Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов Ласса, Мачупо и Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ) по ТУ 939816-003-46395995-2013 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- 1 НАЗНАЧЕНИЕ 1.1 Полное название набора «Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов Ласса, Мачупо и Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ)». 1.2 Предназначение набора и его диагностическая роль Набор реагентов «ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» предназначен для качественного определения (скрининг, мониторинг) РНК вирусов Ласса, Мачупо и Хунин в препаратах НК, выделенных из проб: объектов окружающей среды, клинических образцов, вируссодержащей суспензии, биопсийного и аутопсийного материала. Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его использования в поддержке диагностики специфических патологий (геморрагических лихорадок Ласса, Боливийской и Аргентинской) при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА), в объектах окружающей среды; как ускоренного предварительного теста при выполнении культурального и биологического методов исследования и идентификации подозрительных культур; для эпидемиологического мониторинга. 1.3 Область применения набора Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика ге моррагических лихорадок Ласса, Боливийской и Аргентинской, специфическая индикация патогенных биологических агентов, эпидемиологический монито ринг, научные исследования. Набор может быть использован в учреждениях медицины и здравоохранения, вирусологических лабораториях Центров гигие ны и эпидемиологии Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах для расщифровки вспыщек экзотических инфекций, а также в стационарных и мо бильных лабораториях специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе Министерства Обороны. --- стр. 3 --- 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА Компоненты набора являются одноразовыми. Набор реагентов «ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» не требует технического обслуживания и калибровки. 2.1 Состав набора Набор реагентов состоит из 5 реагентов. № Состав комплекта Описание Объем Кол-во 1. Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-ЛХМ сухое вещество белого цвета 1 мг 6 Стрипов по 8 микропробирок 2. Разбавитель, РБ прозрачная бесцветная жидкость 0,8 мл 1 пробирка 3. Положительный контрольный образец, ПКО-ЛХМ сухое вещество белого цвета 2 мг 3 пробирки 4. Раствор для разбавления ПКО, ОКО прозрачная бесцветная жидкость 1 мл 1 пробирка 5. Внутренний положительный контроль выделения, ВПК-В- РНК сухое вещество белого цвета 2 мг 1 пробирка Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-ЛХМ, расфасована в микропробирки в стрипах (по 8 штук в каждом) объемом 0,2 мл , упакованные в непрозрачный полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 9x12 см, состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, десять олигонуклеотидных праймеров, семь флуоресцентных зондов, фермент Taq ДНК-полимераза; фермент MMLV-ревертаза; синтетическая РНК ВПК, трегалоза. Разбавитель, РБ, расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip- Lock размером 4х? см, состав: ПЦР-буфер; хлорид магния; глицерол; вода для ПЦР. Раствор для разбавления ПКО, ОКО, расфасован в пробирку из полипро пилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэти леновый пакет Zip-Lock размером 4х? см, состав: ТЕ буфер. --- стр. 4 --- Положительный контрольный образец, ПКО-ЛХМ, расфасован в про бирку из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающейся крышкой, упако ванную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6x7 см, состав: смесь син тетических РНК, полученных с помощью in vitro транскрипции с рекомбинант ных плазмид pGem-T с встроенными специфическими фрагментами НК L-сегмента генома вируса Ласса, L-сегмента генома вируса Хунин и S-сегмента вируса Мачупо. Внутренний положительный контроль выделения, ВПК-В-РНК, расфасо ван в пробирку из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающейся крыш кой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: синтетическая РНК, полученная с помощью in vitro транскрипции с рекомби нантной плазмиды pGem-T со встроенным специфическим фрагментом ДНК. Примечание: Ингредиентами, которые могут влиять на измерения, явля ются праймеры и флуоресцентные зонды, основной характеристикой которых для конечного пользователя является температура отжига Та, составляющая 60 °С. Данная характеристика реализуется с помощью температурно временного режима амплификации, следовательно, его соблюдение является строго обязательным.х 2.2 Количество анализируемых проб Набор реагентов рассчитан на 48 определений, включая контрольные образцы. 2.3 Метод исследования Обнаружение фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей опасных вирусных инфекций основано на использовании метода мультиплексной одностадийной реакции обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) в одной микропробирке. При амплификации с помощью ОТ-ПЦР-РВ используют два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих фрагмент S-сегмента генома вируса Мачупо, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих фрагмент L- сегмента генома вируса Хунин, два олигонуклеотидных праймера, --- стр. 5 --- фланкирующих фрагмент Ь-сегмента генома вируса Ласса, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих нуклеиновые кислоты (НК) внутреннего положительного контроля ОТ-ПЦР-РВ, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих НК внутреннего положительного контроля выделения, а также семь флуоресцентных зондов. Процесс амплификации специфичных фрагментов заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой с детекцией результатов в режиме реального времени. Постановка ОТ-ПЦР-РВ осуществляется на специальных приборах, например, «АНК-32М (48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург), СРХ-96 (В1оКаё, США), или эквивалентных по характеристикам (см. п. 5.1 настоящей инструкции). Набор реагентов «ОМ-Скрин- Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» реализует пре имущества мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ в части одновременного выявления в одной пробе РНК трех вирусов, а также двух контролей анализа по разным ка налам детекции флуоресценции. Сигналы флуоресценции регистрируются не зависимо друг от друга по следующим каналам; РАМ - вирус Хунин; КбС - вирус Мачупо; КОХ - вирус Ласса; Су5 - внутренний положительный кон троль ОТ-ПЦР-РВ; Су5.5 - внутренний положительный контроль выделения РНК. Положительный результат теста означает, что исследуемый материал со держит РНК вирусов Хунин и/или Мачупо и/или Ласса. Отрицательный резуль тат теста означает, что исследуемый материал не содержит РНК вирусов Хунин и/или Мачупо и/или Ласса. 2.3 Ограничения метода В инфицированном материале РНК вирусов может быть не обнаружена по причине ингибирования ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточной эффективности выделения нуклеиновых кислот. Для достижения показателей аналитической чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность выделения НК на уровне не менее 20 %. --- стр. 6 --- причиной получения ложноположительного результата является конта минация на этапе выделения НК либо проведения реакции ОТ-ПЦР-РВ. Лож ноположительный результат выявляется с помощью отрицательных контроль ных образцов выделения и ОТ-ПЦР-РВ (п. 8.3 настоящей инструкции). Причиной получения ложноотрицательного результата является ингиби рование ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточная эффективность выделения НК. Лож ноотрицательный результат выявляется с помощью внутренних положительных контрольных образцов выделения РЬЖ (ВПК-В-РНК) и ОТ-ПЦР-РВ (ВПК) (п. 8.3 настоящей инструкции). И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЗЛ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Исследования аналитических характеристик набора проведены на базах ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Сергиев Посад Московской области) и ЗАО Синтол (г. Москва) в рамках исследования эффективности набора и проведения технических испытаний. ЗЛЛ Чувствительность Чувствительность - не более 1,0-10^ копий РНК в 1 миллилитре пробы (копий мл''). Данный показатель достигается при условии объема аликвоты исходного материала (пробы) не менее 100 мкл. ЗЛЛ Специфичность Специфичность - ложноположительные и ложноотрицательные результаты при анализе образцов РНК вирусов Ласса, Мачупо и Хунин (4 заведомо положительных образца), а также НК вирусов Марбург, Эбола, ВЭЛ, Западного Нила, денге, желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт, клещевого и японского энцефалитов, ККГЛ, ТОРС; бактериях Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Coxiella burnetii, ДНК человека и грызунов, культур клеток Vero, GMK и ВНК, а также РКЭ (26 заведомо отрицательных образцов) отсутствовали. --- стр. 7 --- При проведении исследований наблюдалась полная внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов. 3.2 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Клинические исследования набора проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ Вектор (р.п. Кольцово, Новосибирской области). 3.2.1 Диагностическая чувствительность Диагностическая чувствительность МИ Набор реагентов для выявле ния и идентификации РНК вирусов Ласса, Мачупо и Хунин методом полиме разной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин- ^ РВ) при исследовании 320 положительных проб (128 проб содержащих вирус Мачупо с концентрацией 1x10^ копий/мл, 64 пробы содержащие вирус Ласса с концентрацией 1x10^ копий/мл, 64 пробы содержащие вирус Хунин с концен трацией 1x10^ копий/мл, а также 64 мультиплексных пробы, содержащие виру- сы Ласса, Мачупо и Хунин с концентрацией 1x10 копий/мл, положительный результат получен в 320 случаях. 3.2.2 Диагностическая специфичность Диагностическая специфичность - при исследовании 64 отрицательных образцов, содержащих гетерологичные микроорганизмы (вирусы клещевого энцефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки, денге. Западного Нила, лихорадки долины Рифт, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, бешенст- п ва. Эбола, Марбург) в концентрации не менее 1,0-10 копий/мл, отрицательный ответ в ПЦР получен во всех 64 случаях. При проведении исследований наблюдалась полная внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов. Диагностические характеристики применительно к каждому из аналитов, а также каждому из типов образцов материала отдельно приведены в Приложении. 7 --- стр. 8 --- 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ Работу с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность вирусами Лаоса, Мачупо и Хунин проводят в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил по безопасности работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности (опасности) (СП 1.3.3118-13) и методических указаний «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У групп патогенности» (МУ 1.3.2569-09). Необходимо одновременно обеспечить и соблюдать персоналом правила биологической безопасности и требования к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами и (или) ампликонами исследуемых проб помещений и оборудования. Потенциальный риск применения набора - класс 3 (п. 9 приложения № 2 к приказу Минздрава России от 06.06.2012 № 4н). 4.1 Необходимость обучения персонала Для выполнения анализа с помощью данного набора реагентов необхо димо участие специалиста с высщим медицинским образованием, прощедщего обучение на лицензированных курсах специализации по работе с ПБА I- II групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также лаборанта со средним специальным медицинским образованием. Персонал должен иметь навыки ра боты с биохимическими реактивами и современным лабораторным оборудова нием. 4.2 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора При работе с набором соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 «Лабо ратории медицинские. Требования безопасности». Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными, вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует соблюдать обычные меры предосторожности для лабораторий: - пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные ха латы; 8 --- стр. 9 --- - не принимать пищу, пить или курить в лабораторных помещениях; - после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом. Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попа дании на них компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов набора реагентов за медицинской помощью следу ет обратиться немедленно. 4.3 Необходимые меры предосторожности в отношении влияния фи зических факторов При использовании набора реагентов нет необходимости принимать ме ры предосторожности в отношении влияния магнитных полей, внешних элек трических воздействий, электростатических разрядов, давления или перепадов давления, перегрузки, источников термического воспламенения. 4.4 Необходимые меры предосторожности против специальных рис ков При использовании набора реагентов нет необходимости принимать ме ры предосторожности против любых специальных рисков при использовании или реализации, поскольку в состав изделия не входят вещества человеческого или животного происхождения с учетом их потенциальной инфекционной при роды. 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ 5.1 Рекомендуемое измерительное оборудование Прибор для ПЦР-РВ - зарегистрированный в РФ как медицинское изделие и имеющий каналы детекции, соответствующие красителям РАМ, КбО, КОХ, Су 5, Су 5.5 (либо их спектральным аналогам) со следующими характеристиками - А,макс.возбАмакс.эм. (№1 - 490нм/520нм, №2 - 525нм/550нм, №3 - 550нм/580нм, №4 - 630нм/665нм, №5 - 675нм/694нм), например, «АНК-32М (48)», СРХ-96. --- стр. 10 --- 5.2 Указания о необходимости использования специального оборудования Работу с набором следует проводить в настольном боксе с бактерицидной лампой (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные системы», г. Миасс, Россия), установленном в рабочей зоне 3 (МУ 1.3.2569-09). 5.3 Дозирующие устройства Набор автоматических пипеток переменного объема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 10-100 мкл и на 20-200 мкл; штатив-карусель для данных пипеток. 5.4 Другое используемое оборудование Микроцентрифуга-вортекс (например, «Циклотемп-901»); микроцентрифуга для стрипов (например, «Циклотемп-903»); штатив типа «ЬоРгееге»; штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 и 1,5 мл; штатив для работы со стрипами (кат. номер СТ-15, ЗАО Синтол); холодильник на 2-8 °С. 5.5 Лабораторная посуда Емкости для сброса наконечников и микропробирок. 5.6 Материалы и реагенты, не входящие в состав набора Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 10 мкл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 20 мкл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл; набор реагентов для выделения ДНК/РНК; ТЕ-буфер (кат. номер В-014, ЗАО «Синтол»); отдельный халат и одноразовые медицинские перчатки; комплект средств для обработки рабочего места. 10 --- стр. 12 --- в пробирку с пробой непосредственно перед внесением сорбента. Регистрация роста сигнала по каналу Су5.5 свидетельствует об успешном выделении РНК. 6.4 Условия транспортирования и возможного хранения анализируемых образцов Пробы объектов окружающей среды, плазму и сыворотку крови хранят при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С не более 2 суток, при температуре от минус 16 до минус 20 °С не более одного месяца, при температуре минус 70 °С или в жидком азоте в течение 1 года, не допуская его оттаивания до проведения исследования. Образцы тканей хранят при температуре минус 70 °С или в жид ком азоте в течение 1 года. При замораживании клинического материала его транспортировка также должна проводиться в замороженном состоянии. Допускается только однократное замораживание-оттаивание образцов. 6.5 Меры предосторожности к материалу исследования Учет, хранение, передача и транспортирование биологического материа ла, подозрительного на наличие возбудителей геморрагических лихорадок Лао са, Боливийской и Аргентинской, должны осуществляться в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по безопасности работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности (опасности) (СП 1.3.3118- 13) и действующими санитарными правилами о порядке учета, хранения, пере дачи и транспортирования микроорганизмов 1-1У групп патогенности. Клинический материал утилизируют по классу В, как чрезвычайно эпи демиологически опасные отходы в соответствии с Санитарно- эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами (СанПиН 2.1.7.2790-10). 12 --- стр. 13 --- л 1 ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА 7Л Процедура приготовления контрольных образцов В пробирку с сухим содержимым ПКО-ЛХМ добавляют 200 мкл ОКО, перемешивают на вортексе до полного растворения, центрифугируют 5 секунд при 3000 об'мин’’. Хранение разведенных препаратов ПКО-ЛХМ допускается при температуре не выше минус 20 °С не более месяца. 7.2 Разведение препарата РНК (при необходимости) Для выявления и идентификации РНК вирусов Лаоса, Мачупо и Хунин необходимо внести в реакцию 20 мкл препарата РНК. В случае необходимости, раствор препарата РНК разводят с помощью ТЕ-буфера (кат. номер В-014, ЗАО «Синтол»). 8 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА Анализ проводят в рабочей зоне 3, не подразумевающей контакта с био материалом (МУ 1.3.2569-09). 