Набор реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя брюшного тифа методом фрагментного анализа (ОМ-Брюшной тиф-Генотип) по ТУ 9398-019-46395995-2013 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДЕНА
Приказом Росздравнадзора
от №
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор
А.Кузубов
ИНСТРУКЦИЯ
по применению «Набора реагентов для генетического типирования
штаммов возбудителя брюшного тифа методом фрагментного анализа
(ОМ-Брюшной тиф-Генотип)» по ТУ 9398-019-46395995-2013
2016
--- стр. 2 ---
1 НАЗНАЧЕНИЕ
1.1 Полное название набора
«Набор реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя
брюшного тифа методом фрагментного анализа (ОМ-Брюшной тиф-Генотип)»
по ТУ 9398-019-46395995-2013.
1.2 Предназначение набора и его диагностическая роль
Набор реагентов «ОМ-Брюшной тиф-Г енотип» предназначен для
генетического типирования бактериальных культур возбудителя брюшного
тифа {Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi), выделенных в ходе
микробиологических исследований клинического материала и проб из объектов
внешней среды для выявления их индивидуальных генетических
характеристик, обнаружения генетических связей между ними и с ранее
идентифицированными штаммами тифозного микроба.
Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его
использования в поддержке постановки эпидемиологического диагноза при
исследовании бактериальных культур Salmonella enterica подвид enterica
серотип typhi, выделенных из материала от больного (подозрительного на
заболевание); для определения генотипа брюшнотифозных изолятов из
объектов окружаюш;ей среды; в качестве теста генетического типирования
коллекционных штаммов Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi.
1.3 Область применения набора
Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика
брюшного тифа, эпидемиологические расследования и мониторинг,
идентификация патогенных биологических агентов, научные исследования.
Набор может быть использован в учреждениях медицины и здравоохранения, в
лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии и противочумных
учреждениях Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах, а также в
стационарных и мобильных лабораториях специализированных учреждений
других министерств и ведомств, в том числе Министерства обороны.
--- стр. 3 ---
2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
Компоненты набора являются одноразовыми.
Набор реагентов «ОМ-Брюшной тиф-Генотип» не требует технического
обслуживания и калибровки.
2.1 Состав набора
Набор реагентов состоит из 7 реагентов.
№ Состав набора Описание Объем/
кол-во Кол-во
1. Реакционная смесь в стрипованных
микропробирках, РС-БТ-Генотип1
сухое вещество розового
цвета 1 мг 48
пробирок
2. Реакционная смесь в стрипованных
микропробирках, РС-БТ-Генотип2
сухое вещество розового
цвета 1 мг 48
пробирок
3. Реакционная смесь в стрипованных
микропробирках, РС-БТ-ГенотипЗ
сухое вещество розового
цвета 1 мг 48
пробирок
4. Разбавитель, РБ-Генотип прозрачная бесцветная
жидкость 1,0 мл 4 пробирки
5. Положительный контрольный
образец, ПКО-БТ-Генотип
сухое вещество белого
цвета 2 мг 4 пробирки
6. Раствор для разбавления
ПКО-БТ-Генотип, ОКО
прозрачная бесцветная
жидкость 1,5 мл 3 пробирки
7. ТЕ-буфер, ТЕ прозрачная
бесцветная жидкость 15 мл 1 флакон
Реакционные смеси в стрипованных микропробирках (лиофилизованные),
РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ, каждая расфасована в сорок восемь
микропробирок (шесть стрипов) объемом 0,2 мл и упакована в непрозрачный
полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 9x12 см. Все реакционные смеси в
пакетах упакованы в один полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 15x20 см.
Состав каждой реакционной смеси: эквимолярная смесь
дезоксинуклеозидтрифосфатов, четыре пары соответствуюш,их флуоресцентно
меченых олигонуклеотидов, фермент Taq ДНК-полимераза, трегалоза.
Разбавитель, РБ-Генотип, расфасован в четыре пробирки из
полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающимися крышками, упакованных
в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6x7 см, состав: ПЦР-буфер, хлорид
магния, глицерол, вода для ПЦР.
Положительный контрольный образец (лиофилизованный), ПКО-БТ-
Генотип, расфасован в четыре пробирки из полипропилена объемом 0,5 мл с
завинчивающимися крышками, упакованных в полиэтиленовый пакет Zip-Lock
--- стр. 4 ---
размером 4x7 см, состав: смесь 12-ти рекомбинантных плазмид pGem-T, каждая
из которых содержит встроенную специфическую последовательность
соответствующего полиморфного локуса генома Salmonella enterica подвид
enterica серотип typhi с известным количеством нуклеотидных повторов:
TR4699, TR4500, Sal23, STTR8, Sal20, STTR5, STTR7, TR3, Sal2, TR5, Sal6,
TRl.
Раствор для разбавления ГЖО-БТ-Генотип, ОКО, расфасован в три
пробирки из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающимися крышками,
упакованные в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6x7 см, состав: ТЕ-
буфер.
ТЕ-буфер, ТЕ, расфасован во флакон из полипропилена объемом 15 мл с
завинчивающейся крышкой, упакованный в полиэтиленовый пакет Zip-Lock
размером 6x10 см, состав: ТЕ-буфер.
Примечание: ингредиентами, которые могут влиять на измерения,
являются флуоресцентно-меченые праймеры, основной характеристикой
которых для конечного пользователя является температура отжига Та,
составляющая 60 °С. Данная характеристика реализуется с помощью
температурно-временного режима амплификации, следовательно, его
соблюдение является строго обязательным.
