Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителей холеры и брюшного тифа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ) по ТУ 939816-014-46395995-2013 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- 1 НАЗНАЧЕНИЕ 1.1 Полное название набора «Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителей холеры и брюшного тифа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ)». 1.2 Предназначение набора и его диагностическая роль Набор реагентов «ОМ-Скрин-Холера/БТ-PB» предназначен для качественного определения (скрининг, мониторинг) ДНК возбудителя холеры - эпидемически значимые штаммы Vibrio cholerae ( <ctxA+ , tcpA+ ) и возбудителя брюшного тифа - Salmonella enterica подвид enterica серотип typhi в биологическом материале: испражнения, рвотные массы, желчь, кровь, моча, спинномозговая жидкость, аутоптаты, пищевых продуктах и пробах из объектов окружающей среды, а также в культурах микроорганизмов методом ПЦР-РВ. Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его использования в поддержке диагностики специфической патологии (холера и брюшной тиф) при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА), в объектах окружающей среды; как ускоренного предварительного теста при выполнении биологического метода исследования и идентификации подозрительных культур; для эпидемиологического мониторинга. 1.3 Область применения набора Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика (кишечных) инфекций, специфическая индикация патогенных биологических агентов, эпидемиологический мониторинг, научные исследования. Набор может быть использован в учреждениях медицины и здравоохранения, в лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии и противочумных учреждениях Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах, а также в стационарных и мобильных лабораториях специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе Министерства обороны. --- стр. 3 --- 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА Компоненты набора являются одноразовыми. Набор реагентов «ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ» не требует технического обслуживания и калибровки. 2.1 Состав набора Набор реагентов состоит из 5 реагентов. № п/п Состав комплекта Описание Объем Кол-во 1 . Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-Холера/БТ сухое вещество белого цвета 1 мг 6 стрипов 2. Разбавитель, РБ прозрачная бесцветная жидкость 0,8 мл 1 пробирка 3. Положительный контрольный образец, ПКО-Холера/БТ сухое вещество белого цвета 2 мг 3 пробирки 4. Раствор для разбавления ПКО, ОКО прозрачная бесцветная жидкость 1,0 мл 1 пробирка 5. Внутренний положительный контроль выделения, ВПК-В сухое вещество белого цвета 2 мг 1 пробирка Реакционная смесь в стрипованных микропробирках (лиофилизованная), РС-Холера/БТ, расфасована в микропробирки в стрипах объемом 0,2 мл, упакованные в непрозрачный полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 9x12 см, состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, восемь олигонуклеотидных праймеров, четыре флуоресцентных зонда, фермент Taq ДНК-полимераза; синтетическая ДНК внутреннего положительного контроля (ВПК), трегалоза. Разбавитель РБ, расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: ПЦР-буфер; хлорид магния; глицерол; вода для ПЦР. Положительный контрольный образец (лиофилизованный), ПКО- Холера/БТ, расфасован в три пробирки из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованные в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6x7 см, состав: смесь трех рекомбинантных плазмид pGem-T, две из которых содержат встроенные специфические последовательности ДНК з --- стр. 4 --- возбудителя холеры: фрагмент гена ctxA и фрагмент гена tcpA, третья содержит встроенную специфическую последовательность ДНК возбудителя брюшного тифа - хромосомный локус STY3672. Раствор для разбавления ПКО, ОКО, расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: ТЕ буфер. Внутренний положительный контроль выделения, ВПК-В (лиофилизованный), расфасован в пробирку из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: рекомбинантая плазмида pGem-T со встроенным специфическим фрагментом ДНК. Примечание: ингредиентами, которые могут влиять на измерения, являются праймеры и флуоресцентные зонды, основной характеристикой которых для конечного пользователя является температура отжига Та, составляющая 62 °С. Данная характеристика реализуется с помощью температурно-временного режима амплификации, следовательно, его соблюдение является строго обязательным. 2.2 Количество анализируемых проб Набор реагентов рассчитан на 48 определений, включая контрольные образцы. 