Набор реагентов для выявления генетических маркеров ДНК микобактерий туберкулезного комплекса, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Амплитуб-FQ-РВ) по ТУ 9398-003-46395995-2015 — инструкция и характеристики

РУ: РЗН 2017/5772 от 26.05.2017 · класс риска 3

Производитель: ООО "Синтол" (Россия)

Вид изделия: МЛУ-ТБ/ШЛУ-ТБ (MDR-TB/XDR-TB) M. tuberculosis комплекс нуклеиновые кислоты ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 114 контрактов, медианная цена за единицу 61 429 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 2 ---
1 НАЗНАЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОГО ИЗДЕЛИЯ ДЛЯ  
ДИАГНОСТИКИ ИН ВИТРО (далее МИ ИВД)
1Л Полное название
Набор реагентов для выявления генетических маркеров ДЬЖ 
микобактерий туберкулезного комплекса, ассоциированных с устойчивостью к 
фторхинолонам, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени 
(Амплитуб-FQ-PB) по ТУ 9398-003-46395995-2015.
1.2 Предназначение МИ ИВД и его диагностическая роль
Набор реагентов «Амплитуб-FQ-PB» предназначен для выявления генных 
мутаций ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (МВТ) в клиническом 
материале и образцах биологических культур методом полимеразной цепной 
реакции в реальном времени с праймерами, специфичными в отношении 
фрагментов ДНК гена gyrA МВТ, с целью диагностики форм туберкулеза с 
устойчивостью к фторхинолонам.
Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его 
использования как ускоренного теста лекарственной устойчивости (ЛУ) МВТ 
при исследовании материала от больного туберкулезом и назначении или 
коррекции режима химиотерапии с целью повышения вероятности 
эффективного лечения больных туберкулезом с множественной лекарственной 
устойчивостью (МЛУ ТВ) и сокращения сроков химиотерапии.
1.3 Область применения МИ ИВД
Область применения МИ ИВД -  клиническая лабораторная диагностика 
туберкулеза, научные исследования. Набор может быть использован в учре­
ждениях медицины и здравоохранения, в лабораториях медицинских организа­
ций, оказываюших специализированную медицинскую помощь по профилю 
«фтизиатрия», в научно-исследовательских лабораториях и учреждениях.


--- стр. 3 ---
2 ХАРАКТЕРИСТИКА МИ ИВД
Компоненты МИ ИВД являются одноразовыми.
Набор реагентов «Амплитуб-FQ-PB» не требует технического 
обслуживания и калибровки.
2.1 Состав МИ ИВД
Набор реагентов состоит из 4 компонентов. В комплект набора входит 
набор для проведения предварительной мультиплексной ПЦР-РВ с целью 
накопления специфического Д1Ж фрагмента гена gyrA Mycobacterium 
tuberculosis complex.
№ Состав комплекта Описание Объем Кол-во
1.
Набор реагентов «Multi-FQ» для  
проведения предварительной  
амплификации в составе:
Реакционная смесь в  
микропробирках, PC Multi -FQ
прозрачная бесцветная 
жидкость 6 мкл 100
пробирок
Положительный контрольный  
образец, ПКО-multi
прозрачная бесцветная 
жидкость 0,2 мл 1  пробирка
Отрицательный контрольный  
образец, ОКО
прозрачная бесцветная 
жидкость 0,2 мл 1  пробирка
Раствор для разведения образцов,  
ddHzO
прозрачная бесцветная 
жидкость 5 мл 4 пробирки
2.
Реакционная смесь для  
исследуемых образцов в  
стрипованных микропробирках,  
PC-FO
прозрачная жидкость 
светло-сиреневого цвета 4x6 мкл 96 стрипов
3.
Реакционная смесь, содержащая  
положительные контрольные  
образцы, IIK01-FQ
прозрачная жидкость 
светло-сиреневого цвета
4x11
мкл 12 стрипов
4.
Реакционная смесь, содержащая  
положительные контрольные  
образцы, IIK02-FQ
прозрачная жидкость 
светло-сиреневого цвета
4x11
мкл 12 стрипов
2.2 Количество анализируемых проб
Набор рассчитан на определение 96 образцов и включает 120 стрипов, 
включая контрольные образцы. Каждый стрип предназначен для анализа 1  
образца и содержит 4 пробирки с раскапанными различными концентриро­
ванными реакционными смесями, предназначенными для выявления мутаций 
в определенных кодонах гена gyrA, ответственного за устойчивость к фторхи-


