 14 ---
Реагент-1-YFV Юмкл
Реагент-2-YFV Юмкл
Смесь перемешивают пипетированием. Все реакционные компоненты
добавляют отдельными наконечниками с помощью дозаторов переменного
объёма: 0.5-10, 5-40 и 40-200 мкл.
7.2. Разведение препарата кДНК (при необходимости)
Образцы кДНК, полученные в реакции обратной транскрипции,
разбавляют равным объемом деионизованной воды (деионизованная вода не
поставляется) или, в случае использования наборов «Реверта-L», ДНК-
буфером, как это указано в инструкции к набору «Реверта-L» (ФБУН «ЦНИИ
эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия).
8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
8.1. Расход каждого реагента (минимальный)
На одно определение расходуются:
Реагент-1-YFV 10 мкл
Реагент-2-YFV Юмкл
На каждый анализ расходуются:
- ЮмклПКО-YFV;
- 10 мкл ОКО- YFV;
-20 мкл реакционной смеси;
-10 мкл исследуемого образца.
8.2. Последовательность проведения этапов анализа
Включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией
по эксплуатации.
Реактивы для проведения ПЦР извлекают из холодильника. Перед
использованием встряхивают пробирки с реагентами на микроцентрифуге-
вортекс в течение 5 секунд при 3000 об-мин'* и осаждают капли на дно
пробирки кратковременным центрифугированием.
14
--- стр. 15 ---
Для проведения амплификации используют прозрачные микропробирки
объемом 0,2 мл в соответствии с количеством исследуемых образцов.
Помещают микропробирки в штатив и маркируют в соответствии с
протоколом исследования на боковой стенке пробирки.
Внимание! При использовании амплификатора планшетного типа следует
избегать нанесения маркировки на крышки микропробирок.
Открывают крышки микропробирок и вносят в них по 20 мкл
реакционной смеси.
Используя наконечники с аэрозольным барьером, в микропробирки
последовательно вносят соответственно порядку исследования образцов по
10 мкл OKO-YFV, и далее по 10 мкл растворов исследуемых образцов,
закрывают крышки данных микропробирок.
Вносят (в последнюю очередь) по 10 мкл ПКО-YFV в микропробирки
соответственно маркировке, закрывают крышки данных микропробирок.
- Общий (конечный) объём реакционной смеси в каждой пробирке
должен составить 30 мкл.
Перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и
центрифугируют 5 секунд при 3000 об*мин'\
ВНИМАНИЕ! После смешивания компонентов микропробирки сразу
устанавливают в амплификатор и запускают реакцию.
Помещают микропробирки в прибор в соответствии с протоколом
исследования (таблица 1);
Таблица 1 - Рекомендуемый порядок исследования образцов
Мячейки Образец
1 ПКО-YFV
2 OKO-YFV
3 исследуемый образец 1
4 исследуемый образец 2
5
*Примечание: До начала работы штатив рекомендуется охладить в
бытовом холодильнике до температуры 2-8 °С
15
--- стр. 16 ---
Закрывают крышку прибора, и при использовании прибора Rotor Gene
6000/3000 (Corbett Research,Австралия) или Rotor Gene Q (QIAGEN) задают
программу амплификации со следуюш;ими параметрами:
- объем реакционной смеси - 30 мкл;
- температурно-временные режимы:
Температура (°C ) Время
(минутыхекунды)
Измерение
флуоресценции Количество циклов
95 05:00 - 1
94 00:10 .
554 00:20 -
72 00:20 -
94 00:10 -
4554 00:20 JOE/Yellow/HEX/R6G
72 00:20 -
измерение флуоресценции при шаге 54 °С на канале
JOE/Yellow/HEX/R6G;
- выполнение калибровки (оптимизации) по каналу JOE/Yellow/HEX/R6G
при первом шаге детекции;
- калибровка канала JOE/Yellow/HEX/R6G от 5 F1 до 10 F1.
После чего запускают программу амплификации и фиксируют в рабочем
журнале название файла с результатом работы прибора, расчетное время
анализа составляет в среднем 1,5 часа.
При использовании прибора планшетного типа (например, CFX96
(BioRad, США)) задают следующую программу амплификации: удержание
температуры 95°С - 5 минут; 5 циклов без измерения флуоресценции, каждый
из которых включает 94°С - 5 секунд, 54°С - 20 секунд, 72°С - 20 секунд;
далее 45 циклов, каждый из которых включает 94°С - 10 секунд, 54°С - 20
секунд, 72°С - 20 секунд с измерением флуоресценции при шаге 54°С на
канале HEX.
8.3. Процедура измерения и оценки результатов анализа
8.3.1.Анализ результатов при использовании амплификаторов Rotor Gene
6000/3000 (Corbett Research, Австралия) или Rotor Gene Q (QIAGEN).
16
--- стр. 17 ---
Анализ результатов амплификации кДНК вируса желтой лихорадки
проводят по каналу JOEA^ellow, для этого:
1. нажать в меню кнопку «Апа1уз18»/«Анализ», выбрать режим анализа
«Quantitation»/«Koличecтвeнный», нажать кнопку «Cycling А. ЮЕ»/ «Cycling
А. Yellow»;
2. отменить автоматический выбор Threshold/Порог;
3. в меню основного окна (Quantitation analysis/Количественный анализ)
должны быть нажаты две кнопки «Dynamic ШЬе»/«Динамический фон» и
«Slope СоггесЪ>/«Коррекция уклона»;
4. в меню основного окна «More setting»/«Outlier Removal»/«yстранение
выбросов» установить значение NTC threshold/Порог Фона — ПФ (NTC) 10 %;
5. в меню «СТ Са1си1аЕоп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна)
выставить Threshold/nopor=0,03;
6. в таблице результатов (окно «Quant. Results»/ Количественные
Результаты») появятся значения Ct.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия)
пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем
уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию)
значения порогового цикла “Ct” в соответствующей графе в таблице
результатов).