2.2 Количество анализируемых проб
Набор реагентов рассчитан на 48 определений, включая контрольные
образцы.
2.3 Метод исследования
Генетическое типирование щтаммов возбудителя брюшного тифа
основано на использовании метода мультилокусного анализа вариабельных
тандемных повторов (MLVA - от Multi Loci VNTR Analysis). Размер
фрагментов определяется методом капиллярного гель-электрофореза с лазер-
индуцированной флуоресцентной детекцией продуктов мультиплексной
полимеразной цепной реакции с флуоресцентно-мечеными праймерами,
специфичными в отношении 12-ти наиболее информативных VNTR-локусов
генома Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi, относительно
размерного стандарта с известными длинами фрагментов ДНК.
--- стр. 5 ---
VNTR-локусы - полиморфные участки генома микроорганизмов, которые
содержат определенные повторяюгциеся последовательности нуклеотидов, или
так называемые вариабельные тандемные повторы (variable number tandem
repeats, VNTR). Разные штаммы микроорганизмов внутри вида могут
отличаться по количеству повторов в одном либо нескольких VNTR-локусах.
При проведении генетического типирования анализируют несколько локусов
генома, обладаюгцих наибольшей вариабельностью количества нуклеотидных
повторов у штаммов исследуемого вида микроорганизма.
Г енетическое типирование методом фрагментного анализа
осуществляется в два этапа.
На первом этапе проводят амплификацию 12-ти VNTR-локусов генома
Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi с помощью полимеразной
цепной реакции (ПЦР). Амплификацию проводят в трех микропробирках, в
каждой реакционной пробирке проходит одновременно четыре разных реакции
(мультиплексная ПЦР), в ходе которых происходит синтез до копий
каждого из анализируемых фрагментов ДНК. Праймеры в каждой
мультиплексной ПЦР (один из каждой пары) химически связаны с четырьмя
флуоресцентными красителями, детектируемыми в каналах ТАМ, R6G,
TAMRA, ROX генетического анализатора. Таким образом, в ПЦР
синтезируются флуоресцентно-меченые фрагменты ДНК. Постановка ПЦР
осуществляется на приборах для ПЦР или ПЦР в реальном времени, например,
GeneAmp 2700 (Thermo Scientific - Life Technologies, США), А1Ж-32 (32M, 48)
(ПАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия) или эквивалентных по
характеристикам.
На втором этапе проводят фрагментный анализ продуктов ПЦР методом
капиллярного электрофореза с использованием автоматических генетических
анализаторов с лазер-индуцированной флуоресцентной детекцией, например,
«Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-2013, с
принадлежностями» (ПАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), ABI PRISM®
310/3100/3 lOOAvant/3130/3130х//3500/3500х/ (Thermo Scientific - Life
Technologies, CILIA) или эквивалентных по характеристикам (см. п. 5.1
настоящей инструкции). Продукты амплификации разводят 1:10, затем 1 мкл
--- стр. 6 ---
разведения добавляют к смеси, содержащей 10 мкл раствора деионизованного
формамида (Ш-DF’^ Formamide, Thermo Scientific - Life Technologies, США) и
0,5 мкл раствора размерного стандарта ДНК, представляющего собой смесь
фрагментов ДНК известной длины (GeneScan'^’^ 600 LIZ® Size Standard, Thermo
Scientific - Life Technologies, CUIA) (формамид и размерный стандарт в состав
набора реагентов ОМ-Брюшной тиф-Генотип не входят). Полученные смеси
денатурируют при 95 °С в течение 300 секунд и анализируют на генетических
анализаторах «Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-
2013, с принадлежностями»или ABI PRISM®
310/3100/3100AvanL3130/3130x//3500/3500x/ в капиллярах длиной 35 или 50
сантиметров, заполненных гелем на основе полидиметилакриламида, например,
ПДМА-6 (ЗАО «Синтол», г. Москва, Россия) или РОР-4/РОР6/РОР7 (Thermo
Scientific - Life Technologies, США). Электрокинетическое нанесение продуктов
амплификации и размерного стандарта в капилляры проводят при 1 кВ в
течение 20 сек. Гель-электрофоретическое разделение проводят при 15 кВ и
температуре капилляров 60 °С в течение 40 - 60 мин, в зависимости от длины
капилляров и типа геля. Анализ длины продуктов амплификации осуществляют
с использованием программы «Фрагментный анализ ДНК» для данных,
полученных на приборе «Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-
04699534-2013, с принадлежностями», и GeneMapper для приборов
«Устройство секвенирования ДЖ по ТУ 9443-005-04699534-2013, с
принадлежностями» и Thermo Scientific - Life Technologies, США. Значения
длины продуктов амплификации приписываются программой прибора
относительно размерного стандарта ДНК GeneScan’’^'^ 600 LIZ® Size Standard*,
включаемого в каждую пробирку капиллярного электрофореза.
*Размерный стандарт GeneScan'^''^ 600 LIZ® Size Standard является коммерческим
продуктом. Информацию по метрологической прослеживаемости значений, приписанных
данному стандарту, в том числе по применимым референтным материалам и/или
референтным процедурам измерений более высокого порядка, можно получить у
официальных представителей производителя (Thermo Scientific - Life Technologies, USA) в
РФ.
6
--- стр. 7 ---
Результатом анализа является индивидуальный генетический профиль
исследуемой бактериальной культуры (штамма) Salmonella enterica подвид
enterica серотип typhi, представляющий собой совокупность размеров 12-ти
VNTR-локусов с известным количеством тандемных повторов в каждом локусе.