2.3 Метод исследования Обнаружение специфических фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей холеры и брюшного тифа основано на использовании метода мультиплексной полимеразной цепной реакции с получением результата в режиме реального времени - ПЦР-РВ. В основе метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) лежит изменение сигнала флуоресценции в ходе реакции. Это изменение происходит благодаря использованию специфического для искомой ДНК олигонуклеотидного зонда, который, подобно праймеру, в ходе реакции связывается с одной из цепей ампликона. К 5’ и 3’ концам зонда присоединены --- стр. 5 --- флуорофор и гаситель флуоресценции соответственно. При возбуждении молекулы флуорофора светом определенной длины волны данная молекула испускает свет другой длины волны. За счет близости молекул флуорофора и гасителя флуоресценции, находящихся на одном зонде, последний поглощает флуоресценцию и изменения аналитического сигнала не происходит. В результате расщепления специфического для искомой ДНК олигонуклеотидного зонда Taq-полимеразой на этапе элонгации при температурах около 60 °С, гаситель прекращает поглощать флуоресценцию данной молекулы флуорофора (технология TaqMan). С каждым циклом ПЦР число освобожденных молекул флуорофора экспоненциально возрастает (рисунок 1). Рисунок 1 - Принцип аналитического процесса Постановка ПЦР-РВ осуществляется на специальных приборах, например, «АНК-32 (32М, 48)» (ПАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX- 96» («BioRad», США), или эквивалентных по характеристикам (см. п. 5.1 настоящей инструкции). В амплификации используют четыре олигонуклеотидных праймера, фланкирующих фрагменты ДНК возбудителя холеры, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих фрагмент ДНК возбудителя брюшного тифа и два олигонуклеотидных праймера фланкирующих ДНК внутреннего --- стр. 6 --- положительного контроля ПЦР-РВ, а также четыре флуоресцентных зонда. Процесс амплификации специфичных фрагментов заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой с детекцией результатов в режиме реального времени. Набор реагентов «ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси два генетических маркера эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов: фрагмент гена ctxA, кодирующего субъединицу А холерного токсина - по каналу флуоресценции ROX, фрагмент гена tcpA, отвечающего за синтез большой субъединицы токсин- коррегулируемых пилей адгезии - по каналу флуоресценции R6G, а также специфическую последовательность ДНК возбудителя брюшного тифа - хромосомный локус STY3672 - по каналу флуоресценции FAM, а также внутренний контроль - по каналу Су5. Положительный результат теста означает, что исследуемый материал содержит ДНК эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов и возбудителя брюшного тифа. Отрицательный результат теста означает, что исследуемый материал не содержит ДНК эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов и возбудителя брюшного тифа. 2.4 Ограничения метода В инфицированном материале ДНК V.cholerae (ctxA+, tcpA+ ) и S.enterica подвид enterica серотип typhi может быть не обнаружена по причине ингибирования ПЦР-РВ и/или недостаточной эффективности выделения ДНК. Для достижения показателей аналитической чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность выделения ПК на уровне не менее 20 %. Причиной получения ложноположительного результата является контаминация на этапе выделения ДНК либо проведения реакции ПЦР-РВ. --- стр. 7 --- Ложноположительный результат выявляется с помощью отрицательных контрольных образцов выделения и ПЦР-РВ (п. 7.5 настоящей инструкции). Причиной получения ложноотрицательного результата является ингибирование ПЦР-РВ и/или недостаточная эффективность выделения ДНК. Ложноотрицательный результат выявляется с помощью внутреннего положительного контрольного образца ПЦР-РВ и выделения (п. 7.5 настоящей инструкции). 3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1.1 Чувствительность Чувствительность - не менее 1,0-10 копий ДНК в миллилитре пробы (копий-мл'1 ). Данный показатель достигается при условии объема аликвоты исходного материала (пробы) не менее 100 мкл. 3.1.2 Специфичность Специфичность - ложноотрицательные результаты при анализе образцов ДНК штаммов V.cholerae (9 заведомо положительных образцов) и S.enterica enterica серотип typhi (23 заведомо положительных образца) отсутствовали, ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК гетерологичных микроорганизмов Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Eschirichia coli, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis (6 заведомо отрицательных образцов) отсутствовали. 