8.3.2. Анализ результатов при использовании амплификаторов планшетного
типа проводят по каналу JOE/Yellow/HEX/R6G, руководствуясь инструкцией
производителя к прибору. Результаты интерпретируются на основании наличия
(или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (что
соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла “Ct” в
соответствующей графе в таблице результатов).
8.3.3 Результаты анализа подлежат учету:
- появления пересечения кривых флуоресценции с пороговой линией на
канале JOE/Yellow/ HEX/R6G в пробах с положительными контрольными
образцами (ПКО);
17
--- стр. 18 ---
-отсутствия положительного сигнала на канале JOE/Yellow/HEX/R6G в
пробе с отрицательными контрольными образцами (ОКО).
Результат считать положительным в случае, если кривая накопления
флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную
«сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. При этом значение Ct
для данного образца должно быть не больше 40. Амплитуда сигнала при этом
не имеет значения.
Результат считают отрицательным, если значение Ct на канале
JOEArellow/HEX/R6G отсутствует. Если значение Ct больше 40, то ПЦРрв
необходимо повторить и считать положительным в случае повторения
результата или при значении Ct не больше 40.
8.3.4 Результаты анализа не подлежат учету;
— отсутствие пересечения кривых флуоресценции с пороговой линией
хотя бы на кaнaлt JOEA^ellow/HEX/R6G в пробах с положительными
контрольными образцами ПКО;
- наличие положительного сигнала хотя бы на одном из каналов
JOEAfellow/HEX/R6G в пробе с отрицательными контрольными
образцами (ОКО).
9. РАСЧЕТЫ
9.1. Используемые компьютерные программы
Для проведения ПЦР-РВ и оценки её результатов используют
специализированное программное обеспечение, поставляемое производителем
прибора. Работу с программным обеспечением осуществляют согласно
руководству по эксплуатации прибора.
10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И
ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
10.1 Условия хранения набора
В соответствии с ТУ 9398-051-05664012-2015 в холодильнике при температуре
от 2 до 8 °С.
18
--- стр. 19 ---
10.2. Условия транспортирования набора
Транспортирование набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV» должно
производиться крытым транспортом (автомобильным, железнодорожным либо
воздушным) в соответствии с ТУ 9398-051-05664012-2015 при температуре от
плюс 2 до плюс 8 °С в термоконтейнере.
10.3. Срок годности набора
Срок годности набора реагентов составляет 12 месяцев со дня
изготовления предприятием-изготовителем. Серии наборов реагентов с
истекшим сроком годности применению не подлежат. Срок годности вскрытых
реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для
невскрытых реагентов.
10.4. Информация по безопасной утилизации
Использованные пробирки с ампликонами, наконечники, перчатки, ветошь
для обработки поверхностей в ПЦР-боксе, собирают в пластиковые
закрываюгциеся емкости, выносят с целью последуюгцей инактивации согласно
требованиям СанПиН 2.1.7.2790-10 и МУ 1.3.2569-09.
Наборы с истекшим сроком годности, вскрытые, но не использованные
наборы, а также наборы с поврежденной упаковой, утилизируют по классу А,
как эпидемиологически безопасные отходы, по составу приближенные к ТБО
(СанПиН 2.1.7.2790-10).
10.5. Гарантийные обязательства производителя
Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных
характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и
эксплуатационной документации, в течение установленного срока годности
(12 месяцев) при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и
применения.
Рекламации на качество набора реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV» в
течение срока годности направлять на предприятие-изготовитель: 630559,
Россия, рабочий поселок Кольцово Новосибирской области, ФБУН ГНЦ ВБ
«Вектор» Роспотребнадзора, тел. (383) 336-60-10, факс(383) 336-74-09.
19
--- стр. 20 ---
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по
применению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании,
фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и
медицинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется
направить сообщение на предприятие-изготовитель ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора по адресу, указанному выше, и в уполномоченную
государственную регулирующую организацию в соответствии с действующим
законодательством.
Зам. Генерального директора
по научной работе
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора
Зав. ОБТК
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора
Согласовано:
Генеральный директор
ООО «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР»
А.П. Агафонов
М.П. Богрянцева
П.К. Варнавичус
20
--- стр. 23 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел молекулярной вирусологии
флавивирусов и вирусных гепатитов
(отд. 03.01.00), лаборатория молекулярной
эпидемиологии ООИ
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
Телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
ПАСПОРТ № 51 от 04.05.2017
Набор реагентов для выявления кДНК вируса желтой лихорадки методом полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YFV »
(комплектация V20)
по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Номер серии ЖОО1-05-2017
Количество наборов в серии 20
Дата выпуска 04.05.2017
Контрольный номер ОБТК № 51
Дата изготовления 03.05.2017
Анализ выполнен по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Наименование
показателя
Требования НД Результаты анализа
1 2 3
Внешний вид Реагент-1-YFV, Реагент-2-YFV,
HKO-YFV и OKO-YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
Реагент-1-YFV, Реагент-2-
YFV, ПКО-YFV и OKO-
YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
При переворачивании микропробирок не
должно наблюдаться протечек веществ. Не наблюдается
Подлинность,
специфичность
Наличие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX (530 нм/555
нм) в пробах с положительными
контрольными образцами (ПКО- YFV).