2.4 Ограничения метода
Набор реагентов «ОМ-Брюшной тиф-Генотип» обеспечивает
внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя брюшного тифа при
содержании ДНК микроорганизма в исследуемом образце в концентрации от
0,01 до 1,0 нг мкл-1
3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1.1 Аналитическая специфичность
Специфичность видовая - ложноположительные и ложноотрицательные
результаты при анализе образцов ДНК Salmonella enterica подвид enterica
серотип typhi (3 заведомо положительных образца), а также ДНК
гетерологичных видов Salmonella gallinarum 24 КСТ, Salmonella gallinarum 5 72,
Salmonella gallinarum 665, Salmonella enteritidis 204, Salmonella enteritidis 232,
Salmonella enteritidis 11272, Salmonella paratyphi A225, Salmonella virchow 06,
Salmonella virchow БО 25-3, Salmonella virchow MO 26-7, Salmonella inf antis КО
38-2 (11 заведомо отрицательных образцов) отсутствовали.
Специфичность штаммовая (внутривидовая дифференциация штаммов
возбудителя брюшного тифа) - при анализе образцов ДНК, выделенных из 21
штамма Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi различного
происхождения, каждый из которых заведомо имеет уникальный генетический
профиль по 12-ти VNTR-локусам, ложные причисления отсутствовали. В
каждом случае был выявлен генетический профиль, соответствующий
конкретному штамму тифозного микроба.
7
--- стр. 8 ---
3.1.2 Воспроизводимость
Воспроизводимость - при исследовании ДНК штамма 4446 Salmonella
enterica подвид enterica серотип typhi в 30 повторах получено полное
совпадение результатов по каждому локусу, следовательно, согласно таблицам
Генеса, воспроизводимость анализа составляет 97 %.
3.2 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.2.1 Вероятность ложных причислений
Вероятность ложных причислений - при анализе образцов ДНК
28 штаммов Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi, выделенных из
различных источников и имеюш,их различный генетический профиль,
подтвержденный для каждого образца результатами секвенирования всех
12 VNTR-локусов, ложных причислений выявлено не было. В каждом случае
был получен индивидуальный генетический профиль с количеством тандемных
повторов для каждого локуса полностью совпадающий с установленным путем
секвенирования. Вероятность ложных причислений - не более 2 % с
доверительной вероятностью 90 %.
4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ
Работу проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.2322-08
«Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней», МУ 1.3.2569-09
«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-
IV групп патогенности», СП 3.1.1.2137-06 «Профилактика брюшного тифа и
паратифов», методических рекомендаций «Бактериологическая диагностика
брюшного тифа и паратифов А, В и С» (утв. Роспотребнадзором 29.12.2007
МУ 0100/13745-07-34).
Подготовку микропробирок для спектральной калибровки генетического
анализатора, а также плашки с образцами для анализа на генетическом
анализаторе проводят под вытяжкой для улавливания паров формамида.
8
--- стр. 9 ---
Потенциальный риск применения набора - класс 3 (п. 9 приложения № 2
к приказу Минздрава России от 06.06.2012 № 4н).
4.1 Необходимость обучения персонала
Для выполнения анализа с помощью данного набора реагентов
необходимо участие специалиста с высшим медицинским образованием,
прошедшего обучение на лицензированных курсах специализации по работе с
ПБА III-IV групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также лаборанта со
средним специальным медицинским образованием. Персонал должен иметь
навыки работы с биохимическими реактивами и современным лабораторным
оборудованием.
4.2 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются
нетоксичными, вредного влияния на организм оператора не оказывают. При
работе с набором следует соблюдать обычные меры предосторожности для
лабораторий:
- пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные
халаты;
- не принимать пишу, пить или курить в лабораторных помещениях;
- после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки
водой с мылом.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при
попадании на них компонентов набора промыть большим количеством воды.
При приеме внутрь компонентов набора реагентов за медицинской помощью
следует обратиться немедленно.
--- стр. 10 ---
4.3 Необходимые меры предосторожности в отношении влияния
физических факторов
При использовании набора реагентов нет необходимости принимать
меры предосторожности в отношении влияния магнитных полей, внешних
электрических воздействий, электростатических разрядов, давления или
перепадов давления, перегрузки, источников термического воспламенения.
4.4 Необходимые меры предосторожности против специальных рисков
При использовании набора реагентов нет необходимости принимать меры
предосторожности против любых специальных рисков при использовании или
реализации, поскольку в состав изделия не входят вещества человеческого или
животного происхождения с учетом их потенциальной инфекционной природы.
5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ
РАБОТЕ С НАБОРОМ
5.1 Рекомендуемое измерительное оборудование
Г енетический анализатор на основе метода капиллярного гель-
электрофореза с детекцией флуоресценции индуцируемой лазером и имеющий
каналы детекции, соответствующие красителям РАМ, R6G, TAMRA, ROX, LIZ
(либо их спектральным аналогам) со следующими характеристиками -
^акс.возб/^акс.эм. (№1 - 490нм/520нм, №2 - 525нм/550нм, №3 - 550нм/580нм,
№4- 580нм/610нм, №5 - 630нм/665нм), например, «Устройство
секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-2013, с принадлежностями»,
«Анализатор генетический Applied Biosystems 3500 Dx, с принадлежностями».