3.2 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Диагностическая чувствительность - при исследовании 94 проб бактериальных суспензий культур микроорганизмов и 44 проб биологического материала и объектов окружающей среды (138 положительных проб) содержащих V . cholerae (ctxA+ tcpA+ ) и Salmonella enterica подвид enterica ■ з серотип typhi в концентрации 1,0-10 м.к./мл положительный результат получен --- стр. 8 --- в 137 случаях. Диагностическая чувствительность - не менее 97,5 % с доверительной вероятностью 90 %. Диагностическая специфичность - при исследовании 138 положительных образцов, содержащих возбудитель холеры ( <ctxA+ tcpA+) и брюшного тифа, положительный результат получен во всех 138 случаях, при исследовании 136 отрицательных образцов, содержащих эпидемически безопасные штаммы холерных вибрионов ( ctxA- tcpA -) и гетерологичные микроорганизмы в л концентрации не менее 1,0-10 м.к./мл, отрицательный ответ в ПЦР получен во всех 136 случаях. Диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90%. 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ Работу проводят в соответствии с требованиями СП 13.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды», «Брюшной тиф и паратифы А и В: Методические указания по диагностике, лечению и профилактике в Вооруженных Силах Российской Федерации». Потенциальный риск применения набора — класс 3 (п. 9 приложения № 2 к приказу Минздрава России от 06.06.2012 № 4н). 4.1 Необходимость обучения персонала Для выполнения анализа с помощью данного набора реагентов необходимо участие специалиста с высшим медицинским образованием, прошедшего обучение на лицензированных курсах специализации по работе с ПБА I-II групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также лаборанта со средним специальным медицинским образованием. Персонал должен иметь --- стр. 9 --- навыки работы с биохимическими реактивами и современным лабораторным оборудованием. 4.2 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными, вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует соблюдать обычные меры предосторожности для лабораторий: - пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные халаты; - не принимать пищу, пить или курить в лабораторных помещениях; - после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом. Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов набора реагентов за медицинской помощью следует обратиться немедленно. 4.3 Необходимые меры предосторожности в отношении влияния физических факторов При использовании набора реагентов нет необходимости принимать меры предосторожности в отношении влияния магнитных полей, внешних электрических воздействий, электростатических разрядов, давления или перепадов давления, перегрузки, источников термического воспламенения. 4.4 Необходимые меры предосторожности против специальных рисков При использовании набора реагентов нет необходимости принимать меры предосторожности против любых специальных рисков при использовании или реализации, поскольку в состав изделия не входят вещества человеческого или животного происхождения с учетом их потенциальной инфекционной природы. --- стр. 10 --- 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ 5.1 Рекомендуемое измерительное оборудование Прибор для ПЦР-РВ - зарегистрированный в РФ как медицинское изделие и имеющий каналы детекции, соответствующие красителям FAM, R6G, ROX, Су5 (либо их спектральным аналогам) со следующими характеристиками - А ^акс.возб/^м акс.эм . (№1 _ 490нм/520нм, №2 - 525нм/550нм, №3 - 550нм/580нм, №4 - 630нм/665нм), например, «АНК-32 (32М, 48)», «CFX-96». 5.2 Указания о необходимости использования специального оборудования Работу с набором следует проводить в настольном боксе с бактерицидной лампой (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные системы», г. Миасс, Россия), установленном в рабочей зоне 3 (МУ 1.3.2569-09). 5.3 Дозирующие устройства Набор автоматических пипеток переменного объема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 10-100 мкл и на 20-200 мкл; штатив-карусель для данных пипеток. 5.4 Другое используемое оборудование Микроцентрифуга-вортекс (например, «Циклотемп-901»); микроцентрифуга для стрипов (например, «Циклотемп-903»); штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 и 1,5 мл; штатив для работы со стрипами (кат. номер СТ-15, ЗАО Синтол); холодильник на 2-8 °С. 5.5 Лабораторная посуда Емкости для сброса наконечников и микропробирок. 