Соответствует
(протокол № 1ЖЛ от 04 мая
2017 г.)
Наличие положительного
сигнала на канале Yellow в
пробах с положительными
контрольными образцами
(ПКО-YFV)
и СОП ПКО YFV серия
№01-05.17.
Отсутствие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX в пробе с
отрицательными контрольными
образцами (OKO-YFV и СОН ДНК
человека).
Отсутствие
флуоресцентного сигнала в
OKO-YFV и СОП ДНК
человека серия №01-10.16.
Чувствительность Набор реагентов должен выявлять в ПЦР
10^ копий рекомбинантной плазмиды,
содержащей вставку ДНК,
комплементарную участку РНК вируса
желтой лихорадки.
Выявляет в ПЦР
1,24x10' копий.
Использовали
последовательные
разведения СОП ПКО YFV
№01-05.17 с щагом 10 от
исходного (0,056 мкг/мл)
до 10‘°
--- стр. 24 ---
Наименование
показателя
Требования НД Результаты анализа
Повторяемость Коэффициент вариации для
повторяемости не должен превышать
3 %
0,49 %
Воспроизводимость Коэффициент вариации для
воспроизводимости не должен
превышать 6 %.
1,48%
Биологические
препараты для
производства и
контроля
ПКО-YFV с концентрацией плазмидной
ДНК - не менее 10 пг/мл
45 пг/мл
Комплектность В соответетвии с требованиями ТУ п. 1.3 Соответствует
Упаковка В микропробирках с завинчивающейся
крышкой объемом 1,0-2,0 мл
(полипропиленовые, “Axygen”, США Кат.
№ МСТ-060 или аналогичные).
Набор реагентов упаковывают в
полиэтиленовый пакет с застежкой
("Медиген", Россия, кат. № 170107 или
аналогичный). Вторичной упаковкой
может быть пакет с застежкой или пакет,
вложенный в коробку. В этом елучае
пакет и инструкцию по применению
вкладывают в коробку.
Соответствует
Маркировка В соответствии с требованиями ТУ п. 1.5 Соответствует
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым транспортом
(автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от 2 °С до 8 °С в
термоконтейнере.
Хранение при температуре от 2 “С до 8 “С.
Срок годности - 1 год.
Заключение: соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015.
Зав. ОБТК
М.П. Богрянцева
--- стр. 25 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел молекулярной вирусологии
флавивирусов и вирусных гепатитов
(отд. 03.01.00), лаборатория молекулярной
эпидемиологии ООИ
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
Телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
ПАСПОРТ № 53 от 04.05.2017
Набор реагентов для выявления кДНК вируса желтой лихорадки методом полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YFV »
(комплектация V20)
по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Номер серии Ж002-05-2017
Количество наборов в серии 20
Дата выпуска 04.05.2017
Контрольный номер ОБТК № 53
Дата изготовления 03.05.2017
Анализ выполнен по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Наименование Требования НД Результаты анализа
показателя
1 2 3
Внешний вид Реагент-1-YFV, Реагент-2-YFV,
HKO-YFV и OKO-YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
Реагент-1-YFV, Реагент-2-
YFV, HKO-YFV и OKO-
YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
При переворачивании микропробирок не
должно наблюдаться протечек веществ. Не наблюдается
Подлинность,
специфичность
Наличие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX (530 нм/555
нм) в пробах с положительными
контрольными образцами (ПКО- YFV).
Соответствует
(протокол № 2ЖЛ от 04 мая
2017 г.)
Наличие положительного
сигнала на канале HEX в
пробах с положительными
контрольными образцами
(HKO-YFV)
и СОН ПКО YFV серия
№01-05.17.
Отсутствие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX в пробе с
отрицательными контрольными
образцами (OKO-YFV и СОН ДНК
человека).
Отсутствие
флуоресцентного сигнала в
OKO-YFV и СОН ДНК
человека серия №01-10.16.
Чувствительность Набор реагентов должен выявлять в ПЦР
10^ копий рекомбинантной плазмиды,
содержащей вставку ДНК,
комплементарную участку РНК вируса
желтой лихорадки.
Выявляет в ПЦР
1,24х10' копий.
Использовали
последовательные
разведения СОП ПКО YFV
№01-05.17 с шагом 10 от
исходного (0,056мкг/мл) до 10-ю
--- стр. 26 ---
Наименование
показателя
Требования НД Результаты анализа
Повторяемоеть Коэффициент вариации для
повторяемости не должен превышать
3 %
1,08%
Воспроизводимость Коэффициент вариации для
воспроизводимости не должен
превышать 6 %.
1,45 %
Биологические
препараты для
производства и
контроля
ПКО-YFV с концентрацией плазмидной
ДНК - не менее 10 пг/мл
45 пг/мл
Комплектность В соответствии с требованиями ТУ п. 1.3 Соответствует
Упаковка В микропробирках с завинчивающейся
крышкой объемом 1,0-2,0 мл
(полипропиленовые, “Axygen”, США Кат.
№ МСТ-060 или аналогичные).
Набор реагентов упаковывают в
полиэтиленовый пакет с застежкой
("Медиген", Россия, кат. № 170107 или
аналогичный). Вторичной упаковкой
может быть пакет с застежкой или пакет,
вложенный в коробку. В этом случае
пакет и инструкцию по применению
вкладывают в коробку.
Соответствует
Маркировка В соответствии с требованиями ТУ п. 1.5 Соответствует
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым транспортом
(автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от 2°С до 8 °С в
термоконтейнере.