5.2 Указания о необходимости использования специального
оборудования
Работу с набором следует проводить в настольных боксах с
бактерицидной лампой (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные
системы», г. Миасс, Россия), установленных в рабочей зоне 3 для проведения
ПЦР и 4-1 для проведения непосредственно генетического анализа
(МУ 1.3.2569-09).
10
--- стр. 11 ---
5.3 Дозирующие устройства
Набор автоматических пипеток переменного объема на 0,5-10 мкл,
2-20 мкл, 10-100 мкл и на 20-200 мкл;
штатив-карусель для данных пипеток.
5.4 Другое используемое оборудование
Микроцентрифуга-вортекс (например, «Циклотемп-901»);
микроцентрифуга для стрипованных микропробирок объемом 0,2 мл
(например, «Циклотемп-903»);
прибор для ПЦР или ПЦР-РВ с блоком под пробирки 0,2 мкл (например,
GeneAmp 2700, «АНК-32 (32М, 48)»);
приспособление для прижатия крышек микропробирок «Амплипресс»
(кат. номер СТ-14, ЗАО «Синтол»);
спектрофотометр (например, NanoDrop 8000 «Scientific»);
холодильник на 2 - 8°С с морозильной камерой на минус 20°С;
штативы для наконечников, микропробирок объемом 0,5 и 1,5 мл;
штатив для работы со стрипованными микропробирками объемом 0,2 мл
(кат. номер СТ-15, ЗАО «Синтол»).
5.5 Лабораторная посуда
Емкости для сброса наконечников и микропробирок.
5.6 Материалы и реагенты, не входящие в состав набора
Г ель ПДМА-6 (кат. номер ПДМА-6, ЗАО «Синтол»);
деионизованный формамид HI-DI™ Formamide (кат. номер 4311320
Thermo Scientific - Life Technologies);
размерный стандарт GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard (кат. номер
4379950 Thermo Scientific - Life Technologies);
комплект средств для обработки рабочего места;
набор реагентов для выделения ДНК;
одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с
аэрозольным барьером до 10 мкл;
11
--- стр. 14 ---
II
J
J
7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
7.1 Процедура приготовления контрольного образца
В пробирку с сухим содержимым ПКО-БТ-Генотип добавляют 200 мкл
ОКО, перемешивают на вортексе до полного раетворения, центрифугируют
5 секунд при 3000 об.-мин'\ Хранение разведенных препаратов ПКО-БТ-
Генотип допускается при температуре не выше минус 20 °С не более месяца.
7.2 Разведение препарата ДНК
Для амплификации полиморфных локусов генома Salmonella enterica
подвид enterica серотип typhi в каждую реакционную смесь (РС-БТ-Генотип1
- РС-БТ-ГенотипЗ) вносят по 5 мкл препарата ДНК, при этом количество ДНК
в пробе, вносимой в реакционную смесь, должно составлять от 0,05 до 5,0 нг.
Концентрацию ДНК в каждом препарате измеряют
спектрофотометрически и в случае необходимости разводят с помощью ТЕ-
буфера до 0,01 - 1,0 нг-мкл'\
7.3. Проведение ПЦР
Расход каждого реагента
Для исследования методом фрагментного анализа продуктов
амплификации VNTR-локусов одного штамма (изолята) Salmonella enterica
подвид enterica серотип typhi из состава Набора реагентов «ОМ-Брюшной тиф-
Генотип» требуется:
для ОКО - 3 микропробирки, по одной с каждой реакционной смесью
(РС-БТ-Генотип! — РС-БТ-ГенотипЗ);
для ПКО-БТ-Генотип - 3 микропробирки, по одной с каждой
реакционной смесью (РС-БТ-Генотип! - РС-БТ-ГенотипЗ);
для исследуемого образца - 3 микропробирки, по одной с каждой
реакционной смесью (РС-БТ-Генотип! - РС-БТ-ГенотипЗ).
Соответственно для исследования N изолятов (штаммов) возбудителя
брюшного тифа требуется N+2 пробирок с каждой реакционной смесью (РС-
БТ-Генотип! - РС-БТ-ГенотипЗ), где N - количество исследуемых
14
--- стр. 15 ---
микробных культур Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi, 2 —
количество контролей (ПКО-БТ-Генотип и ОКО).
На каждый анализ расходуется:
- 15 мкл ПКО-БТ-Генотип;
- 15 мкл ОКО.
7.3.1 Последовательность проведения этапов анализа
Анализ с помощью набора реагентов проводится в два этапа:
- проведение ПЦР;
- проведение фрагментного анализа.
7.3.1.1 Проведение ПЦР
- включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией
по эксплуатации;
- вводят согласно таблице 1 в диалоговый интерфейс программы
амплификатора параметры температурно-временного режима;
Таблица 1 - Температурно-временной режим амплификации
№
п/п Температурно-временной режим Число циклов
1 95 °С - 300 секунд 1
2 60 °С - 40 секунд 353 95 °С - 15 секунд
-набор реагентов извлекают из холодильника, РБ-Генотип и ПКО-БТ-
Генотип перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 секунд при
3000 об.-мин'*;
- отбирают необходимое количество микропробирок с реакционными
смесями РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ равное количеству образцов
плюс две для контролей (ПКО-БТ-Генотип и ОКО) (при необходимости
разрезают стрипованные микропробирки) и устанавливают в штатив (например,
СТ-15, ЗАО «Синтол»);
- открывают крышки микропробирок с реакционными смесями РС-БТ-
Генотип! - РС-БТ-ГенотипЗ и вносят в них по 20 мкл РБ-Генотип;
15
--- стр. 16 ---
- используя наконечники с аэрозольным барьером, последовательно
вносят в микропробирки РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ по 5 мкл ОКО,
а затем по 5 мкл растворов исследуемых образцов, закрывают крышки
микропробирок;
- вносят в микропробирки в соответствии с маркировкой по 5 мкл ПКО-
БТ-Генотип, закрывают крышки микропробирок;
- перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и
центрифугируют 5 секунд при 3000 об.-мин'\ Помеш,ают микропробирки в
прибор для ПЦР (ПЦР-РВ) и прижимают крышки микропробирок (например, с
помощью приспособления «Амплипресс» СТ-14, ЗАО «Синтол»).