8.1 Расход каждого реагента (минимальный) На одно определение расходуются: - одна микропробирка с РС-ЛХМ; - 15 мкл РБ. На каждый анализ расходуются: - 20 мкл ПКО-ЛХМ; - 20 мкл ОКО. 8.2 Последовательность проведения этапов анализа Анализ с помощью набора реагентов проводится в один этап: - включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией по эксплуатации; - вводят параметры температурно-временного режима амплификации со гласно таблице 1 и вводят красители ЕАМ, КбС, КОХ, Су5 и Су5.5; 13 --- стр. 14 --- Таблица 1 - Температурно-временной режим амплификации № п/п Температурно-временной режим Число циклов 1 50 °С - 900 секунд 1 2 95 °С - 300 секунд 1 3 60 °С - 40 секунд Считывание сигнала флуоресценции 50 4 95 °С - 15 секунд - вводят сведения об образцах по всем красителям и активируют прибор в соответствии с руководством по эксплуатации; При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free». - набор реагентов извлекают из холодильника, РБ и ОКО перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 секунд при 3000 об-мин"’; - помещают микропробирки в стрипах (РС-ЛХМ) в штатив типа «IsoF- reeze»** и маркируют в соответствии с протоколом исследования на боковой стенке пробирки; открывают крышки микропробирок и вносят в них по 15 мкл РБ; - используя наконечники с аэрозольным барьером, последовательно вно сят в микропробирки соответственно порядку исследования образцов по 20 мкл ОКО, око-в и далее по 20 мкл растворов исследуемых образцов в необходи мой повторности***, закрывают крышки данных микропробирок; - вносят в микропробирки соответственно маркировке по 20 мкл ПКО- ЛХМ, закрывают крышки данных микропробирок; - перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и центрифуги руют 5 секунд при 3000 об’мин"’. **Примечание: До начала работы штатив рекомендуется охладить в бы товом холодильнике до температуры 2-8 °С ***Примечание: каждый образец рекомендуется анализировать в двух повторах. 14 --- стр. 15 --- ВНИМАНИЕ! После смешивания РС-ЛХМ, разбавителя и препарата РНК, микропробирки сразу установить в амплификатор и запустить ОТ- ПЦР-РВ. Помещают микропробирки в прибор в соответствии с протоколом иссле дования (таблица 2) и прикатывают крышки микропробирок; Таблица 2 - Порядок исследования образцов № ячейки Образец 1 пко-лхм 2 пко-лхм 3 око 4 око 5 око-в 6 око-в 7 исследуемый образец 1 8 исследуемый образец 1 9 иеследуемый образец 2 10 исследуемый образец 2 11 - закрывают крышку прибора, запускают реакцию ОТ-ПЦР-РВ и фикси руют в рабочем журнале название файла с результатом работы прибора, рас четное время анализа составляет в среднем 2 часа. 8.3 Процедура измерения и оценки результатов анализа Оценку результатов проводят с помощью приборов для ПЦР-РВ, напри мер, «АНК-32 (32М, 48)», СРХ-96 или эквивалентных им (см. п. 5.1 настоящей инструкции). Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции (регистрация роста сигнала) означает любую величину порогового цикла С1 менее 50. Отсутствие регистрации роста сигнала прибором описывается программой прибора, на пример, как величина порогового цикла (С( >=50 в приборах АПК), либо как ее отсутствие (Х/А в приборах фирмы В1оКаё) и т.п. Подробная информация при ведена в руководстве по эксплуатации конкретного прибора. Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналу ГАМ, КбС либо КОХ относительно отрицательного контроля означает регистрацию роста 15 --- стр. 19 --- мая с прибором СРХ-96. Работу с программным обеспечением осуществляют согласно руководству по эксплуатации прибора. 10 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКС ПЛУАТАЦИИ НАБОРА 10.1 Условия хранения набора В соответствии с ТУ 9398-003-46395995-2013 - в сухом, защищенном от света месте при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Суммарный срок хранения при температуре от плюс 9 до плюс 20 °С не должен превышать 14 суток в те чение срока годности набора реагентов. 10.2 Условия транспортирования набора Транспортирование набора реагентов «ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин- РВ» должно производиться в соответствии с ТУ 9398-003-46395995-2013 кры тым транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Допускается транспортирование до 14 су ток при температуре до плюс 20 °С. 10.3 Срок годности набора Срок годности набора реагентов составляет 12 месяцев с даты выпуска предприятием-изготовителем. Серии наборов реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежат. Срок годности вскрытых реагентов соот ветствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Срок годности разведенных препаратов ПКО-ЛХМ и ВПК-В-РНК не более месяца при температуре хранения не выше минус 20 °С. 10.4 Информация по безопасной утилизации Использование набора происходит в рабочей зоне 3, не подразумеваюшей контакта с биоматериалом (МУ 1.3.2569-09). Использованные наборы после анализа препаратов РНК собирают в пластиковые закрывающиеся емкости и выносят в рабочую зону 4-1 либо специально предназначенное вспомогатель ное помещение (МУ 1.3.2569-09) с целью последующей утилизации по классу Б (СанПиН 2.1.7.2790-10). 19 --- стр. 20 --- Наборы с истекшим сроком годности, а также в случае повреждения упа ковки, утилизируют по классу А (СанПиН 2.1.7.2790-10). 10.5 Гарантийные обязательства производителя Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и экс плуатационной документации, в течение установленного срока годности (12 месяцев) при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора реагентов «ОМ-Скрин- Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» направлять на предприятие-изготовитель ЗАО «Син- тол» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, тел. (495) 984-69-93, факс. (499) 977-74-55 E.mail: syntol@syntol.ru). При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по при менению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и меди цинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется напра вить сообщение на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» по адресу, ука занному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую органи зацию в соответствии с действующим законодательством. Научный директор ЗАО «Синтол» Я.