Хранение при температуре от 2°С до 8 °С.
Срок годности - 1 год.
Заключение: соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015.
М.П. Богрянцева
--- стр. 27 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел молекулярной вирусологии
флавивирусов и вирусных гепатитов
(отд. 03.01.00), лаборатория молекулярной
эпидемиологии ООИ
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
Телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
ПАСПОРТ № 52 от 04.05.2017
Набор реагентов для выявления кДНК вируса желтой лихорадки методом полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YFV »
(комплектация V20)
по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Номер серии ЖООЗ-05-2017
Количество наборов в серии 20
Дата выпуска 04.05.2017
Контрольный номер ОБТК № 52
Дата изготовления 03.05.2017
Анализ выполнен по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Наименование Требования НД Результаты анализа
показателя
1 2 3
Внешний вид Реагент-1-YFV, Реагент-2-YFV,
HKO-YFV и OKO-YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
Реагент-1-YFV, Реагент-2-
YFV, HKO-YFV и OKO-
YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
При переворачивании микропробирок не
должно наблюдаться протечек веществ. Не наблюдается
Подлинность,
специфичность
Наличие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX (530 нм/555
нм) в пробах с положительными
контрольными образцами (ПКО- YFV).
Соответствует
(протокол № 1ЖЛ от 04 мая
2017 г.)
Наличие положительного
сигнала на канале Yellow в
пробах с положительными
контрольными образцами
(HKO-YFV)
и СОН ПКО YFV серия
№01-05.17.
Отсутствие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX в пробе с
отрицательными контрольными
образцами (OKO-YFV и СОН ДНК
человека).
Отсутствие
флуоресцентного сигнала в
OKO-YFV и СОН ДНК
человека серия №01-10.16.
Чувствительность Набор реагентов должен выявлять в ПЦР
10^ копий рекомбинантной плазмиды,
содержащей вставку ДНК,
комплементарную участку РНК вируса
желтой лихорадки.
Выявляет в ПЦР
1,24x1 о' копий.
Использовали
последовательные
разведения СОН ПКО YFV
№01-05.17 с шагом 10 от
исходного (0,056мкг/мл) до 10-ю
--- стр. 28 ---
Наименование
показателя
Требования НД Результаты анализа
Повторяемость Коэффициент вариации для
повторяемости не должен превышать
3 %
1,45 %
Воспроизводимость Коэффициент вариации для
воспроизводимости не должен
превышать 6 %.
1,65 %
Биологические
препараты для
производства и
контроля
ПКО-YFV с концентрацией плазмидной
ДНК - не менее 10 пг/мл
45 пг/мл
Комплектность В соответствии с требованиями ТУ п. 1.3 Соответствует
Упаковка В микропробирках с завинчивающейся
крышкой объемом 1,0-2,0 мл
(полипропиленовые, “Axygen”, США Кат.
№ МСТ-060 или аналогичные).
Набор реагентов упаковывают в
полиэтиленовый пакет с застежкой
("Медиген", Россия, кат. № 170107 или
аналогичный). Вторичной упаковкой
может быть пакет с застежкой или пакет,
вложенный в коробку. В этом случае
пакет и инструкцию по применению
вкладывают в коробку.
Соответствует
Маркировка В соответствии с требованиями ТУ п. 1.5 Соответствует
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым транспортом
(автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от 2°С до 8 °С в
термоконтейнере.
Хранение при температуре от 2 °С до 8 °С.
Срок годности - 1 год.
Заключение: соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015.
Зав. ОБТК
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора М.П. Богрянцева
--- стр. 29 ---
ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор"
Роспотребнадзора
Отдел молекулярной вирусологии
флавивирусов и вирусных гепатитов
(отд. 03.01.00), лаборатория молекулярной
эпидемиологии ООИ
630559, рабочий поселок Кольцово
Новосибирской области
Телефон ОБТК: 8(383)-336-73-16
ПАСПОРТ № 54 от 04.05.2017
Набор реагентов для выявления кДНК вируса желтой лихорадки методом полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YFV »
(комплектация V20)
по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Номер серии Ж004-05-2017
Количество наборов в серии 20
Дата выпуска 04.05.2017
Контрольный номер ОБТК № 54
Дата изготовления 03.05.2017
Анализ выполнен по проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
Наименование Требования НД Результаты анализа
показателя
1 2 3
Внешний вид Реагент-1-YFV, Реагент-2-YFV,
HKO-YFV и OKO-YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
Реагент-1-YFV, Реагент-2-
YFV, HKO-YFV и OKO-
YFV - прозрачные
бесцветные жидкости.
При переворачивании микропробирок не
должно наблюдаться протечек веществ. Не наблюдается
Подлинность,
специфичность
Наличие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX (530 нм/555
нм) в пробах с положительными
контрольными образцами (ПКО- YFV).
Соответствует
(протокол № 2ЖЛ от 04 мая
2017 г.)
Наличие положительного
сигнала на канале HEX в
пробах с положительными
контрольными образцами
(HKO-YFV)
и СОН ПКО YFV серия
№01-05.17.
Отсутствие положительного сигнала на
канале R6G/Yellow/HEX в пробе с
отрицательными контрольными
образцами (OKO-YFV и СОН ДНК
человека).
Отсутствие
флуоресцентного сигнала в
OKO-YFV и СОН ДНК
человека серия №01-10.16.
Чувствительность Набор реагентов должен выявлять в ПЦР
10^копий рекомбинантной плазмиды,
содержащей вставку ДНК,
комплементарную участку РНК вируса
желтой лихорадки.