- закрывают крышку прибора, запускают реакцию ПЦР и фиксируют в
рабочем журнале название файла (время реакции составляет около 1 часа).
7.3.1.2 Проведение фрагментного анализа
7.3.1.2.1 Спектральная калибровка генетического анализатора
Для корректного анализа флуоресцентно-меченых продуктов
амплификации VNTR-локусов генома Salmonella enterica подвид enterica
серотип typhi проводят спектральную калибровку генетического анализатора
«Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-2013, с
принадлежностями» или ABI PRISM®
310/3100/3 lOOAvant/3130/3130х//3500/3500х/ с помощью спектрального
калибратора СК-5-ЕТ (ЗАО «Синтол», Россия) (не входит в состав набора «ОМ-
Брюшной тиф-Генотип»):
- для приготовления рабочего раствора спектрального калибратора СК-5-
ЕТ добавляют 15 мкл деионизованной воды в пробирку, содержащую
лиофилизированный СК-5-ЕТ (пробирка с бесцветной крышкой) и инкубируют
при комнатной температуре в течение 2 мин, после чего тщательно
перемешивают раствор на вортексе и осаждают на дне пробирки
центрифугированием (допускается хранение раствора в темном месте при
температуре минус 20 °С в течение года);
16
--- стр. 17 ---
-для калибровки 8-ми капиллярного генетического анализатора отбирают
5 мкл раствора и смешивают с 80 мкл деионизованного формамида, после чего
тщательно перемешивают раствор на вортексе и осаждают центрифугированием;
- отбирают по 10 мкл полученного раствора в 8 пробирок по 200 мкл
(одиночных, в составе стрипа или лунки А - Н 96-луночного планшета) и
помещают микропробирки в держатель планшета, закрывают резиновым
антииспарителем, закрепляют фиксатором и ставят в прибор в соответствии с
инструкцией по его эксплуатации;
- спектральную калибровку генетического анализатора проводят по
стандартному протоколу в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора.
7.3.1.2.2 Подготовка плашки с образцами для анализа на
генетическом анализаторе
Готовят смесь деионизованного формамида и размерного стандарта
GeneScan'^’'^ 600 LIZ® Size Standard, смешивая 50x(N+2) мкл деионизованного
формамида и l,5x(N+2) мкл размерного стандарта, где N - количество
исследуемых образцов, 2 - количество контролей. Полученную смесь
перемешивают, центрифугируют и раскапывают по 10 мкл в микропробирки
стандартных стрипов (например, SSI-3111) или 96-ти луночных плашек для
ПНР (например, SSI-3400).
Готовят аликвоты 1:10 растворов ампликонов. Для этого готовят N
пробирок с 45 мкл ТЕ-буфера (ТЕ из состава набора) в каждой и вносят по 5
мкл ампликонов индивидуальным наконечником с аэрозольным барьером.
Полученную смесь перемешивают, центрифугируют и переносят по 1 мкл
разведенных в 10 раз продуктов амплификации в микропробирки со смесью
деионизованного формамида и размерного стандарта, перемешивают,
центрифугируют и денатурируют при 95 °С в течение 300 с.
Помещают микропробирки в держатель планшета, закрывают резиновым
антииспарителем, закрепляют фиксатором и ставят в прибор в соответствии с
инструкцией по его эксплуатации.
L
17
--- стр. 18 ---
7.3.1.2.3 Проведение капиллярного электрофореза на генетическом
анализаторе
- запускают программу управления генетическим анализатором (для
«Устройства секвенирования Д1Ж по ТУ 9443-005-04699534-2013, с
принадлежностями» SeqPI.exe, для «Анализатор генетический Applied
Biosystems 3500 Dx, с принадлежностями» Data Collection);
- выбирают программу фрагментного анализа (в зависимости от длины
установленных на приборе капилляров, например, для «Устройство
секвенирования Д1Ж по ТУ 9443-005-04699534-2013, с принадлежностями» с
линейкой капилляров длиной 35 см программу «VNTR Salmonella typhi
35cM.avt», для ABI PRISM® 310/3100/3100Avant/3130/3130x//3500/3500jc/
Fragment Analysis_X_POP_Y, где X - длина капилляров, Y - тип полимера = 4,
6 или 7);
- проводят описание плашки по рядам с образцами, вводя следующие
обязательные сведения:
названия образцов;
тип образца (образец, положительный контроль, отрицательный контроль);
используемый набор красителей (СК-5-ЕТ);
метод анализа (для генетического анализатора «Устройство
секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-2013, с принадлежностями» в
соответствии с таблицей 2, для генетических анализаторов ABI PRISM®
310/3100/3100Avant/3130/3130x//3500/3500x/ Sizing Default);
используемый размерный стандарт (LIZ 600);
- запускают программу в соответствии с инструкцией по эксплуатации
прибора.