--- стр. 4 ---
нолонам. Фермент ДНК-полимераза находится в крышке каждой пробирки. 
Первая пробирка каждого стрипа промаркирована.
2.3. Принцип метода
Выявление генных мутаций ДНК МВТ в определенных кодонах гена gyrA 
МВТ с помощью набора реагентов основано на использовании оригинального 
метода мультиконкурентной аллель-специфичной полимеразной цепной реак­
ции с получением результата в режиме реального времени. Метод мультиконку­
рентной аллель-специфичной ПЦР-РВ сочетает ПЦР-РВ и аллель-специфичную 
ПЦР (АС-ПЦР).
Аллель-специфичная ПЦР (АС-ПЦР) основана на том положении, что для 
эффективной ПЦР 3’-концевой нуклеотид праймера должен быть комплемента­
рен соответствующему нуклеотиду ДНК-матрицы, в противном случае эффек­
тивность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается или может отсут­
ствовать совсем. АС-ПЦР позволяет получать информацию не только о нали­
чии мутации в геномной Д1Ж, но и ее аллельном распределении.
Мультиконкурентная АС-ПЦР в реальном времени основана на конку­
рентном встраивании аллель-специфичных праймеров с различными нуклеоти­
дами на 3’-конце.
В реакционной смеси ПЦР-РВ содержатся прямой и обратный праймеры, 
гибридизационный флуоресцентный зонд, не содержащие мутаций, а также 5’- 
флуоресцентно-меченные аллель-специфичные праймеры, несущие на 3’-конце 
определенные нуклеотидные замены, и общий комплементарный аллель- 
специфичным праймерам 3’-меченный олигонуклеотид-гаситель. Каждый ал- 
лель-специфичный праймер со своей нуклеотидной заменой мечен своим флуо­
ресцентным красителем, что позволяет по мере накопления продукта реакции 
определять его присутствие в исходной ДНК по изменению флуоресценции. В 
одной пробирке одновременно можно определять до трех точек мутаций (зонд 
+ 3  аллель-специфичных праймера) по числу возможных флуорофоров, одно­
временно считываемых прибором. Если анализируемый образец не содержит


--- стр. 5 ---
мутаций, то будет идти ПЦР-РВ с прямым и обратным праймерами, не мече­
ными и не содержащими мутаций, и нарастание флуоресценции будет наблю­
даться только по флуорофору гибридизационного зонда. Если образец содер­
жит мутацию, то нарастание флуоресценции будет наблюдаться и по флуо­
рофору гибридизационного зонда, и по флуорофору 5’-флуоресцентно- 
меченного аллель-специфичного праймера, который будет встраиваться вместо 
обычного праймера, не содержащего мутаций.
Гибридизационный флуоресцентный зонд, не содержащий мутаций, 
является маркером присутствия искомого специфического фрагмента и играет 
роль внутреннего контроля, контролируя возможное ингибирование реакции в 
целом.
Постановка ПЦР-РВ осуществляется на специальных приборах, 
например, «АНК-32 (32М, 48)» (ПАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX- 
96» («BioRad», США), или эквивалентных по характеристикам (см. п. 5.1 
настоящей инструкции).
Фторхинолоны действуют путем ингибирования топоизомераз II типа. В 
микобактериях туберкулеза мишенью действия фторхинолонов является ДНК- 
гираза -  тетрамерный белок, состоящий из двух субъединиц, кодируемых 
генами gyrA и gyrB. Основные мутации, приводящие к устойчивости МВТ к 
фторхинолонам, содержатся на участке гена gyrA. Набор реагентов «Амплитуб- 
FQ-PB» определяет 6 различных наиболее часто встречаемых мутаций в 
кодонах 90, 91 и 94 гена gyrA МВТ (таблица 1  в п. 6 настоящей инструкции).
По каналу Су5 детектируется гибридизационный флуоресцентный зонд, 
определяющий наличие в образце генного локуса gyrA МВТ. По каналам FAM, 
R6G(HEX) и ROX определяется наличие мутаций гена gyrA МВТ.
Положительный результат теста означает, что исследуемый образец ДНК 
содержит мутации в генах микобактерий туберкулеза, определяющих устойчи­
вость к фторхинолонам. Отрицательный результат теста означает, что в иссле­
дуемом образце ДНК не обнаружено мутаций, определяемых данным набором.