Выявляет в ПЦР
1,24x10^ копий.
Использовали
последовательные
разведения СОН ПКО YFV
№01-05.17 с шагом 10 от
исходного (0,056мкг/мл) до 10-ю
--- стр. 30 ---
Наименование
показателя
Требования НД Результаты анализа
Повторяемость Коэффициент вариации для
повторяемости не должен превышать
3 %
1,47 %
Воспроизводимость Коэффициент вариации для
воспроизводимости не должен
превышать 6 %.
1,62%
Биологические
препараты для
производства и
контроля
ПКО-YFV с концентрацией плазмидной
ДНК - не менее 10 пг/мл
45 пг/мл
Комплектность В соответетвии с требованиями ТУ п. 1.3 Соответствует
Упаковка В микропробирках с завинчивающейся
крышкой объемом 1,0-2,0 мл
(полипропиленовые, “Axygen”, США Кат.
№ МСТ-060 или аналогичные).
Набор реагентов упаковывают в
полиэтиленовый пакет с застежкой
("Медиген", Россия, кат. № 170107 или
аналогичный). Вторичной упаковкой
может быть пакет с застежкой или пакет,
вложенный в коробку. В этом случае
пакет и инструкцию по применению
вкладывают в коробку.
Соответствует
Маркировка В соответствии с требованиями ТУ п. 1.5 Соответствует
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым транспортом
(автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от 2 °С до 8 °С в
термоконтейнере.
Хранение при температуре от 2 °С до 8 °С.
Срок годности - 1 год.
♦
Заключение: соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015.
Зав. ОБТК
М.П. Богрянцева
--- стр. 31 ---
ПРОТОКОЛ № 1ЖЛ (от 04 мая 2017 г.)
лабораторного испытания набора реагентов для амплификации кДНК вируса желтой
лихорадки с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YFV »
серия Ж001-05-2017, дата изготовления 03.05.2017
серия ЖООЗ-05-2017, дата изготовления 03.05.2017
1. Принцип метода.
Набор реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV» предназначен для проведения амплификации
фрагментов кДНК вируса желтой лихорадки, предварительно синтезированных на
матрице РНК вируса желтой лихорадки в реакции обратной транскрипции, и
гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в режиме
реального времени.
Метод оенован на многократном увеличении числа копий фрагмента вирусных
нуклеиновых кислот (комплементарной ДНК - кДНК) с одновременной гибридизационно-
флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, что позволяет обнаружить
специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации. Для проведения
ПЦР в режиме реального времени используют специфические праймеры (прямой и
обратный) и флуоресцентно-меченый зонд. Специфические праймеры обеспечивают
амплификацию фрагментов кДНК, предварительно еинтезированной на матрице РНК,
соответствующих нуклеотидной поеледовательности участка генома вируса желтой
лихорадки.
2. Меры предосторожности.
Все компоненты набора в иепользуемых концентрациях являютея нетоксичными. ПЦР-
анализ выполнялся в соответствии с требованиями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы
лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с
материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенноети».
3. Анализируемые образцы.
В ПЦР-анализе не использовался вируссодержащий материал.
В качестве анализируемых образцов иепользовали; положительный контрольный
образец (HKO-YFV), предетавляющий собой раствор рекомбинантной плазмиды pCR
2.1, содержащей вирусоспецифическую вставку; СОП ДНК человека серия №01-10.16,
представляющий собой ДНК человека выделенную из крови здоровых доноров. СОП
ПКО YFV серия №01-05.17 предетавляющий собой раствор рекомбинантной плазмиды
pCR 2.1, еодержащей вирусоспецифичеекую вставку (длина 4,2 кЬ);
В качестве отрицательного контрольного образца иепользовали деионизованную
воду.
4. Протокол ПЦР амплификации
Набор реагентов включает в себя пару праймеров, обеспечивающую специфичную
амплификацию фрагментов ДНК и флуоресцентно меченый зонд.
Постановку ПЦР проводили в объеме 30 мкл реакционной емеси следующего
состава:
Компоненты Объем
Реагент 1-YFV
Реагент 2-YFV
Контрольный образец
10 мкл
10 мкл
10 мкл
ПЦР и детекцию результатов в режиме реального времени проводили на приборе
Rotor-Gene 6000 (Corbett Researeh, Австралия). Перед началом амплификации пробы
прогревались при 95 °С в течение 5 мин. Затем 5 циклов без измерения флуоресценции.
1
--- стр. 32 ---
каждый из которых включает 94°С - 5 секунд, 54°С - 20 секунд, 72°С - 20 секунд; далее
45 циклов, каждый из которых включает 94°С - 10 секунд, 54°С - 20 секунд, 72“С - 20
секунд с измерением флуоресценции при шаге 54°С на канале Yellow.
5. Учет полученных результатов.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов по каналу Yellow
проводили в приборе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия).
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией
(что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла “Ct” в
соответствующей графе в таблице результатов).
6. Результаты
6.1 Контроль аналитической чувствительности
Контроль аналитической чувствительности осуществляли проведением ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией, где в качестве исследуемых образцов
использовали последовательные разведения ПКО-YFV с шагом 10 от исходного до 10’'^.
После учета и анализа результатов ПЦР пересчитывали концентрацию плазмидной ДНК
последнего разведения, детектируемого как положительный образец, в количество копий
в исследуемом образце.