Таблица 2 - Выбор метода анализа в зависимости от реакционной смеси
Метод анализа Реакционная смесь
СТ-1 РС-БТ-Г енотип!
СТ-2 РС-БТ-Г енотип2
СТ-3 РС-БТ-Г енотипЗ
18
--- стр. 19 ---
7.4 Процедура измерения результатов анализа
Оценку результатов проводят с помощью программного обеспечения к
генетическому анализатору.
7.5 Учет результатов реакции
7.5.1 Результаты анализа не подлежат учету:
- в случае регистрации продуктов амплификации в любой из пробирок
(РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ) с ОКО по любому из каналов FAM,
ROX, R6G, TAMRA**;
- в случае одновременной регистрации двух и более продуктов
амплификации (отличающихся по размерам и количеству повторов от
представленных в таблице 3) в любой из пробирок (РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-
ГенотипЗ) с ПКО-БТ-Генотип по любому из каналов FAM, ROX, R6G,
TAMRA**;
-в случае отсутствия регистрации продуктов амплификации в любой из
пробирок (РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ) с ПКО-БТ-Генотип по
любому из каналов FAM, ROX, R6G, TAMRA***;
** Требуется повторить исследование с этапа постановки ПЦР (п.п. 7.3.1.1 настоящей
инструкции). Повторное присутствие флуоресцентно-меченых продуктов амплификации в
любой из пробирок с ОКО, детектируемых по любому из каналов FAM, ROX, R6G, TAMRA,
также как и повторная регистрация дополнительных продуктов амплификации по любому из
каналов в пробирках с ПКО-БТ-Генотип свидетельствуют о контаминации лаборатории
специфическими последовательностями генома Salmonella enterica подвид enterica серотип
typhi (продуктами амплификации полиморфных локусов). Рекомендуется провести работы,
направленные на устранение контаминации в лаборатории, заменить набор реагентов и
повторить исследование;
*** Отсутствие флуоресцентно-меченых продуктов амплификации в любой из
пробирок с ПКО-БТ-Генотип требует повторного исследования с этапа постановки ПЦР (п.п.
7.3.1.1 настоящей инструкции). В случае повторного отрицательного результата необходимо
заменить набор реагентов и повторить исследование;
19
--- стр. 20 ---
- в случае одновременной регистрации двух и более продуктов
амплификации по любому из каналов FAM, ROX, R6G, TAMRA в любой из
пробирок (РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ) с исследуемым образцом
(образцами)* * * *.
7.5.2 Результаты анализа подлежат учету:
- в случае отсутствия регистрации продуктов амплификации во всех
пробирках (РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ) с ОКО по каналам FAM,
ROX, R6G, TAMRA;
- в случае регистрации продуктов амплификации ожидаемых размеров
(таблица 3) во всех пробирках (РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ) с ПКО-
БТ-Генотип по каналам FAM, ROX, R6G, TAMRA;
- в случае регистрации продуктов амплификации ожидаемых размеров
(таблица 3) во всех пробирках (РС-БТ-Генотип1 - РС-БТ-ГенотипЗ) с
исследуемым образцом (образцами) по каналам FAM, ROX, R6G,
TAMRA* * * * *****.
**** Одновременная регистрация двух и более продуктов амплификации в пробирках с
исследуемым образцом (образцами), детектируемых по любому из каналов FAM, ROX, R6G,
TAMRA (при отсутствии продуктов амплификации в пробирках с ОКО и наличии
соответствующих продуктов амплификации в пробирках с ПКО-БТ-Генотип), требует
повторного проведения анализа начиная с этапа вьщеления ДНК с целью исключения
возможной контаминации в ходе пробоподготовки образцов. В случае повторного
совпадения результатов исследования необходимо проведение клопового анализа данной
бактериальной культуры Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi на предмет
выявления присутствия в ней нескольких штаммов брюшнотифозного микроба.
***** В случае несовпадения размеров отдельных продуктов амплификации в
пробирках с исследуемым образцом (образцами) с заложенными в шаблоне, необходимо
повторное проведение анализа начиная с этапа выделения ДНК. В случае повторного
выявления продуктов амплификации, несовпадающих по размеру необходимо провести их
секвенирование для выявления нуклеотидных последовательностей данных локусов и
количества VNTR-повторов в них.
В случае получения неполного генетического профиля, необходимо провести
повторный анализ, начиная с этапа выделения ДНК. При повторном получении неполного
генетического профиля необходимо проведение секвенирования полного генома
микроорганизма с целью выявления возможных изменений последовательности ДНК в тех
VNTR-локусах, для которых не были получены продукты амплификации.
20
--- стр. 21 ---
Таблица 3 - Диапазоны размеров продуктов амплификации и длины повторов
известных аллелей 12-ти VNTR-локусов Salmonella enterica подвид enterica
серотип typhi, выявляемых с использованием набора реагентов «ОМ-Брюшной
Реакцион
ная смесь
Наимено
ванне
VNTR-
локуса
Канал
детекци
и
Диапазон
длин
продуктов
амплификац
И И ,
нуклеотид
Длина
(шаг)
повтора,
нуклеотид
Размер
продукта
амплификации
ПКО-БТ-
Г енотип,
нуклеотид*
Количество
повторов
ПКО-БТ-
Г енотип,
шт.
РС-БТ-
Генотип!