--- стр. 6 ---
I
1
I
I
I
i
2.4 Ограничения метода
Причиной получения ложноотрицательного результата является ингиби­
рование ПЦР-РВ и/или недостаточное количество ДНК в исследуемой пробе. 
Это может быть вызвано некачественной предобработкой биологического ма­
териала и/или недостаточной эффективностью выделения Д1Ж. Поэтому, для 
экстракции ДНК и последующего ПЦР-РВ-анализа с целью обнаружения МВТ 
следует использовать наборы реагентов, содержащие контролирующие компо­
ненты, проходящие все этапы анализа. Ложноотрицательный результат выявля­
ется с помощью специфического зонда, контролирующего наличие генного ло­
куса gyrA МВТ, в котором могут содержаться мутации.
3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ 
ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Исследования аналитических характеристик набора проведены на базах 
ФГВУН НИИ ФХМ ФМВА России (г. Москва) и ЗАО Синтол (г. Москва) в 
рамках исследования эффективности набора и проведения технических 
испытаний.
3.1.1 Чувствительность
Чувствительность -  не более 2 копий ДНК в микролитре пробы 
(копий-мкл’* ).
3.1.2 Специфичность
Специфичность набора реагентов составляет 99-100%.
Специфичность положительных контрольных образцов, используемых в 
МИ ИВД и имеющих определенные замены в gyrA генном локусе МВТ, 
подтверждена методом секвенирования по Сенгеру на приборе ABI Prizm 
3130x1 с помощью набора «BigDye Seq.Kit» v.3.1. (Life Technology, США).
При проведении исследований наблюдалась полная 
внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость 
для всех положительных образцов.


--- стр. 7 ---
3.2 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Клинические исследования набора проведены на базе ФГБНУ 
«Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» (Москва).
3.2.1. Диагностическая чувствительность
Диагностическая чувствительность - при клинических испытаниях МИ 
«Амплитуб-FQ-PB» на ПО образцах диагностического материала с "истинной" 
устойчивостью к фторхинолонам был получен положительный результат на 
наличие мутаций в гене gyrA у 104 проб из 110 заведомо устойчивых (94,6%).
При клинических испытаниях МИ «Амплитуб-FQ-PB» на ПО образцах 
культур МБТ с "истинной" устойчивостью к фторхинолонам был получен 
положительный результат на наличие мутаций в гене gyrA у 104 проб из 110 
заведомо устойчивых (94,6%).
Суммарно - при клинических испытаниях МИ «Амплитуб-FQ-PB» на 220 
пробах с "истинной" устойчивостью к фторхинолонам (ПО образцов 
диагностического материала и ПО культур МБТ) был получен положительный 
результат на наличие мутаций в гене gyrA у 208 проб из 220 заведомо 
устойчивых. Диагностическая чувствительность - не менее 92,5% с 
доверительной вероятностью 90%.
3.2.2. Диагностическая специфичность
Диагностическая специфичность - при клинических испытаниях МИ 
«Амплитуб-FQ-PB» на 125 образцах диагностического материала был получен 
отрицательный результат на наличие мутаций в гене gyrA у 123 проб из 125 
заведомо чувствительных (98,4%).
При клинических испытаниях МИ «Амплитуб-FQ-PB» на 125 образцах 
культур МБТ был получен отрицательный результат на наличие мутаций в гене 
gyrA у 123 проб из 125 заведомо чувствительных (98,4%).
Суммарно - при клинических испытаниях МИ «Амплитуб-FQ-PB» на 250 
пробах с "истинной" чувствительностью к фторхинолонам (125 образцов 
диагностического материала и 125 культур МБТ) был получен отрицательный 
результат на наличие мутаций в гене gyrA у 246 проб из 250 заведомо
7