Результат оценки специфичности и аналитической чувствительности представлен в
таблице:
образец
значение Ct
Серия ЖОО1-05-2017 Серия ЖООЗ-05-2017
СОП ДНК человека N/A N/A
OKO-YFV N/A N/A
HKO-YFV 23,43 23,05
СОП nKO-YFV( 1,24x10** копий в
реакции) 12,38 11,74
-1 (1,24x1 о’ копий в реакции) 14,63 14,80
-2 (1,24x10*’ копий в реакции) 18,40 18,66
-3 (1,24x10^ копий в реакции) 21,98 22,01
-4 (1,24x10'* копий в реакции) 25,83 25,49
-5 (1,24х 10^ копий в реакции) 29,22 28,49
-6 (1,24x10^ копий в реакции)
-7 (1,24x10'копий в реакции)
--- стр. 34 ---
День/оператор №
обр
Ct
Y ellow
Сред
Ct Y ellow
Стандартное
отклонение
Повторяемость
День 1
Оператор 1
1 28,84 28,73 0,42 1,45
2 28,43
3 28,37
4 28,62
5 28,73
6 29,79
7 28,46
8 28,40
9 28,84
10 28,84
День 2 1 27,30 28,24 0,39 1,40
Оператор 2 2 28,28
3 28,72
4 28,11
5 28,51
6 28,07
7 28,63
8 28,35
9 28,34
10 28,12
Воспроизводимость
Образцы СОН HKO-YFV
(1,24х 1 О^копий/мл)
Всего повторов’ 20
Среднее значение величины Ct 28,49
стандартное отклонение 0,47
коэффициент вариации CV, %
(медеду тестами) 1,65
общ ее число результатов, полученных в разные дни, разными операторами и т.д.
Коэффициент вариации для повторяемости по ТУ не должен превышать 3 %.
Серии Ж001-05-2017 и ЖООЗ-05-2017 соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
по повторяемости.
Коэффициент вариации для воспроизводимости по ТУ не должен превышать 6 %.
Серии Ж001-05-2017 и ЖООЗ-05-2017 соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
по воспроизводимости.
6.3 Контроль концентрации плазмидной ДНК.
Концентрацию плазмидной ДНК определяли с использованием набора реагентов
Quant-iT dsDNA, HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).
Результаты анализа концентрация HKO-YFV:
Серия ЖОО1-05-2017
Серия ЖООЗ-05-2017
45 пг/мл (1,0х10\опий/мл).
-у
45 пг/мл (1,0x10 копий/мл).
--- стр. 35 ---
Пересчет концентрации ДНК в количество копий произведен в программе-конвертере :
http://molbiol.ru/scripts/01 07.html по формулам:
m[g] = Q[mol] X Mw°™''[kDa] х 10^
m[g] = Q[mol] X <Mw>[Da] x L[kb] x 10^
К[штук] = Q[mol] X N a
c[M] X V[L] = Q[mol],
где
m [g] - вес нуклеиновой кислоты;
[kDa] - молекулярный вес олигонуклеотида.
<Mw> [Da] - средний молекулярный вес одного/пары оснований.
base= 324.5 Da
base pair = 649 Da
ribo base = 340.5 Da
Q [mol] - количество нукл. кислоты;
N [копий] - количество молекул нукл. кислоты;
с [М] - молярная концентрация нукл. кислоты;
V [L] - объём, в котором растворена нукл. кислота;
L [кЬ] - длина нукл. кислоты;
N a - Число Авогадро = 6.022045х1023[1/моль]
ПКО-YFV - рекомбинантная бактериальная плазмида, содержащая вставку ДНК,
комплементарную участку РНК вируса желтой лихорадки, в соответствии с проектом ТУ
9398-051-05664012-2015 имеет концентрациию плазмидной ДНК более 10 пг/мл.
Концентрация плазмидной ДНК в HKO-YFV в сериях Ж001-05-2017 и ЖООЗ-05-2017 - не
менее 10 пг/мл, что соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015.
■ к
?
--- стр. 36 ---
Аналитическая чувствительность набора реагентов:
Серия Ж001-05-2017 .............1,24х10'.
Серия ЖООЗ-05-2017 .............1,24х10‘.
Аналитическая чувствительность набора реагентов по ТУ должна составлять не
более 1x10^ копий ДНК в ПЦР. Серии Ж001-05-2017 и ЖООЗ-05-2017 соответствуют
проекту ТУ 9398-051-05664012-2015 по чувствительности.
6.4 Контроль аналитической чувствительности наборов реагентов
Зав.лабораторией молекулярной
эпидемиологии особо опасных инфекций
Н.с. отдела молекулярной вирусологии
флавивирусов и вирусных гепатитов
В.А. Терновой
Е.В. Чуб
Зав. отделом биологического
и технологического контроля М.П. Богрянцева
--- стр. 38 ---
№ Цвет Имя СТ
21 - I -4 25,49
22 -5 28,49
23 ■ -6 31,42
24 ■ -7 34,08
25 ■ -8
26 ■ -9
27 а -10
28 j пко 23,05
--- стр. 39 ---
ПРОТОКОЛ № 2ЖЛ (от 4 мая 2017 г.)
лабораторного испытания набора реагентов для амплификации кДНК вируса желтой
лихорадки с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YFV »
серия Ж002-05-2017, дата изготовления 03.05.2017
серия Ж004-05-2017, дата изготовления 03.05.2017
1. Принцип метода.
Набор реагентов «Вектор-ПЦРрв-YFV» предназначен для проведения амплификации
фрагментов кДНК вируса желтой лихорадки, предварительно синтезированных на
матрице РНК вируса желтой лихорадки в реакции обратной транскрипции, и
гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в режиме
реального времени.