И.Алексеев СОГЛАСОВАНО: И.о. генерального дир ФБУН ГНЦ ВБ «Век К.М.Н., доцент В.Н. Михеев « » июня^016 г. 20 --- стр. 21 --- Приложение РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОЙ АПРОБАЦИИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ «Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов Лаоса, Мачупо и Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ)» на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Всего было исследовано 64 пробы, содержащие вирус Мачупо, 32 пробы, содержащие вирус Ласса и 32 пробы, содержащие вирус Хунин; 64 пробы, содержащих одновременно вирусы Ласса, Мачупо и Хунин, а также 32 пробы, содержащие штаммы гетерологичных вирусов (вирусы клещевого энцефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки, денге. Западного Нила, лихорадки долины Рифт, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, бешенства. Эбо ла, Марбург) на двух сериях набора реагентов. Результаты приведены в таблице. Таблица 1 Образец Положи тельные об- разцы* Подтверждённые положительные образцы серия 010914 серия 130914 серия 270815 серия 250815 Данные по моделированию нагрузки проб вирусом Хунин Клеточные культуры (вируссодержащая жидкость), содержащие вирус Хунин 8 - - 8 8 Кровь, содержащая вирус Хунин 8 - - 8 8 Пробы окружающей среды, содержащие вирус Хунин 8 - - 8 8 Пробы суспензии органов, содержащих вируе Хунин 8 - - 8 8 Итого проб, содержащих вирус Хунин 32 - - 32 32 Данные по моделированию нагрузки проб вирусом Мачупо Клеточные культуры (вируссодержащая жидкость), содержащие вирус Мачупо 16 16 16 - - Кровь, содержащая вирус Мачупо 16 16 16 - - Пробы окружающей среды, содержащие вирус Мачупо 16 16 16 - - Пробы суспензии органов, содержащих вирус Мачупо 16 16 16 - - Итого проб, содержащих вирус Мачупо 64 64 64 - - Данные по моделированию нагрузки проб ви эусом Ласса Клеточные культуры (вируссодержащая жидкость), содержащие вирус Ласса 8 8 8 - - Кровь, содержащая вирус Ласса 8 8 8 - - Пробы окружающей среды, содержащие вирус Ласса 8 8 8 - - Пробы суспензии органов, содержащих вирус Ласса 8 8 8 - - Итого проб, содержащих вирус Ласса 32 32 32 - - * Согласно интерпретации результатов инструкции по применению 21 --- стр. 25 --- 1 НАЗНАЧЕНИЕ 1.1 Полное название набора «Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов Ласса, Мачупо и Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ)». 1.2 Предназначение набора и его диагностическая роль Набор реагентов «ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» предназначен для качественного определения (скрининг, мониторинг)^ РНК вирусов Ласса, Мачупо и Хунин в препаратах НК, выделенных из проб; объектов окружающей среды, клинических образцов, вируссодержащей суспензии, биопсийного и аутопсийного материала. Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его использования в поддержке диагностики специфических патологий (геморрагических лихорадок Ласса, Боливийской и Аргентинской) при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА), в объектах окружающей среды; как ускоренного предварительного теста_ при выполнении культурального и биологического методов исследования и идентификации подозрительных культур; для эпидемиологического мониторинга. 1.3 Область применения набора Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика ге моррагических лихорадок Ласса, Боливийской и Аргентинской, специфическая индикация патогенных биологических агентов, эпидемиологический монито ринг, научные исследования. Набор может быть использован в учреждениях медицины и здравоохранения, вирусологических лабораториях Центров гигие ны и эпидемиологии Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах для расшифровки вспышек экзотических инфекций, а также в стационарных и мо бильных лабораториях специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе Министерства Обороны. --- стр. 26 --- 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА Компоненты набора являются одноразовыми. Набор реагентов «ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» не требует технического обслуживания и калибровки. 2.1 Состав набора Набор реагентов состоит из 5 реагентов. № Состав комплекта Описание Объем Кол-во 1. Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-ЛХМ сухое вещество белого цвета 1 мг 6 стрипов по 8 микропробирок 2. Разбавитель, РБ прозрачная бесцветная жидкость 0,8 мл 1 пробирка 3. Положительный контрольный образец, ПКО-ЛХМ сухое вещество белого цвета 2 мг 3 пробирки 4. Раствор для разбавления ПКО, ОКО прозрачная бесцветная жидкость 1 мл 1 пробирка 5. Внутренний положительный контроль вьщеления, ВПК-В- РНК сухое вещество белого цвета 2 мг 1 пробирка ♦ Реакционная смесь в стрипованных микропробирках, РС-ЛХМ, расфасована в микропробирки в стрипах (по 8 штук в каждом) объемом 0,2 мл , упакованные в непрозрачный полиэтиленовый пакет Zip.-Lock размером 9x12 см, состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, десять олигонуклеотидных праймеров, семь флуоресцентных зондов, фермент Taq ДНК-полимераза; фермент MMLV-ревертаза; синтетическая Р1Ж ВПК, трегалоза. Разбавитель, РБ, расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip- Lock размером 4x7 см, состав: ПЦР-буфер; хлорид магния; глицерол; вода для ПЦР. Раствор для разбавления ПКО, ОКО, расфасован в лробирку из полипро пилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэти леновый пакет Zip-Lock размером 4х? см, состав: ТЕ буфер. --- стр. 27 --- Положительный контрольный образец, ПКО-ЛХМ, расфасован в про бирку из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающейся крышкой, упако ванную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6x7 см, состав: смесь син тетических Р1Ж, полученных с помощью in vitro транскрипции с рекомбинант ных плазмид pGem-T с встроенными специфическими фрагментами ЬЖ L-сегмента генома вируса Ласса, L-сегмента генома вируса Хунин и S-сегмента вируса Мачупо. Внутренний положительный контроль выделения, ВПК-В-РНК, расфасо ван в пробирку из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающейся крыш кой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: синтетическая Р1Ж, полученная с помощью in vitro транскрипции с рекомби нантной плазмиды pGem-T со встроенным специфическим фрагментом ДНК. Примечание: Ингредиентами, которые могут влиять на измерения, явля ются праймеры и флуоресцентные зонды, основной характеристикой которых для конечного пользователя является температура отжига Та, составляющая 60 °С. Данная характеристика реализуется с помощью температурно временного режима амплификации, следовательно, его соблюдение является строго обязательным.' 