Набор реагентов для HLA генотипирования для in vitro диагностики иммунофлуоресцентным методом — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 --- цикле количество целевой ДНК удваивается. Для данного теста оптимальным считается 35 циклов, теоретически обеспечивающих выход более миллиарда копий. Реакция гибридизации По завершении процесса ПЦР-амцлификации ампликоны подвергаются химической денатурации для формирования одиночных цепей ДНК. Биотинилированные ампликоны наносятся на нейлоновую мембрану, на которой иммобилизованы SSO-зонды (SSO - sequence-specific oligonucleotide). Происходит связывание (гибридизация) ампликонов с SSO-зондами. Причём, гибридизуются только ампликоны, содержащие нуклеотидную последовательность, полностью комплементарную зондовой. Таким образом, мембрана «поглощает» биотинилированные ампликоны-мишени. После гибридизации проводится жёсткая отмывка несвязавшихся ампликонов, обеспечивающая специфичность реакции. Состав набора Наборы LIFECODES для HLA- типирования (локусы А, В, С, DRB, DRB1, DQB) на базе Luminex (максимальное число тестов - 50) Реагент Объём Хранение MX- LIFECODES HLA Раствор для ПЦР 870 мкл 2-8°С вм- LIFECODES HLA Флюоресцентный конъюгат 810 мкл 2-8°С Беречь от света! DS Раствор для разведения 9.9 мл 18-30°С Замечание: Флюоресцентный конъюгат свето-чувствителен, беречь от света Получение и подготовка образца Предупреждение: Со всеми биологическими образцами следует обращаться как с потенциально инфицированными. Данный набор предназначен для применения с образцами крови, взятыми с EDTA или КПД, из которых ДНК вьщеляется высококачественным методом экстракции, например, при помощи набора Dynal DNA Extraction Kit [код изделия 633.01]. Перед выделением ДНК необходимо соблюдать условия хранения образцов крови, приведённые в руководстве набора для экстракции. Вьщеленную ДНК разведите деионизованной водой или буфером из набора для экстракции до конечной концентрации 13-15 нг/мкл и получения соотношения А260/280 в диапазоне 1.65-1.80. Образцы ДНК можно либо использовать непосредственно после выделения, либо хранить при температуре -4 °С до 5 дней. ДНК допустимо хранить до 1 года при температуре -20 °С или ниже, что не вызывает снижения качества исследования данным набором. Для минимизации эффектов деградации ДНК необходимо избегать лишних циклов заморозки/оттаивания ДНК. Замечание: при слишком малом количестве ДНК амплификация может не произойти, а чрезмерное количество ДНК приводит к предпочтительной амплификации некоторых аллелей или экзонов, в некоторых реакциях зашкаливающей. --- стр. 4 --- Замечание: если отношение А260/280 выходит за указанный диапазон, загрязнения ДНК могут ингибировать ПЦР. Постановка ПЦР ВЫПОЛНЯЕТСЯ в ПРЕ-ПЦР-ПОМЕЩЕНИИ 1. Определите подходящее количество пробирок для ПЦР, необходимых для тестирования пациентов и контролей. При выполнении амплификации каждый раз обязательна постановка одного негативного и одного позитивного контроля. 2. Используя для каждого реактива отдельный наконечник, внесите реагенты во все пробирки в таком порядке: При использовании набора 50 тестов: 15 мкл раствор 6.0 мМ MgCb 30 мкл Mastermix 15 мкл ДНК (концентрация 13-15 нг/мкл, т. е., примерно 200 нг на реакцию) При использовании набора 100, 500 и 1000 тестов: 7.5 мкл раствор 6.0 мМ MgCb 15 мкл Mastermix 7.5 мкл ДНК (концентрация 13-15 нг/мкл, т. е., примерно 200 нг на реакцию) 3. В пробирку для позитивного контроля в качестве образца внесите 15мкл (7,5 мкл) позитивной контрольной ДНК из набора, а в пробирку для негативного контроля - 15 мкл (7,5 мкл) стерильной деионизованной воды. Разметьте позиции образцов пациентов и контролей в ПЦР планшете. 4. Закройте пробирки крышками или клейкой плёнкой. Пробы готовы к амплификации. 5. Оставшиеся реагенты набора следует хранить при температуре 2-8 °С. ПЦР-амплификация ВЫПОЛНЯЕТСЯ В ПОСТ-ПЦР-ПОМЕЩЕНИИ 1. Поместите образцы в термоциклер. 