Метод основан на многократном увеличении числа копий фрагмента вирусных
нуклеиновых кислот (комплементарной ДНК - кДНК) с одновременной гибридизационно-
флуоресцентной детекцией продуктов амплификации, что позволяет обнаружить
специфичный участок генома возбудителя с целью его идентификации. Для проведения
ПЦР в режиме реального времени используют специфические праймеры (прямой и
обратный) и флуоресцентно-меченый зонд. Специфические праймеры обеспечивают
амплификацию фрагментов кДНК, предварительно синтезированной на матрице РНК,
соответствующих нуклеотидной последовательности участка генома вируса желтой
лихорадки.
2. Меры предосторожности.
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. ПЦР-
анализ выполнялся в соответствии с требованиями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы
лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с
материалом, содержащим микроорганизмы I - IV групп патогенности».
3. Анализируемые образцы.
В ПЦР-анализе не использовался вируссодержащий материал.
В качестве анализируемых образцов использовали: положительный контрольный
образец (ПКО-YFV), представляющий собой раствор рекомбинантной плазмиды pCR
2.1, содержащей вирусоспецифическую вставку; СОП ДНК человека серия №01-10.16,
представляющий собой ДНК человека выделенную из крови здоровых доноров. СОП
ПКО YFV серия №01-05.17 представляющий собой раствор рекомбинантной плазмиды
pCR 2.1, содержащей вирусоспецифическую вставку (длина 4,0 кЬ);
В качестве отрицательного контрольного образца использовали деионизованную
воду.
4. Протокол ПЦР амплификации
Набор реагентов включает в себя пару праймеров, обеспечивающую специфичную
амплификацию фрагментов ДНК и флуоресцентно меченый зонд.
Постановку ПЦР проводили в объеме 30 мкл реакционной смеси следующего
состава:
Компоненты Объем
Реагент 1 - YFV 10 мкл
Реагент 2-YFV 10 мкл
Контрольный образец 10 мкл
ПЦР и детекцию результатов в режиме реального времени проводили на приборе
CFX96 (BioRad, США) используя следующую программу:
1
--- стр. 40 ---
Температура (°С) Время
(минутьгсекунды)
Измерение
флуоресценции Количество циклов
95 05:00 - 1
94 00:10 -
554 00:20 -
72 00:20 -
94 00:10 -
4554 00:20 HEX
72 00:20 -
5. Учет полученных результатов.
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе
CFX96 (BioRad, США) по каналу HEX.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения
кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией
(что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла “Ct” в
соответствующей графе в таблице результатов).
6. Результаты
6.1 Контроль аналитической чувствительности
Контроль аналитической чувствительности осуществляли проведением ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией, где в качестве исследуемых образцов
использовали последовательные разведения HKO-YFV с шагом 10 от исходного до 10'*^.
После учета и анализа результатов ПЦР пересчитывали концентрацию плазмидной ДНК
последнего разведения, детектируемого как положительный образец, в количество копий
в исследуемом образце.
Результат оценки специфичности и аналитической чувствительности представлен в
таблице:
образец значение Ct
Серия Ж002-05-2017 Серия Ж004-05-2017
СОП ДНК человека N/A N/A
OKO-YFV N/A N/A
HKO-YFV 21,80 21,31
СОП HKO-YFV( 1,24x10** копий в
реакции) 12,93 11,90
-1 (1,24x10’ копий в реакции) 15,13 14,45
-2 (1,24x10® копий в реакции) 19,12 18,22
-3 (1,24x10® копий в реакции) 23,39 21,51
-4 (1,24x10'* копий в реакции) 26,47 24,51
-5 (1,24x10® копий в реакции) 29,42 27,94
-6 (1,24x10® копий в реакции) 32,36 34,76
-7 (1,24x10* копий в реакции) 36,36 N/A
-8 N/A N/A
--- стр. 42 ---
Серия Ж004-05-2017
Повторяемость
СОН HKO-YFV
(1,24х 1 О^коний/мл)
День/оператор №
обр
Ct HEX Сред
Ct HEX
Стандартное
отклонение
Повторяемость
День 1
Оператор 1
1 28,00 28,14 0,41 1,47
2 28,03
3 28,56
4 28,10
5 29,16
6 27,95
7 27,83
8 27,97
9 27,80
10 28,02
День 2
Оператор 2
1 27,40 27,51 0,18 0,66
2 27,70
3 27,45
4 27,15
5 27,48
6 27,51
7 27,54
8 27,73
9 27,74
10 27,40
Воспроизводимость
Образцы СОН HKO-YFV
(1,24х 1 О^копий/мл)
Всего повторов’ 20
Среднее значение величины Ct 27,83
стандартное отклонение 0,45
коэффициент вариации CV, %
(между тестами) 1,62
общее число результатов, полученных в разные дни, разными операторами и т.,
Коэффициент вариации для повторяемости по ТУ не должен превышать 3 %.
Серии Ж002-05-2017 и Ж004-05-2017 соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
по повторяемости.
Коэффициент вариации для воспроизводимости по ТУ не должен превышать 6 %.
Серии Ж002-05-2017 и Ж004-05-2017 соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015
по воспроизводимости.
6.3 Контроль концентрации плазмидной ДНК.
--- стр. 43 ---
Концентрацию плазмидной ДНК определяли е использованием набора реагентов
Quant-iT dsDNA, HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).
Результаты анализа концентрация ПКО-YFV:
Серия Ж002-05-2017
Серия Ж004-05-2017
45 пг/мл (1,0х10\опий/мл).
45 пг/мл (1,0х10\опий/мл).