TR4699 FAM 199-388 6 332 23
TR4500 R6G 284-304 6 298 3
Sal23 TAMRA 247-271 12 271 3
STTR8 ROX 179-504 108 504 4
РС-БТ-
Г енотип2
Sal20 FAM 147-201 3 195 17
STTR5 R6G 178-292 6 268 16
STTR7 TAMRA 347-581 39 581 7
TR3 ROX 562-586 26 586 2
РС-БТ-
Г енотипЗ
Sal2 FAM 107-239 6 190 15
TR5 R6G 175-196 7 188 3
Sal6 TAMRA 168-204 6 198 6
TRl ROX 198-289 7 268 11
Примечание * - значения размеров продуктов амплификации VNTR-локусов
получены путем расчета с использованием программного обеспечения к
генетическому анализатору «Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-
04699534-2013, с принадлежностями» «Фрагментный анализ ДНК»,
относительно размерного стандарта GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard___________
На рисунках 1-3 представлены результаты автоматизированного гель-
электрофоретического разделения с лазер-индуцируемой детекцией продуктов
амплификации положительного контрольного образца ДЬЖ ПКО-БТ-Генотип,
полученные с использованием генетического анализатора «Устройство
секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-2013, с принадлежностями»
(ИАН РАН, г. Санкт-Петербург, Россия). По оси ординат на каждой
электрофореграмме отмечены относительные единицы флуоресценции, по оси
абсцисс отмечена рассчитываемая по размерному стандарту GeneScan'^^ 600 LIZ®
Size Standard длина фрагментов ДНК в нуклеотидах. Серые вертикальные столбцы
(так называемые бины), соответствуют известным аллелям полиморфных локусов
ДНК S. enterica подвид enterica серотип typhi и обеспечивают их программную
визуализацию. Над каждой группой бинов находится название соответствующего
21
--- стр. 22 ---
I
ло1суса. При наложении экспериментально полученного сигнала флуоресценции
(пика) на соответствующий бин ему автоматически присваивается числовое
значение соответствующего количества тандемных повторов.
А - Электрофореграмма продукта амплификации локуса TR4699, содержащего
23 повторов (цифрами от 1 до 32 обозначены известные повторы в данном
локусе);
Б - Электрофореграмма продукта амплификации локуса TR4500, содержащего
3 повтора (цифрами от 1 до 9 обозначены известные повторы в данном локусе);
В - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Sal23, содержащего 3
повтора (цифрами от 1 до 5 обозначены известные повторы в данном локусе);
Г - Электрофореграмма продукта амплификации локуса STTR8, содержащего 4
повтора (цифрами от 1 до 5 обозначены известные повторы в данном локусе)
Рисунок 1 - Результаты автоматизированного гель-электрофоретического
разделения с лазер-индуцируемой детекцией флуоресцентно-меченых
продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК
ПКО-БТ-Генотип для реакционной смеси РС-БТ-Генотип1
22
--- стр. 24 ---
L
. SahBfloda'TypM Лвк^&«12
1 2 3 4 5 6 7 в 9 1011 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 1 22 23
so o o o o -
400000-
300000-
200000-
100000-
i sitaoctdiTypu Лв^те:
< 500000-
400000-
300000-
200000--
100000-
B SatMOflfSa 1^^ Лоа^ Salt
1 2 3 4 5 6 7
, 600000-
500000-
400COO--
300000--
200000-
100000-
Г Stidwtrl» T ^ i IKi
1 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 1
I 700000- •
б00000-
500000-
400000-
300000- -
гooooo-
tooooo- -
fill
A - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Sal2, содержащего 15
повторов (цифрами от 1 до 23 обозначены известные повторы в данном локусе);
Б - Электрофореграмма продукта амплификации локуса TR5, содержащего 3
повтора (цифрами от 1 до 4 обозначены известные повторы в данном локусе);
В - Электрофореграмма продукта амплификации локуса Sal6, содержащего 6
повторов (цифрами от 1 до 7 обозначены известные повторы в данном локусе);
Г - Электрофореграмма продукта амплификации локуса TR1, содержащего 11
повторов (цифрами от 1 до 14 обозначены известные повторы в данном локусе)
Рисунок 3 - Результаты автоматизированного гель-электрофоретического
разделения с лазер-индуцируемой детекцией флуоресцентно-меченых
продуктов амплификации положительного контрольного образца ДНК
ПКО-БТ-Генотип для реакционной смеси РС-БТ-ГенотипЗ
24
--- стр. 25 ---
8 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
8Л Получение индивидуального генетического профиля
Результатом анализа с использованием набора реагентов «ОМ-Брюшной
тиф-Генотип» является индивидуальный генетический профиль исследуемой
бактериальной культуры (штамма) Salmonella enterica подвид enterica серотип
typhi по 12-ти VNTR-локусам. Результаты анализа каждой бактериальной
культуры (штамма) оформляют в виде таблицы, в которой указывают
генетические характеристики каждого VNTR-локуса (размер продукта
амплификации и соответствуюш;ее ему количество повторов). В качестве
примера в таблице 4 представлены результаты генетического типирования с
использованием набора реагентов «ОМ-Брюшной тиф-Генотип» штамма 4446
Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi.
Таблица 4 —Генетический профиль штамма 4446 Salmonella enterica подвид
enterica серотип typhi
№
п/п Наименование
VNTR-локуса
Длина (шаг)
повтора,
нуклеотид
Размер продукта
амплификации,
нуклеотид
Количество
повторов, шт.