5.6 Материалы и реагенты, не входящие в состав набора Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 10 мкл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 20 мкл; ю --- стр. 11 --- одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл; набор реагентов для выделния ДНК/РНК; ТЕ-буфер (кат. номер В-014, ЗАО «Синтол»); отдельный халат и одноразовые медицинские перчатки; комплект средств для обработки рабочего места. 6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ Получение и обработка биологического материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями холеры и брюшного тифа не являются частью процедуры анализа с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ». 6.1 Тип исследуемых образцов В соответствии с МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды» и «Брюшной тиф и паратифы А и В: Методические указания по диагностике, лечению и профилактике в Вооруженных Силах Российской Федерации», материалом для исследований на холеру и брюшной тиф являются: пробы из объектов окружающей среды, пищевые продукты, аутоптаты, материал от больных или подозрительных на заболевание людей (испражнения, рвотные массы, желчь, кровь, моча, спинномозговая жидкость), жидкие среды накопления и подозрительные на возбудителей холеры и брюшного тифа культуры. 6.2 Процедура получения и предварительной подготовки биологического материала и проб из объектов окружающей среды Все работы по забору проб клинического и секционного материала от людей и животных, из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические и --- стр. 12 --- лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды» и «Брюшной тиф и паратифы А и В: Методические указания по диагностике, лечению и профилактике в Вооруженных Силах Российской Федерации». 6.2Л Подготовка клинического материала Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл с помощью одноразовой иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специальной вакуумной системы типа «Vacuett» с ЭДТА или цитратом натрия, или стерильным шприцем в стерильные стеклянные или пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Аккуратно перемешивают покачиванием до полного смешивания с антикоагулянтом. При наличии диареи испражнения в количестве 10-20 мл собирают в стерильную посуду объемом 60-100 мл стерильными ложками или автоматической пипеткой переменного объема. При отсутствии диареи материал забирают в количестве 1-2 г в стерильные емкости объемом 60- 100 мл. Испражнения могут быть забраны во флакон или пробирку с 1 % пептонной водой при подозрении на холеру или с консервантом - при подозрении на брюшной тиф. Ректальные мазки забирают стерильным ватным тампоном или одноразовой стерильной ректальной петлей, предварительно смоченной стерильным 0,9 % раствором натрия хлористого, и помещают во флакон или пробирку с 1 % пептонной водой при подозрении на холеру или с консервантом - при подозрении на брюшной тиф. Жидкие испражнения переносят по 1-5 мл в микроцентрифужные пробирки с завинчивающимися крышками. Пробирки центрифугируют при 9000 об.-мин'1 в течение 5 минут. Затем отбирают по 0,2 мл верхней бело --- стр. 13 --- желтой части осадка или с границы осадка и супернатанта или со дна пробирки и переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируют при 12000 об.-мин'1 в течение 15 минут. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. К плотным испражнениям добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в соотношении 1:9, тщательно ресуспендируют, отбирают по 1 мл в микроцентрифужные пробирки. Дальнейшую подготовку проводят так же, как при исследовании жидких испражнений. При исследовании испражнений и ректальных мазков, забранных во флаконы или пробирки с 1 % пептонной водой или консервантом, отбирают по 1 мл в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют в течение 15 минут при 12000 об.-мин'1 . Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в стерильную посуду ложками или автоматической пипеткой переменного объема. Дальнейшую подготовку проводят так же, как при исследовании жидких испражнений. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК. Желчь берут при дуоденальном зондировании в лечебном учреждении. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Для исследования отбирают по 100 мкл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Мочу (первую утреннюю порцию) отбирают в количестве не менее 20 - 30 мл в специальный сухой стерильный флакон. Переносят 1 мл мочи, используя наконечник с фильтром, в стерильные одноразовые пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируют в течение 10 минут при 10000 об.