Пересчет концентрации ДНК в количество копий произведен в программе-конвертере :
http://molbiol.ru/scripts/01 07.html по формулам:
m[g] = Q[mol] X Mw°™^kDa] х 10^
m[g] = Q[mol] X <Mw>[Da] x L[kb] x 10^
Н[штук] = Q[mol] X N a
c[M] X V[L] = Q[mol],
где
m [g] - вес нуклеиновой кислоты;
[kDa] - молекулярный вес олигонуклеотида.
<Mw> [Da] - средний молекулярный вес одного/пары оснований.
base= 324.5 Da
base pair = 649 Da
ribo base = 340.5 Da
Q [mol] - количество нукл. кислоты;
N [копий] - количество молекул нукл. кислоты;
с [М] - молярная концентрация нукл. кислоты;
V [L] - объём, в котором растворена нукл. кислота;
L [кЬ] - длина нукл. кислоты;
N a - Число Авогадро = 6.022045х1023[1/моль]
HKO-YFV - рекомбинантная бактериальная плазмида, содержащая вставку ДНК,
комплементарную участку РНК вируса желтой лихорадки, в соответствии с проектом ТУ
9398-051-05664012-2015 имеет концентрациию плазмидной ДНК более 10 пг/мл.
Концентрация плазмидной ДНК в HKO-YFV в сериях Ж002-05-2017 и Ж004-05-2017 - не
менее 10 пг/мл, что соответствует проекту ТУ 9398-051-05664012-2015.
--- стр. 44 ---
Аналитическая чувствительность набора реагентов:
Серия Ж002-05-2017 ..............1,24х10’.
Серия Ж004-05-2017 ..............1,24х101
6.4 Контроль аналитической чувствительности наборов реагентов
Аналитическая чувствительность набора реагентов по ТУ должна составлять не
более 10^ копий ДНК в ПЦР. Серии Ж002-05-2017 и Ж004-05-2017 соответствует проекту
ТУ 9398-051-05664012-2015 по чувствительности.
Зав.лабораторией молекулярной
эпидемиологии особо опасных инфекций В.А. Терновой
Н.с. отдела молекулярной вирусологии
флавивирусов и вирусных гепатитов. Е.В.Чуб
Зав. отделом биологического и
технологического контроля М.П. Богрянцева
--- стр. 52 ---
--- стр. 53 ---
УТВЕРЖДАЮ
Г енеральный директор
ВБ "Вектор"
Макеютов
20
Ч 1
Маркировка медицинского изделия
Федеральное бюджетное учреждение науки
«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
Набор реагентов для амплификации кДНК вируса желтой лихорадки е гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YF V »
по ТУ 9398-051-05664012-2015
Внутренняя упаковка
ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
«Вектор-ПЦРрв-YF V »
Наименование реагента
Объем (мл)
Серия;
Годен до:
Хранить при температуре от 2 °С до 8 °С
Только для диагностики ин витро
Дата изготовления:
--- стр. 54 ---
’Ш Ш "
„УТВЕРЖДАЮ
Ьный директор
ГИЦ ВБ "Вектор"
п,
Маркировка
внешней упаковки
(коробка)
lib'т jUS '£ "E \t L rtvi 'I'fii',' x'S
V'..7f
Максютоп
2017 r.
h
Crp.l из 2
--- стр. 55 ---
Этикетка для коробки (пакета)
ч Ш ^ Федеральное бюджетное учреждение науки
«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
630S59, рабочий поселок Кольцово, Новосибирской области.
Тел. (383) 336-60-10, Тел./факс (383) 336-74-09
Набор реагентов для выявления кДНК вируса желтой лихорадки
методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YFV »
по ТУ 9398-051-05664012-2015
Регистрационный номер....................Дата регистрации.................
Серия: Дата изготовления: Годен до:
Хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым
транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при
температуре от 2 °С до 8 °С в термоконтейнере.
«Только для диагностики ин витро»________________________________________
Комплектация V20
Состав набора:
1. Реагент-1-YFV, прозрачная бесцветная жидкость,
0,2 мл, 1 пробирка.
2. Реагент-2-YFV, прозрачная бесцветная жидкость,
0,2 мл, 1 пробирка.
3. ПКО-YFV, прозрачная бесцветная жидкость,
0,2 мл, 1 пробирка.
4. OKO-YFV, прозрачная бесцветная жидкость,
0,2 мл, 1 пробирка.
Стр.
--- стр. 56 ---
УТВЕРЖДАЮ
Г енеральный диреьстор
[Ц ВБ "Вектор"
1ебнадзора
аксютс
20/>^.
Маркировка групповой упаковки
(транспортной тары)
Щ В ^ Федеральное бюджетное учреждение науки
«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
630559, рабочий поселок Кольцово, Новосибирской области.
Тел. (383) 336-60-10, Тел./факс (383) 336-74-09
Набор реагентов для выявления кДНК вируеа желтой лихорадки
методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
«Вектор-ПЦРрв-YF V »
по ТУ 9398-051-05664012-2015
Серия: Дата изготовления: Годен до:
Хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Транспортирование набора реагентов должно производиться крытым
транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при
температуре от 2 °С до 8 °С в термоконтейнере.
«Только для диагностики ин витро»
"Верх, не кантовать" "Боится нагревания".
"Боится сырости"
"Соблюдение интервала температур"
Масса нетто _____ Масса брутто _
"Вскрыть по получении".
Масса нетто набора ___
Количество наборов
--- стр. 57 ---
в данном ^
прошнуровано, |
пронумеровано и скреплено j
печатью листов j
^ и р о м и с ьк^ ^
должность, ПОДПИС{)