2.2 Количество анализируемых проб Набор реагентов рассчитан на 48 определений, включая контрольные образцы. 2.3 Метод исследования Обнаружение фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей опасных вирусных инфекций основано на использовании метода мультиплексной одностадийной реакции обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) в одной микропробирке. При амплификации с помощью ОТ-ПЦР-РВ используют два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих фрагмент S-сегмента генома вируса Мачупо, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих фрагмент L- сегмента генома вируса Хунин, два олигонуклеотидных праймера. --- стр. 28 --- фланкирующих фрагмент Ь-сегмента генома вируса Лаоса, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих нуклеиновые кислоты (1Ж) внутреннего положительного контроля ОТ-ПЦР-РВ, два олигонуклеотидных праймера, фланкирующих ЬЖ внутреннего положительного контроля выделения, а также семь флуоресцентных зондов. Процесс амплификации специфичных фрагментов заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройке полинуклеотидных цепей с этих праймеров Д1Ж-полимеразой с детекцией результатов в режиме реального времени. Постановка ОТ-ПЦР-РВ осуществляется на специальных приборах, например, «АНК-32М (48)» (ПАП РАН, г. Санкт-Петербург), СРХ-96 (В1оКас1, США), или эквивалентных по характеристикам (сг£ п. 5.1 настоящей инструкции). Набор реагентов «ОМ-Скрин- Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» реализует пре имущества мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ в части одновременного выявления в одной пробе РНК трех вирусов, а также двух контролей анализа по разным ка налам детекции флуоресценции. Сигналы флуоресценции регистрируются независимо друг от друга по следующим каналам: ГАМ - вирус Хунин; КбС - вирус Мачупо; КОХ - вирус Ласса; Су5 - внутренний положительный кон троль ОТ-ПЦР-РВ; Су5.5 - внутренний положительный контроль выделения Р1Ж. Положительный результат теста означает, что исследуемый материал со держит РНК вирусов Хунин и/или Мачупо и/или Ласса. Отрицательный резуль тат теста означает, что исследуемый материал не содержит РНК вирусов Хунин и/или Мачупо и/или Ласса. 2.3 Ограничения метода В инфицированном материале РНК вирусов может быть не обнаружена по причине ингибирования ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточной эффективности выделения нуклеиновых кислот. Для достижения показателей аналитической чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность выделения НК на уровне не менее 20 %. --- стр. 29 --- Причиной получения ложноположительного результата является конта минация на этапе выделения НК либо проведения реакции ОТ-ПЦР-РВ. Лож ноположительный результат выявляется с помощью отрицательных контроль ных образцов выделения и ОТ-ПЦР-РВ (п. 8.3 настоящей инструкции). Причиной получения ложноотрицательного результата является ингиби рование ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточная эффективность выделения 1Ж. Лож ноотрицательный результат выявляется с помощью внутренних положительных контрольных образцов выделения РНК (ВПК-В-РНК) и ОТ-ПЦР-РВ (ВПК) (п. 8.3 настоящей инструкции). И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Исследования аналитических характеристик набора проведены на базах ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г. Сергиев Посад Московской области) и ЗАО Синтол (г. Москва) в рамках исследования эффективности набора и проведения технических испытаний. 3.1.1 Чувствительность Чувствительность - не более 1,0-10^ копий РНК в 1 миллилитре пробы (копий-мл"‘). Данный показатель достигается при условии объема аликвоты исходного материала (пробы) не менее 100 мкл. 3.1.2 Специфичность Специфичность - ложноположительные и ложноотрицательные результаты при анализе образцов Р1Ж вирусов Ласса, Мачупо и Хунин (4 заведомо положительных образца), а также НК вирусов Марбург, Эбола, ВЭЛ, Западного Нила, денге, желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт, клещевого и японского энцефалитов, ККГЛ, ТОРС; бактериях Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Coxiella burnetii, ДНК человека и грызунов, культур клеток Vero, GMK и ВН О ЕС, а также РКЭ (26 заведомо отрицательных образцов) отсутствовали. --- стр. 30 --- к > При проведении исследований наблюдалась полная внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов. 3.2 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Клинические исследования набора проведены на базе ФБУН ГНЦ ВБ Вектор (р.п. Кольцово, Новосибирской области). 3.2.1 Диагностическая чувствительность Диагностическая чувствительность МИ Набор реагентов для выявле ния и идентификации Р1Ж вирусов Ласса, Мачупо и Хунин методом полиме разной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин- РВ) при исследовании 320 положительных проб (128 проб содержащих вирус Мачупо с концентрацией 1x10^ копий/мл, 64 пробы содержащие вирус Ласса с концентрацией 1x10^ копий/мл, 64 пробы содержащие в“рус Хунин с концен трацией 1x10^ копий/мл, а также 64 мультиплексных пробы, содержащие виру сы Ласса, Мачупо и Хунин с концентрацией 1 х 10^ копий/мл, положительный результат получен в 320 случаях. 