-мин’1 , полностью удаляют супернатант, не захватывая осадок. К осадку добавляют транспортную среду до конечного объема 0,2 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе. --- стр. 19 --- центрифугируют 5 секунд при 3000 об'мин"1 . Полученный раствор ВПК-В добавляют по 10 мкл во все пробирки с исследуемыми образцами после их обеззараживания и в пробирку с ОКО-В. При применении на этапе пробоподготовки наборов производства ЗАО «Синтол» добавления ВПК-В для контроля выделения нуклеиновых кислот не требуется, поскольку он входит в состав лизирующего компонента. 7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1 Процедура приготовления положительного контрольного образца В пробирку с сухим содержимым ПКО-Холера/БТ из набора реагентов «ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ» добавляют 200 мкл ОКО, перемешивают на вортексе до полного растворения, центрифугируют 5 секунд при 3000 об-мин'1 . Хранение разведенных препаратов ПКО-Холера/БТ допускается при температуре не выше минус 20 °С не более месяца. 7.2 Разведение препарата ДНК (при необходимости) Для выявления и идентификации ДНК возбудителей холеры и брюшного тифа необходимо внести в реакцию 20 мкл препарата ДНК. В случае необходимости, раствор препарата ДНК разводят с помощью ТЕ-буфера. При исследовании чистых культур микроорганизмов, препараты ДНК, выделенные из 100 мкл бактериальной суспензии с концентрацией пх109м.к.-мл'1 , разводят в 100 раз с помощью ТЕ-буфера. 7.3 Проведение ПЦР Расход каждого реагента На одну постановку ПЦР-РВ требуются: 1 пробирка - для ОКО; 1 пробирка - для ОКО-В; 1 пробирка - для ПКО; необходимое количество пробирок по числу исследуемых образцов. На каждый анализ расходуется: 20 мкл ПКО-Холера/БТ; --- стр. 20 --- 20 мкл ОКО. Последовательность проведения этапов анализа Анализ с помощью набора реагентов проводится в один этап: - включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией по эксплуатации; - вводят согласно таблице 1 в диалоговый интерфейс программы амплификатора параметры температурно-временного режима ПЦР-РВ и вводят красители FAM, R6G, ROX и Су5; Таблица 1 - Температурно-временной режим амплификации № п/п Температурно-временной режим Число циклов 2 95 °С - 300 секунд 1 3 62 °С - 40 секунд 504 95 °С - 15 секунд - вводят сведения об образцах по соответствующему красителю (при использовании прибора «АНК32 (32М, 48)» ввод сведений об образцах возможен после запуска программы амплификации) и активируют прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации; - набор реагентов извлекают из холодильника, РБ, ОКО перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 секунд при 3000 об*мин''; - устанавливают необходимое количество микропробирок с реакционной смесью РС-Холера/БТ в штатив (количество микропробирок соответствует числу исследуемых проб и контрольных образцов: ПКО, ОКО, ОКО-В) и маркируют в соответствии с протоколом исследования на боковой стенке, либо на крышке пробирки (в зависимости от прибора); - открывают крышки микропробирок и вносят в них по 15 мкл РБ; - используя наконечники с аэрозольным барьером последовательно вносят в микропробирки согласно их маркировке по 20 мкл ОКО, ОКО-В и исследуемых образцов, в необходимой повторности*, закрывают крышки данных микропробирок. --- стр. 21 --- - вносят в микропробирку с маркировкой ГЖО 20 мкл ПКО-Холера/БТ, закрывают крышку микропробирки. - перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и центрифугируют 5 секунд при 3000 об-мин'1 Помещают микропробирки в прибор для ПЦР-РВ в соответствии с таблицей 2 и прикатывают крышки микропробирок. Таблица 2. Порядок исследования образцов № ячейки Образец 1 ОКО 2 око-в 3 пко 4 исследуемый образец 1 5 исследуемый образец 1 6 исследуемый образец 2 7 исследуемый образец 2 8 - закрывают крышку прибора, запускают реакцию ПЦР-РВ и фиксируют в рабочем журнале название файла с результатом работы прибора (расчетное время анализа составляет около 2-х часов). * Примечание: каждый образец рекомендуется анализировать в двух повторах. 7.4 Процедура измерения результатов анализа Оценку результатов проводят с помощью приборов для ПЦР-РВ, например, «АНК-32 (32М, 48)», «CFX-96» или эквивалентных им (см. п. 5.1 настоящей инструкции). Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции (регистрация роста сигнала) означает любую величину порогового цикла Ct менее 50. Отсутствие регистрации роста сигнала прибором описывается программой прибора, например, как величина порогового цикла (Ct > 50 в приборах «АНК»), либо как ее отсутствие (N/A в приборах фирмы «BioRad») и т.