--- стр. 8 ---
чувствительных. Диагностическая специфичность - не менее 97% с 
доверительной вероятностью 90%.
Правильность определения наличия/отсутствия мутаций и специфичность 
изменения нуклеотидной последовательности подтверждена методом 
секвенирования по Сэнгеру.
При проведении исследований наблюдалась полная 
внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость 
для всех положительных образцов.
4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ
Работу проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08 (с допол­
нением СП 1.3.2518-09) «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV 
групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», 
СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обраще­
нию с медицинскими отходами», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабора­
торий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с 
материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», СП 
3.1.2.3114-13 «Профилактика туберкулеза». Приказа М3 РФ № 109 от 21 марта 
2003 г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Россий­
ской Федерации», Приказа М3 РФ № 951 от 29 декабря 2014 г. «Об утвержде­
нии методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лече­
ния туберкулеза органов дыхания».
Потенциальный риск применения МИ ИВД -  класс 3 (п. 9 приложения № 
2 к приказу Минздрава России от 06.06.2012 № 4н). Исследования материала на 
наличие микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезных 
микобактерий методом ПЦР-РВ, а также определение лекарственной 
устойчивости МБТ молекулярно-генетическими методами проводят в 
учреждениях, имеющих разрешение на работу с возбудителями III-IV группы 
патогенности. Необходимо одновременное обеспечение и соблюдение 
персоналом правил биологической безопасности и требований к организации и
8


--- стр. 9 ---
1
J
I
I
I
проведению данных работ с целью предотвращения контаминации 
нуклеиновыми кислотами исследуемых проб, помещений и оборудования.
4.1 Необходимость обучения персонала
Для работы с данным набором реагентов необходимо участие специали­
ста с высшим или средним медицинским или биологическим (ветеринарным) 
образованием, прошедшего подготовку на лицензированных курсах первичной 
специализации по работе с микроорганизмами III-IV групп патогенности, полу­
чившего дополнительное специальное образование на курсах повышения ква­
лификации по молекулярно-биологическим методам диагностики. Персонал 
должен иметь навыки работы с биохимическими реактивами и современным 
лабораторным оборудованием.
4.2 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора
Все компоненты МИ ИВД в используемых концентрациях являются не­
токсичными, вредного влияния на организм оператора не оказывают. При рабо­
те с набором следует соблюдать обычные меры предосторожности для лабора­
торий:
- пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные ха­
латы;
- не принимать пищу, пить или курить в лабораторных помещениях;
- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки 
водой с мылом.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попа­
дании на них компонентов МИ ИВД промыть большим количеством воды. При 
приеме внутрь компонентов МИ ИВД реагентов за медицинской помощью сле­
дует обратиться немедленно.
Спецификации по безопасности предоставляются по запросу.
4.3 Необходимые меры предосторожности в отношении влияния фи­
зических факторов
При использовании МИ ИВД реагентов нет необходимости принимать 
меры предосторожности в отношении влияния магнитных полей, внешних


--- стр. 10 ---
электрических воздействии, электростатических разрядов, давления или пере­
падов давления, перегрузки, источников термического воспламенения.
4.4 Необходимые меры предосторожности против специальных рис­
ков
При использовании МИ ИВД реагентов нет необходимости принимать 
меры предосторожности против любых специальных рисков при использовании 
или реализации, поскольку в состав изделия не входят вещества человеческого 
или животного происхождения с учетом их потенциальной инфекционной при­
роды.
5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ  
РАБОТЕ С НАБОРОМ
5.1 Рекомендуемое измерительное оборудование
Прибор для ПЦР-РВ -  зарегистрированный в РФ как медицинское 
изделие и имеющий каналы детекции, соответствующие красителям FAM, 
R6G(HEX), ROX, Су5 (либо их спектральным аналогам) со следующими 
характеристиками -  А а д а к с .в о зб /^ а к с .э м . (№1 -  490нм/520нм, №2 -  525нм/550нм, №3 
-  550нм/580нм, №4 -  630нм/665нм), например, «АНК-32 (32М, 48)», «CFX-96».
5.2 Указания о необходимости использования специального  
оборудования
Работу с набором следует проводить в настольном боксе с бактерицидной 
лампой (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные системы», 
г.Миасс, Россия), установленном в рабочей зоне 3 (МУ 1.3.2569-09).
5.3 Дозирующие устройства
Набор автоматических пипеток переменного объема на 10-100 мкл и 20- 
200 мкл;
штатив-карусель для данных пипеток.
5.4 Другое используемое оборудование
Микроцентрифуга-встряхиватель для микропробирок (например, 
«Циклотемп-901»);
10