3.2.2 Диагностическая специфичность Диагностическая специфичность - при исследовании 72 отрицательных образцов, содержащих гетерологичные микроорганизмы (вирусы клещевого энцефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки, денге. Западного Нила, лихорадки долины Рифт, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, бешен ства, Эбола, Марбург, Хантаан, Пуумала) в концентрации не менее 1,0-10^ копий/мл, отрицательный ответ в ПЦР получен во всех 72 случаях. При проведении исследований наблюдалась полная внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов. Диагностические характеристики применительно к каждому из аналитов, а также каждому из типов образцов материала отдельно приведены в Приложении. 7 --- стр. 31 --- о 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ Работу с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность вирусами Ласса, Мачупо и Хунин проводят в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил по безопасности работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности (опасности) (СП 1.3.3118-13) и методических указаний «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У групп патогенности» (МУ 1.3.2569-09). Необходимо одновременно обеспечить и соблюдать персоналом правила биологической безопасности и требования к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами и (или) ампликонами исследуемых проб помещений и оборудования. Потенциальный риск применения набора - класс 3 (п. 9 приложения № 2 к приказу Минздрава России от 06.06.2012 № 4н). 4.1 Необходимость обучения персонала Для выполнения анализа с помощью данного набора реагентов необхо димо участие специалиста с высшим медицинским образованием, прощедщего обучение на лицензированных курсах специализации по работе с ПБА I- II групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также лаборанта со средним специальным медицинским образованием. Персонал должен иметь навыки ра боты с биохимическими реактивами и современным лабораторным оборудова нием. 4.2 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора При работе с набором соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 «Лабо ратории медицинские. Требования безопасности». Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными, вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором следует соблюдать обычные меры предосторожности для лабораторий: - пользоваться лабораторными перчатками и надевать лабораторные ха латы; 8 --- стр. 32 --- I - не принимать пишу, пить или курить в лабораторных помещениях; - после работы с пробами и реактивами следует тщательно вымыть руки водой с мылом. Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попа дании на них компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов набора реагентов за медицишжой помощью следу ет обратиться немедленно. 4.3 Необходимые меры предосторожности в отношении влияния фи зических факторов При использовании набора реагентов нет необходимости принимать ме ры предосторожности в отношении влияния магнитных полей, внешних элек трических воздействий, электростатических разрядов, давления или перепадов давления, перегрузки, источников термического воспламенения. 4.4 Необходимые меры предосторожности против специальных рис ков При использовании набора реагентов нет необходимости принимать ме ры предосторожности против любых специальных рисков при использовании или реализации, поскольку в состав изделия не входят вещества человеческого или животного происхождения с учетом их потенциальной инфекционной при роды. 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ 5.1 Рекомендуемое измерительное оборудование Прибор для ПЦР-РВ - зарегистрированный в РФ как медицинское изделие и имеющий каналы детекции, соответствующие красителям РАМ, КбО, ЯОХ, Су 5, Су 5.5 (либо их спектральным аналогам) со следующими характеристиками - Х макс.возб./А -макс.эм. (№1 - 490нм/520нм, №2 - 525нм/550нм, №3 - 550нм/580нм, №4 - 630нм/665нм, №5 - 675нм/694нм), например, «АНК-32М (48)», СРХ-96. --- стр. 33 --- 5.2 Указания о необходимости использования специального оборудования Работу с набором следует проводить в настольном боксе с бактерицидной лампой (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные системы», г. Миасс, Россия), установленном в рабочей зоне 3 (МУ 1.3.2569-09). 5.3 Дозирующие устройства Набор автоматических пипеток переменного об“.ема на 0,5-10 мкл, 2-20 мкл, 10-100 мкл и на 20-200 мкл; штатив-карусель для данных пипеток. 5.4 Другое используемое оборудование Микроцентрифуга-вортекс (например, «Циклотемп-901»); микроцентрифуга для стрипов (например, «Циклотемп-903»); штатив типа «ЬоРгееге»; штативы для наконечников, микропробирок на 0,5 и 1,5 мл; штатив для работы со стрипами (кат. номер СТ-15, ЗАО Синтол); холодильник на 2-8 °С. 5.5 Лабораторная посуда Емкости для сброса наконечников и микропробирок. 5.6 Материалы и реагенты, не входящие в состав набора Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 10 мкл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 20 мкл; одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл; набор реагентов для выделения ДНК/РНК; ТЕ-буфер (кат. номер В-014, ЗАО «Синтол»); отдельный халат и одноразовые медицинские перчатки; комплект средств для обработки рабочего места. 10 --- стр. 35 --- в пробирку с пробой непосредственно перед внесением сорбента. Регистрация роста сигнала по каналу Су5.5 свидетельствует об успешном выделении РЕЙС. 6.4 Условия транспортирования и возможного хранения анализируемых образцов Пробы объектов окружающей среды, плазму и сыворотку крови хранят при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С не более 2 суток, при температуре от минус 16 до минус 20 °С не более одного месяца, при температуре минус 70 °С или в жидком азоте в течение 1 года, не допуская его оттаивания до проведения исследования. Образцы тканей хранят при температуре минус 70 °С или в жид ком азоте в течение 1 года. При замораживании клинического материала его транспортировка также должна проводиться в замороженном состоянии. Допускается только однократное замораживание-оттаивание образцов. 