п. Подробная информация приведена в руководстве по эксплуатации конкретного прибора. --- стр. 22 --- Кинетические кривые роста сигналов флуоресценции по каналам FAM, R6G и ROX относительно отрицательного контроля свидетельствуют о наличии специфических фрагментов ДНК S.enterica enterica серотип typhi (FAM) и V.cholerae (ctxA+ , tcpA+) (ROX и R6G) в данной микропробирке. Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналу Су5 с пороговым циклом Ct> 35в случае отсутствия сигналов по каналам FAM, R6G и ROX свидетельствует об успешном прохождении реакции ПЦР-РВ и подтверждает отсутствие специфических фрагментов ДНК V.cholerae (ctxA+ , tcpA+) и S.enterica enterica серотип typhi в данной микропробирке. Наличие роста сигнала флуоресценции в данной микропробирке по каналу Су5 с пороговым циклом Ct менее 31,0 в сравнении с сигналом флуоресценции в пробирках с ОКО по каналу Су5 (Ct > 35), также свидетельствует об успешном выделении ДНК. 7.5 Учет результатов реакции 7.5.1. Оценка амплификации ВПК-В Регистрация в пробирке с ОКО-В роста сигнала флуоресценции по каналу Су5 с пороговым циклом Ct менее 31,0 свидетельствует об успешном выделении ДНК внутреннего положительного контроля в пробирке ОКО-В (рисунок 2). Регистрация в пробирках с исследуемыми образцами сигнала флуоресценции по каналу Су5 пороговым циклом Ct менее 31,0 свидетельствует об успешном выделении ДНК в пробирках с исследуемыми образцами. Допускается отсутствие регистрации роста сигнала по каналу Су5 в пробирках, где отмечен рост сигнала по каналам FAM, R6G, ROX с пороговым циклом реакции менее 30,0. Рост сигнала флуоресценции по каналу Су5 в случае отсутствия роста сигнала флуоресценции по другим каналам подтверждает отсутствие специфических фрагментов ДНК возбудителей холеры и брюшного тифа. --- стр. 25 --- 8 РАСЧЕТЫ 8.1 Используемые компьютерные программы Для проведения ПЦР-РВ и оценки её результатов используют специализированное программное обеспечение, поставляемое производителем прибора, например программа AHK Shell версия 33 и выше, поставляемая с приборами «АНК-32М», «АНК-48» или Bio-Rad CFX Manager 2.0 и выше, поставляемая с прибором CFX-96. Работу с программным обеспечением осуществляют согласно руководству по эксплуатации прибора. 9 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 9.1 Условия хранения набора В соответствии с ТУ 9398-014-46395995-2013 - в сухом, защищенном от света месте при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Суммарный срок хранения при температуре от плюс 9 до плюс 20 °С не должен превышать 14 суток в течение срока годности набора реагентов. 9.2 Условия транспортирования набора Транспортирование набора реагентов «ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ» должно производиться в соответствии с ТУ 9398-014-46395995-2013 крытым транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Допускается транспортирование до 14 суток при температуре до плюс 20 °С. 9.3 Срок годности набора Срок годности набора реагентов составляет 12 месяцев с даты выпуска предприятием-изготовителем. Серии наборов реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежат. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Срок годности разведенных препаратов ПКО-Холера/БТ не более месяца при температуре хранения не выше минус 20 °С. --- стр. 26 --- 9.4 Информация по безопасной утилизации Использованные пробирки с ампликонами, наконечники, перчатки, ветошь для обработки поверхностей в ПЦР-боксе, собирают в пластиковые закрывающиеся емкости, выносят в рабочую зону 4-1 либо специально предназначенное вспомогательное помещение (МУ 1.3.2569-09) с целью последующей инактивации согласно требованиям СанПиН 2.1.7.2790-10. Наборы с истекшим сроком годности, а также в случае повреждения упаковки, утилизируют по классу А, как эпидемиологически безопасные отходы, по составу приближенные к ТБО (СанПиН 2.1.7.2790-10). 9.5 Гарантийные обязательства производителя Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в течение установленного срока годности (12 месяцев) при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора реагентов «ОМ-Скрин-Холера/БТ-РВ» направлять на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, тел. (495) 984-69-93, факс. (499) 977-74-55 E.mail: syntol@syntol.ru). При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется направить сообщение на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» по адресу, указанному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию в соответствии с действующим законодательством. Директор ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора академик РАН, д.м.н., профессор . Кутырев --- стр. 27 --- Прошито, пронумеровано, проброшюровано листов