--- стр. 11 ---
микроцентрифуга для стрипов (например, «Циклотемп-903»); 
штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 и 1,5 мл; 
штатив для работы со стрипами (кат. номер СТ-15, ЗАО Синтол); 
холодильник на 2-8 °С (для хранения образцов) 
морозильник на -20 °С (для хранения реактивов)
5.5 Лабораторная посуда
Емкости для сброса наконечников и микропробирок.
5.6 Материалы и реагенты, не входящие в состав МИ ИВД
одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с 
аэрозольным барьером до 200 мкл;
набор реагентов для выделения ДНК МВТ;  
набор реагентов для выявления ДНК МВТ; 
отдельный халат и одноразовые медицинские перчатки; 
комплект средств для обработки рабочего места.
одноразовые медицинские халаты и одноразовые медицинские перчатки; 
комплект средств для обработки рабочего места.
6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ МУТАЦИИ И ПРОБЫ
Кодоны и генные мутации gyrA локуса, тестируемые с помощью МИ 
ИВД, представлены в табл. 1 .
Таблица 1 .
№
проб­
ки в  
Стри­
пе
Кодоны
Мутации, определяемые в каж­
дой пробирке Красители
замена o6o3H-e мутации контрольный
зонд
1 gyrA90 Ala-ValGCG-GTG Alm5 ROX Су5
2 gyrA91 Ser-ProTCG-CCG Alm6 FAM Су5
3 gyrA94 Asp -  Asn GAC -  A AC Alml ROX Су5Asp-TyrGAC-TAC Alm4 FAM
4 gyrA94 Asp -  Gly GAC -  GGC Alm2 R6G(HEX) Су5Asp -  Ala GAC -  GCC Alm3 ROX
11


--- стр. 13 ---
7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Выявление генных мутаций ДНК МВТ, ассоциированных с устойчиво­
стью к фторхинолонам, набором «АмплиТуб-FQ-PB» включает 2 этапа:
— проведение предварительной ПЦР-РВ;
— определение генных мутаций в определенных кодонах генного локуса 
gyrA МВТ.
7.1 Постановка комплекта «Multi-FQ»
Проведение предварительной ПЦР-РВ с помощью комплекта «Multi-FQ» 
-  первый этап анализа образцов, содержащих МВТ и отобранных по количе­
ственному содержанию клеток МВТ для определения лекарственной устойчи­
вости к фторхинолонам. Предварительная амплификация проводится с целью 
накопления специфического локуса гена gyrA МВТ, ассоциированного с устой­
чивостью к фторхинолонам.
С целью предотвращения контаминации режим амплификации мульти­
плексной ПЦР-РВ специально включает только 20 циклов, когда рост флуо­
ресценции обычно еще не регистрируется прибором. Поэтому ПКО-multi явля­
ется только внешним контролем работы реагентов. Пробирку с ПКО-multi по­
сле окончания реакции амплификации утилизируют.
Для проведения ПЦР-РВ «Multi-FQ»:
—  Отбирают необходимое количество пробирок с реакционной смесью PC 
Multi-FQ для амплификации из расчета N+2, где N - количество исследу­
емых образцов.
— После размораживания пробирки с реакционной смесью, PC Multi-FQ,  
центрифугируют в течение 30 секунд при 3000 об-мин’’  на микроцентри­
фуге с использованием ротора для пробирок 0,2 мл для сброса фермента с 
крышек пробирок.
— Помещают пробирки с реакционной смесью, PC Multi-FQ, в штатив и 
маркируют в соответствии с протоколом исследования на боковой стенке 
пробирки.
13


--- стр. 14 ---
—  Используя наконечники с аэрозольным барьером, последовательно вно­
сят в микропробирки согласно их маркировке по 19 мкл ОКО и исследу­
емых образцов, закрывают крышки данных микропробирок.
—  Вносят в микропробирку с маркировкой ГЖО 19 мкл ПКО-Multi, закры­
вают крышку микропробирки.
—  Перемешивают еодержимое микропробирок на микроцентрифуге- 
встряхивателе и центрифугируют 10-30 секунд при 3000 об-мин'*. Поме­
щают микропробирки в прибор для ПЦР-РВ и прикатывают крышки мик­
ропробирок.
— Включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией 
по эксплуатации. Согласно таблице 2 в диалоговом интерфейсе програм­
мы прибора задают параметры температурно-временного режима ПЦР- 
РВ и используемый краситель ROX.
Таблица 2
№ п/п Температурно-временной режим Регистрация
сигнала Число циклов
1 95 °С -  300 секунд — 1
2 62 °С -  40 секунд ROX
203 95 °С -  20 секунд —
Вводят сведения об образцах (при использовании прибора «АНК-32 
(32М, 48)» или «СРХ96» ввод сведений об образцах возможен после за­
пуска программы амплификации), закрывают крышку прибора, запуска­
ют реакцию ПЦР-РВ и фиксируют в рабочем журнале название файла с 
результатом работы прибора; расчетное время анализа составляет около 1  
часа.
■  По окончании реакции микропробирки с ПКО-muIti и ОКО утилизиру­
ют, а амплификаты исследуемых образцов разводят в 9 раз раствором для 
разведения образцов или деионизированной водой (200 мкл раствора на 
один образец). Содержимое микропробирок кратковременно перемеши­
вают на вортексе и центрифугируют 10-30 секунд при 3000 об-мин'*. Раз-
14