1. TR4699 6 332 23
2. TR4500 6 298 3
3. Sal23 12 271 3
4. STTR8 108 504 4
5. Sal20 3 195 17
6. STTR5 6 268 16
7. STTR7 39 581 7
8. TR3 26 586 2
9. Sal2 6 190 15
10. TR5 7 188 3
11. Sal6 6 198 6
12. TRl 7 268 11
8.2 Анализ генетического профиля
Индивидуальный генетический профиль исследуемой культуры (штамма)
возбудителя брюшного тифа рассчитывается автоматически с помощью
программного обеспечения «Фрагментный анализ ДНК», поставляемого с
генетическим анализатором «Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-
25
--- стр. 26 ---
04699534-2013, с принадлежностями». Анализ и сравнение полученного
генетического профиля проводится с помощью шаблона, в который занесены
результаты предыдущих исследований. Шаблон поставляется с пакетом
программного обеспечения при поставке генетического анализатора
«Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-2013, с
принадлежностями», либо по запросу.
Если выявленные размеры продуктов амплификации полиморфных
локусов отличаются от заложенных в программном продукте «Фрагментный
анализ ДНК», необходимо повторить выделение ДНК из исследуемой
бактериальной культуры (штамма) Salmonella enterica подвид enterica серотип
typhi и повторно с использованием набора реагентов «ОМ-Брюшной тиф-
Генотип» провести анализ генетического профиля по всем 12-ти VNTR-
локусам. В случае совпадения результатов анализа необходимо провести
секвенирование отличающихся по размеру продуктов амплификации
соответствующих VNTR-локусов.
При получении неполного генетического профиля, также необходимо
повторить выделение ДНК из исследуемой бактериальной культуры (штамма)
Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi и повторно с использованием
набора реагентов «ОМ-Брюшной тиф-Генотип» провести анализ генетического
профиля по всем 12-ти VNTR-локусам. В случае повторения результатов
анализа, достоверно установить генетический профиль исследуемой культуры
(штамма) невозможно.
Выявленные с использованием набора реагентов «ОМ-Брюшной тиф-
Генотип» генетические профили бактериальных культур Salmonella enterica
подвид enterica серотип typhi, выделенных в ходе микробиологических
исследований различных проб в эпидемических очагах являются объективной
доказательной базой для установления причинно-следственных связей
возникновения вспышки брюшного тифа.
26
--- стр. 27 ---
9 РАСЧЕТЫ
9.1 Используемые компьютерные программы
Для оценки результатов фрагментного анализа используют
специализированное программное обеспечение "Фрагментный анализ ДНК"
версия 5.0 и выше, поставляемое производителем прибора «Устройство
секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-04699534-2013, с принадлежностями».
Работу с программным обеспечением осуш,ествляют согласно руководству по
эксплуатации прибора «Устройство секвенирования ДНК по ТУ 9443-005-
04699534-2013, с принадлежностями»и руководству оператора программы
анализа данных "Фрагментный анализ ДНК" (ИАН РАН, г. Санкт-Петербург,
Россия).
10 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И
ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
10.1 Условия хранения набора
В соответствии с ТУ 9398-019-46395995-2013 - в сухом, защищенном от
света месте при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Суммарный срок
хранения при температуре от плюс 9 до плюс 20 °С не должен превышать
14 суток в течение срока годности набора реагентов.
10.2 Условия транспортирования набора
Транспортирование набора реагентов «ОМ-Брюшной тиф-Генотип»
должно производиться в соответствии с ТУ 9398-019-46395995-2013 крытым
транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при
температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Допускается транспортирование до
14 суток при температуре до плюс 20 °С.
10.3 Срок годности набора
Срок годности набора реагентов составляет 12 месяцев с даты выпуска
предприятием-изготовителем. Серии наборов реагентов с истекшим сроком
годности применению не подлежат. Срок годности вскрытых реагентов
соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых
реагентов, если в инструкции не указано иное. Срок годности разведенных
27
--- стр. 28 ---
препаратов ПКО-БТ-Генотип не более месяца при температуре хранения не
выше минус 20 °С.
10.4 Информация по безопасной утилизации
Использование набора происходит в рабочей зоне 3, не подразумевающей
контакта с биоматериалом (МУ 1.3.2569-09). Использованные наборы после
анализа препаратов РНК собирают в пластиковые закрывающиеся емкости и
выносят в рабочую зону 4-1 либо специально предназначенное
вспомогательное помещение (МУ 1.3.2569-09) с целью последующей
утилизации по классу Б (СанПиН 2.1.7.2790-10).
Наборы с истекшим сроком годности, а также в случае повреждения
упаковки, утилизируют по классу А, как эпидемиологически безопасные
отходы, по составу приближенные к ТБО (СанПиН 2.1.7.2790-10).
10.5 Гарантийные обязательства производителя
Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных
характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и
эксплуатационной документации, в течение установленного срока годности
(12 месяцев) при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и
применения.
Рекламации на качество набора реагентов «ОМ-Брюшной тиф-Генотип»
направлять на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» (127550, г. Москва,
ул. Тимирязевская, 42, тел. (495) 984-69-93, факс. (499) 977-74-55 E.mail:
syntol@syntol.ru).
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по
применению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании,
фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и
медицинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется
направить сообщение на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» по адресу,
указанному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую
организацию в соответствии с действующим законодательством.
28
--- стр. 29 ---
Прошито, пронумеровано.
проброшюровано листов
г енеральный ;щректор
ЗАО «(
В. Кузубов