2. Установите в соответствии с инструкцией термоциклера следующие параметры амплификации: ЦИКЛ (35 циклов) 15 с 95 °С, 45 с 60 °С, 15 с 72 °С ХРАНЕНИЕ 5 минут 72 °С ХРАНЕНИЕ 15 °С до окончания 3. Запустите программу. Её выполнение продолжается примерно 1.6 часа. 4. По завершении программы извлеките образцы из термоциклера. ЗАМЕЧАНИЕ: ОРГАНИЗУЙТЕ РАБОТУ В ЛАБОРАТОРИИ ТАКИМ ОБРАЗОМ, ЧТОБЫ АМПЛИФИЦИРОВАННЫЕ ОБРАЗЦЫ НИКОГДА НЕ ПОПАДАЛИ В ПРЕ-ПЦР-ПОМЕЩЕНИЕ. Амплифицированные образцы следует рассматривать как наиболее вероятные источники контаминации. 5. Осторожно, чтобы не разбрызгивать содержимое пробирок, удалите с них крышки (или клейкую плёнку). 6. В каждую пробирку внесите по 60 мкл раствора для денатурации. Перемешайте несколько раз пипетированием. Для каждого внесения используйте отдельный наконечник. 7. Для полной денатурации инкубируйте не менее 10 минут при комнатной температуре. --- стр. 5 --- 8. Если выполнение детекции планируется начать в пределах 1 -2 часов, то денатурированный ампликон следует хранить при комнатной температуре. Если нет, то закройте пробирки новыми крышками и храните при температуре 2-8 °С до начала анализа. В таком виде допуетимо хранить не более 1 недели. Денатурированный ампликон нельзя замораживать. Неденатурированный ампликон можно хранить при температуре -20 °С или ниже до 3 месяцев. Процедура гибридизации и детекции Проводится в зоне постамплификации. 1. 2. 3. 4. 5. Нагрейте в водяной бане Буфер для гибридизации (Hibridisation buffer) и отмеренные 275 мл промывочного буфера (Stingent Wash Buffer). Преципитированные соли должны раствориться. Остальные растворы используются при комнатной температуре. Включите блот-гибридизатор ВаЬуВее. Промаркируйте стрипы со свободного конца водостойкими чернилами, и уложите их в лунки блот-гибридизатора, маркировкой кверху и к себе. Количество стрипов по каждому локусу должно соответствовать к-ву пациентов плюс один положительный контроль. Держите стрип за свободный от олигонуклеотидов конец. Добавьте в каждую лунку ВаЬуВее, содержащую стрипы, 5 мл подогретого до 50С Hibridisation buffer. Добавьте в каждую лунку 70 мкл денатурированных ампликонов, в соответствии с маркировкой. Закройте крышку прибора. Нажмите «старт». Процедура инкубации длится 30 мин., при 50С. Убедитесь что реагент покрывает каждый стрип полностью, и не переливается в соседние лунки. 7. По окончании инкубации аспирируйте реагент механическим отсосом. 8. Добавите в каждую лунку 5 мл Ambient Wash Buffer (комнатной температуры). Нажмите «старт» (инкубация 5 мин) 9. Аспирируйте реагент механическим отсосом. 10. Добавьте в каждую лунку 5 мл подогретого на водяной бане до 50С Stingent Wash Buffer. Нажмите «старт» (инкубация 15 мин) 11. Приготовьте раствор рабочего коньюгата (Working Conjugate Solution) в соответствии с Таблицей 1 (стр 15) англоязычной инструкции к набору. Данный раствор готовиться не ранее чем за 15 мин до использования. 12. Аспирируйте реагент по окончании инкубации п.12. 13. Добавьте в каждую лунку 5 мл Working Conjugate Solution. Нажмите «старт» (инкубация 15 мин) 14. Аспирируйте реагент механическим отсосом. 15. Добавьте в каждую лунку 5 мл Ambient Wash Buffer (комнатной температуры). Нажмите «старт», инкубация 5 мин. --- стр. 6 --- 16. Аспирируйте реагент механическим отсосом. 17. Добавьте в каждую лунку 5 мл Ambient Wash Buffer (комнатной температуры). Нажмите «старт», инкубация 5 мин. 18. Аспирируйте реагент механическим отсосом. 19. Добавьте в каждую лунку 5 мл Citrate Buffer. Нажмите «старт», (инкубация 5 мин). 20. Приготовьте рабочий Субстрат (Working Substrat) в соответствии с Таблицей 1 (стр15). Раствор готовиться не более чем за 3 часа до использования. Хранится в темном месте. 21. Аспирируйте реагент (п.19) механическим отсосом. 22. Добавьте в каждую лунку 5 мл Working Substrat. Нажмите «старт», (инкубация 10 мин. 23. Аспирируйте реагент механическим отсосом 24. Добавьте в каждую лунку 5 мл деионизованной воды. Нажмите «старт», (инкубация 5 мин. 25. Аспирируйте реагент механическим отсосом 26. Добавьте в каждую лунку 5 мл деионизованной воды. Нажмите «старт», (инкубация 5 мин 27. Аспирируйте реагент. Если стрипы будут анализироваться не сразу, добавьте в каждую лунку планшета циртатный буфер. Хранить не более 3- X дней при 2-8С Ограничения метода 1. 