--- стр. 15 ---
I
бавленные амплификаты образцов являются исходными образцами для 
следующего этапа анализа при определении мутаций.
Учет результатов ПЦР-РВ «Multi-FQ».
Оценку результатов предварительной амплификации проводят с помо­
щью программного обеспечения (ПО) приборов для ПЦР-РВ, например, «АНК- 
32 (32М, 48)», «CFX-96» или эквивалентных им (см. п. 5.1 настоящей инструк­
ции). Критерием регистрации роста сигнала флуоресценции (наличие кинети­
ческой кривой роста сигнала флуоресценции) в ПО приборов является величина 
порогового цикла Ct, которая означает любую величину менее 20. Отсутствие 
регистрации роста сигнала прибором описывается ПО прибора, например, как 
предельная величина порогового цикла (Ct > 20 в приборах «А1Ж»), либо как 
ее отсутствие (N/A в приборах фирмы «BioRad») и т.п. Подробная информация 
приведена в руководстве по эксплуатации конкретного прибора.
Для всех исследуемых образцов рост сигнала флуоресценции после реак­
ции предварительной амплификации «Multi-FQ» не регистрируется, т.е. вели­
чина порогового цикла Ct > 20 или N/A. Достоверность предварительной ам­
плификации «Multi-FQ» оценивают по результату амплификации ПКО-multi и 
ОКО.
Результаты «Multi-FQ» являются недостоверными:
—  в случае отсутствия регистрации прибором роста сигнала в пробирке ПКО- 
multi по каналу ROX (ложноотрицательный результат);
— в случае регистрации прибором роста сигнала в пробирке ОКО по каналу 
ROX с величиной порогового цикла Ct < 20.
Результаты «Multi-FQ» являются достоверными:
— в случае регистрации прибором роста сигнала в пробирке ПКО-multi по 
каналу ROX с величиной порогового цикла Ct < 16;
— в случае отсутствия регистрации прибором роста сигнала в пробирке ОКО 
по каналу ROX с величиной порогового цикла Ct > 20 (N/A);
Если результаты реакции «Multi-FQ» по ПКО-multi и ОКО при первой 
постановке были достоверными, то в дальнейшем при использовании вскрыто-
15


--- стр. 17 ---
[
I
*
1
J
il
I
I
\
I
j
1
I
После размораживания пробирки с реакционной смесью центрифугируют 
30 секунд при 3000 об-мин’’  на микроцентрифуге с использованием рото­
ра для стрипованных пробирок 0,2 мл для сброса фермента с крышек 
пробирок.
Помещают стрипы с реакционной смесью в штатив в соответствии с мар­
кировкой 1-ой пробирки. Маркируют стрипы в соответствии с протоко­
лом исследования.
■Исследуемые образцы (разведенные амплификаты) после проведения 
предварительной реакции «Multi-FQ» перемешивают на микроцентрифу- 
ге-встряхивателе и центрифугируют 3-5 секунд при 3000 об-мин'* на мик­
роцентрифуге для сброса капель.
■  Вносят в микропробирки контрольного стрипа (на стенку каждой про­
бирки) по 14 мкл деионизированной воды, используя наконечники с 
аэрозольным барьером.
-  Вносят образцы в стрипы с реакционной смесью для исследуемых образ­
цов из расчета 1 стрип -  1 образец. Один исследуемый образец вносится 
в каждую пробирку стрипа (на стенку пробирки) по 19 мкл, начиная с 1-й 
промаркированной пробирки.
-Содержимое стрипованных пробирок кратковременно перемешивают на 
микроцентрифуге-встряхивателе и центрифугируют 10-30 секунд при 
3000 об-мин'' на микроцентрифуге с использованием ротора для стрипо­
ванных пробирок 0,2 мл.
- Помещают микропробирки в прибор для ПЦР-РВ в соответствии с реко­
мендуемым порядком установки в прибор (рис. 1) и прикатывают крыш­
ки микропробирок.
к 1 2 3 4 5 6 7
к 1 2 3 4 5 6 7
к 1 2 3 4 5 6 7
к 1 2 3 4 5 6 7
АНК-32
17


--- стр. 18 ---
I
(
i
1
к 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 20 2 2
к 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2
к 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 20 22
к 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 20 2 2
1 3 5 7 9 1 1 1 3 1 5 1 7 1 9 2 1 2 3
1 3 5 7 9 1 1 1 3 1 5 1 7 1 9 2 1 2 3
1 3 5 7 9 1 1 1 3 1 5 1 7 1 9 2 1 2 3
1 3 5 7 9 1 1 1 3 1 5 1 7 1 9 2 1 2 3
CFX-96
Рисунок 1. Порядок расположения стрипованных микропробирок в ам-  
плификаторах: К -  контрольный стрип; 1,2,3...-  стрипы с образцами.
—  Включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией 
по эксплуатации. Согласно таблице 4 в диалоговом интерфейсе програм­
мы прибора задают параметры температурно-временного режима ПЦР- 
РВ и вводят красители FAM, R6G(HEX), ROX и Су5.
Таблица 4
№ п/п Температурно-временной режим
Регистрация
сигнала
Число циклов
1 95 °С -  300 секунд — 1
2 95 °С -  20 секунд
3 67 °С -  20 секунд 40
4 65 °С -  30 секунд
FAM, R6G(HEX),  
ROX,Cy5
—  Вводят сведения об образцах (при использовании прибора «А1Ж-32 
(32М, 48)» или «СРХ96» ввод сведений об образцах возможен после за­
пуска программы амплификации), закрывают крышку прибора, запуска­
ют реакцию ПЦР-РВ и фиксируют в рабочем журнале название файла с 
результатом работы прибора; расчетное время анализа составляет около 2 
часов.
7.2.3 Процедура измерения результатов анализа
Оценку результатов проводят с помощью ПО приборов для ПЦР-РВ, 
например, «АНК-32 (32М, 48)», «CFX-96» или эквивалентных им (см. п. 5.1 
настоящей инструкции). Критерием регистрации роста сигнала флуоресценции 
(наличие кинетической кривой роста сигнала флуоресценции) в ПО приборов
18


--- стр. 19 ---
I
I
i
является величина порогового цикла Ct, которая означает любую величину ме­
нее 40. Отсутствие регистрации роста сигнала прибором описывается ПО при­
бора, например, как предельная величина порогового цикла (Ct > 40 в приборах 
«АПК»), либо как ее отсутствие (N/A в приборах фирмы «BioRad») и т.п. По­
дробная информация приведена в руководстве по эксплуатации конкретного 
прибора.
Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналу Су5 в слу­
чае отсутствия роста сигнала по каналам FAM, R6G(HEX) и ROX свидетель­
ствует о наличии специфического фрагмента гена gyrA ДНК МВТ и отсутствии 
определяемых в данной микропробирке мутаций, при этом пороговый цикл Ct 
должен быть менее 32,0.
Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналам FAM или 
R6G(HEX), или ROX одновременно с наличием роста сигнала по каналу Су5 
свидетельствует о наличии генной мутации в определенном кодоне gyrA локуса 
ДНК МВТ в данной микропробирке. При этом разница (ACt) между пороговым 
циклом для канала Су5 (Ct Су5) и пороговым циклом для каналов FAM (Ct 
FAM), или R6G(HEX) (Ct R6G(HEX)), или ROX (Ct ROX) должна быть не бо­
лее 5.
7.2.4 Учет результатов анализа
Результаты анализа не подлежат учету:
— в случае отсутствия регистрации прибором роста сигнала в пробирках с 
nKOl-FQ или nK02”FQ по одному из каналов на мутации FA1M, или 
R6G(HEX), или ROX (ложноотрицательный результат) (красители, опреде­
ляющие мутации в каждой пробирке контрольного стрипа, см. в таблице 3, 
п.7.2.1 настоящей инструкции);
— в случае отсутствия регистрации прибором роста сигнала по каналу Су5 
пробирках с IIK01-FQ или IIK02-FQ (недостоверный результат в конкрет­
ной микропробирке ПКО);
— в случае регистрации прибором роста сигнала по каналу Су5 с величиной 
порогового цикла Ct>32,0 или отсутствия регистрации роста сигнала по ка­
19