2. 3. 4. 5. Вследствие высокой аналитической чувствительности ПЦР особое внимание следует уделять сохранению реагентов и амплификационных смесей в строгой чистоте. Рабочий процесс в лаборатории должен быть организован однонаправленно, так чтобы ампликон ПЦР не мог попадать в зону пре амплификации. Чистота реагентов обеспечивается обязательным облюдением правил Хорошей Лабораторной Практики (GLP), а сохранность характеристик теста гарантирована только при строгом следовании рекомендациям данного руководства. Тест Dynal RELI™ SSO HLA-B при разработке испытывался на негепаринизированных образцах цельной крови. Его характеристики в отношении иных образцов не исследовались. Образец ДНК представляет собой шаблон для процесса ПЦР-амплификации. Его качество, определяемое концентрацией и чистотой, должно удовлетворять требованиям, обозначенным в данном руководстве. Допустимо использование любого сертифицированного термоциклера, по характеристикам эквивалентного аппарату Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 или 9700. Необходимо обеспечить надлежащую настройку инструментов и оборудования в соответствии с рекомендациями производителя. --- стр. 7 --- Ожидаемые значения результатов Вводный контроль качества в начале использования набора из нового лота следует провести контроль качества путём типирования нескольких аттестованных образцов гетерозиготной ДНК, дающих позитивную реакцию на каждом зонде хотя бы в одном случае. В таблице 4 приведён предлагаемый список аллелей. HLA-B*Allele Positive Probes 0701 1, 7, 13, 15, 20, 28, 29, 32, 39, 50, 54, 56, 60, 61, 62 0801 5, 7, 13, 15, 16, 28, 29, 32, 40, 49, 52, 56, 59, 61, 62 1402 2, 7, 13, 15, 17, 28, 29, 38, 42, 48, 52, 56, 58, 61, 62 1512 6, 9, 14, 18, 28, 29, 31, 43, 51, 53, 55, 61, 62 2702 3, 7, 13, 14, 19, 27, 29, 35, 44, 48, 54, 56, 61, 62 3701 3, 8, 13, 14, 18, 23, 26, 29, 37, 42, 49, 52, 56, 61, 62 3801 1, 7, 13, 15, 17, 27, 29, 31, 45, 52, 56, 61, 62 4402 6, 10, 14, 18, 25, 29, 30, 46, 49, 53, 57, 61, 62 4601 6, 9, 14, 22, 24, 28, 31, 43, 51, 53, 56, 61, 62 4701 6, 10, 14, 18, 23, 26, 29, 36, 44, 48, 54, 56, 61, 62 4901 4, 10, 14, 18, 27, 29, 47, 48, 53, 56, 61, 62 5401 6, 11, 12, 15, 20, 28, 29, 33, 41, 48, 52, 56, 61, 62 5701 6, 9, 21, 27, 29, 34, 43, 48, 53, 56, 61, 62 Внутрисерийный контроль качества При каждой постановке теста необходимо анализировать один позитивный контрольный образец ДНК (из состава набора) и один негативный контрольный образец. 1. Позитивная контрольная ДНК. Контрольный образец даёт позитивные сигналы на зондах 3, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 19, 23, 26, 27, 29, 33, 35, 40, 44, 48, 53, 54, 56, 58, 61, 62. Тип контрольного образца ДНК - В*2705, 5101. Он входит в список типов, распознаваемых программным обеспечением. При несовпадении результата анализа контрольного образца с указанным выше шаблоном вся аналитическая серия, включая пробоподготовку, амплификацию и детекцию, считается недействительной и должна быть проведена повторно. Возможно, проблему помогут решить рекомендации раздела Troubleshooting Guide2. 2. Негативный контроль. Каждый зонд стрипа должен давать с негативным контролем отрицательный результат. При наличии позитивного сигнала хотя бы на одном зонде вся аналитическая серия считается недействительной и должна быть проведена повторно. Возможно, проблему помогут решить рекомендации раздела Troubleshooting Guide 3. Внутренний контроль На стрип для типирования HLA-B нанесены два зонда референтной интенсивности: один - для экзона 2 (зонд 29) и один для экзона 3 (зонд 61). Помимо того, на стрипе имеется внутренний позитивный контрольный зонд (зонд 62). 1. Зонды референтной интенсивности (Intensity Reference Probes) Эти зонды выполняют две функции а) Служат признаком адекватной амплификации и гибридизации образца. Референтный зонд подобран таким образом, чтобы сигнал на нём был более слабым, чем на всех прочих зондах. Следовательно, если сигнал на нём отсутствует, правильное определение HLA-B типа невозможно, поскольку нельзя