--- стр. 24 ---
I
L
L I
в  случае получения недостоверного результата в какой-либо пробирке 
стрипа для исследуемого образца (Ctcy5^32,0) весь анализ для этого образца 
считается недостоверным. В этом случае необходимо проверить концентрацию 
Д1Ж МВТ в исходном образце и возможное наличие ингибиторов (по ПЦР-РВ 
на обнаружение и количественный анализ МВТ с помощью наборов реагентов, 
зарегистрированных в РФ). Если образец ДНК соответствует критериям анали­
зируемой пробы для данного МИ ИВД, то необходимо повторить весь анализ, 
начиная с этапа проведения предварительной ПЦР-РВ с помощью комплекта 
«Multi-FQ».
8 РАСЧЕТЫ
8.1 Используемые компьютерные программы
Для проведения ПЦР-РВ и оценки её результатов используют специали­
зированное программное обеспечение, поставляемое производителем прибора, 
например программа А1Ж_8Ье11 версия 60 и выше, поставляемая с приборами 
«АНК-32М», «АНК-48» или Bio-Rad СЕХ Manager 2.0 и выше, поставляемая с 
прибором CFX-96. Работу с программным обеспечением осуществляют соглас­
но руководству по эксплуатации прибора.
9 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУА­
ТАЦИИ МИ ИВД
9.1 Условия хранения МИ ИВД
В соответствии с ТУ 9398-003-46395995-2015 -  в сухом, защищенном от 
света месте при температуре от минус 18 до минус 20 °С. Суммарный срок хра­
нения при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С не должен превышать 5  суток в 
течение срока годности набора реагентов.
25


--- стр. 25 ---
I
1
ц
9.2 Условия транспортирования МИ ИВД
Транспортирование МИ ИВД «Амплитуб-FQ-PB» должно производиться 
в соответствии с ТУ 9398-003-46395995-2015 крытым транспортом (автомо­
бильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от минус 18 до 
минус 20 °С. Допускается транспортирование до 5 суток при температуре до 
плюс 8 °С.
9.3 Срок годности МИ ИВД
Срок годности м и  ИВД составляет 9 месяцев с даты выпуска предприяти- 
ем-изготовителем. Серии наборов реагентов с истекшим сроком годности при­
менению не подлежат. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку 
годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструк­
ции не указано иное.
9.4 Информация по безопасной утилизации
Использованные пробирки с ампликонами, наконечники, перчатки, ве­
тошь для обработки поверхностей в ПЦР-боксе, собирают в пластиковые за­
крывающиеся емкости, выносят в рабочую зону 4-1 (либо специально предна­
значенное вспомогательное помещение) с целью последующей инактивации 
(МУ 1.3.2569-09).
Наборы с истекшим сроком годности, а также в случае повреждения упа­
ковки, утилизируют по классу А, как эпидемиологически безопасные отходы, 
по составу приближенные к ТБО (СанПиН 2.1.7.2790-10).
9.5 Гарантийные обязательства производителя
Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных 
характеристик МИ ИВД требованиям, указанным в технической и эксплуатаци­
онной документации, в течение установленного срока годности (9 месяцев) при 
соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество МИ ИВД «Амплитуб-FQ-PB» направлять на 
предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» (127550, г. Москва, ул. Тимирязев­
ская, 42, тел. (495)984-69-93, факс. (499)977-74-55 
E.mail: 
svntol@svntol.ru).
26


--- стр. 26 ---
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по при­
менению МИ ИВД, нежелательных реакций при его использовании, фактов и 
обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских 
работников при применении МИ ИВД реагентов, рекомендуется направить со­
общение на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» по адресу, указанному 
выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию в 
соответствии с действующим законодательством.
СОГЛАСОВАНО:
Директор Федерального государ­
ственного бюджетного научного
учреждения Це 
беркулеза
|шый НИИ ту-
«14»__д
УТВЕРЖДАЮ:
Научный директор ЗАО «Синтол»
27