6.5 Меры предосторожности к материалу исследования Учет, хранение, передача и транспортирование биологического материа ла, подозрительного на наличие возбудителей геморрагических лихорадок Ласса, Боливийской и Аргентинской, должны осуществляться в соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами по безопасности работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности (опасности) (СП 1.3.3118- 13) и действующими санитарными правилами о порядке учета, хранения, пере дачи и транспортирования микроорганизмов 1-1У групп патогенности. Клинический материал утилизируют по классу В, как чрезвычайно эпи демиологически опасные отходы в соответствии с Санитарно- эпидемиологическими требованиями к обращению с медицинскими отходами (СанПиН 2.1.7.2790-10). 12 --- стр. 36 --- I 7 ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА 7.1 Процедура приготовления контрольных образцов В пробирку с сухим содержимым ПКО-ЛХМ добавляют 200 мкл ОКО, перемешивают на вортексе до полного растворения, центрифугируют 5 секунд при 3000 об-мин‘*. Хранение разведенных препаратов ПКО-ЛХМ допускается при температуре не выше минус 20 °С не более месяца. 7.2 Разведение препарата РНК (при необходимости) Для выявления и идентификации Р1Ж вирусов Ласса, Мачупо и Хунин необходимо внести в реакцию 20 мкл препарата РНК. В случае необходимости, раствор препарата Р1Ж разводят с помощью ТЕ-буфера (кат. номер В-014, ЗАО «Синтол»). 8 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА Анализ проводят в рабочей зоне 3, не подразумевающей контакта с био материалом (МУ 1.3.2569-09). 8.1 Расход каждого реагента (минимальный) На одно определение расходуются: - одна микропробирка с РС-ЛХМ; - 15 мкл РБ. На каждый анализ расходуются: - 20 мкл ПКО-ЛХМ; - 20 мкл ОКО. 8.2 Последовательность проведения этапов анализа Анализ с помощью набора реагентов проводится в один этап: - включают прибор, запускают программу в соответствии с инструкцией по эксплуатации; - вводят параметры температурно-временного режима амплификации со гласно таблице 1 и вводят красители ЕАМ, КбС, КОХ, Су5 и Су5.5; 13 --- стр. 37 --- Таблица 1 - Температурно-временной режим амплификации ♦ № п/п Температурно-временной режим Число циклов 1 50 °С - 900 секунд 1 2 95 °С - 300 секунд 1 3 60 °С - 40 секунд Считывание сигнала флуоресценции 50 4 95 °С - 15 секунд - вводят сведения об образцах по всем красителям и активируют прибор в соответствии с руководством по эксплуатации; При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free». - набор реагентов извлекают из холодильника, РБ и ОКО перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 5 секунд при 3000 об-мин‘*; - помещают микропробирки в стрипах (РС-ЛХМ) в штатив типа «IsoF- reeze»** и маркируют в соответствии с протоколом исследования на боковой стенке пробирки; открывают крышки микропробирок и вносят в них по 15 мкл РБ; - используя наконечники с аэрозольным барьером, последовательно вно сят в микропробирки соответственно порядку исследования образцов по 20 мкл ОКО, око-в и далее по 20 мкл растворов исследуемых образцов в необходи мой повторности***, закрывают крышки данных микропробирок; - вносят в микропробирки соответственно маркировке по 20 мкл ПКО- ЛХМ, закрывают крышки данных микропробирок; - перемешивают содержимое микропробирок на вортексе и центрифуги руют 5 секунд при 3000 об-мин’'. **Примечание: До начала работы штатив рекомендуется охладить в бы товом холодильнике до температуры 2-8 °С ***Примечание: каждый образец рекомендуется анализировать в двух повторах. 14 --- стр. 38 --- ВНИМАНИЕ! После смешивания РС-ЛХМ, разбавителя и препарата РНК, микропробирки сразу установить в амплификатор и запустить ОТ- ПЦР-РВ. Помещают микропробирки в прибор в соответствии с протоколом иссле дования (таблица 2) и прикатывают крышки микропробирок; Таблица 2 - Порядок исследования образцов № ячейки Образец 1 пко-лхм 2 пко-лхм 3 око 4 око 5 око-в 6 око-в 7 исследуемый образец 1 8 исследуемый образец 1 9 исследуемый образец 2 10 исследуемый образец 2 11 - закрывают крышку прибора, запускают реакцию ОТ-ПЦР-РВ и фикси руют в рабочем журнале название файла с результатом работы прибора, рас четное время анализа^составляет в среднем 2 часа. 8.3 Процедура измерения и оценки результатов анализа Оценку результатов проводят с помощью приборов для ПЦР-РВ, напри мер, «АНК-32 (32М, 48)», СРХ-96 или эквивалентных им (см. п. 5.1 настоящей инструкции). Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции (регистрация роста сигнала) означает любую величину порогового цикла С1 менее 50. Отсутствие регистрации роста сигнала прибором описывается программой прибора, например, как величина порогового цикла (О >=50 в приборах АПК), либо как ее отсутствие (Х/А в приборах фирмы В1оКа(1) и т.п. Подробная информация приведена в руководстве по эксплуатации конкретного прибора. Кинетическая кривая роста сигнала флуоресценции по каналу ЕАМ, НбС либо КОХ относительно отрицательного контроля означает регистрацию роста 15 --- стр. 42 --- мая с прибором СРХ-96. Работу с программным обеспечением осуществляют согласно руководству по эксплуатации прибора. 10 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУ АТАЦИИ НАБОРА 10.1 Условия хранения набора В соответствии с ТУ 9398-003-46395995-2013 - в сухом, защищенном от света месте при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Суммарный срок хранения при температуре от плюс 9 до плюс 20 °С не должен превышать 14 суток в те чение срока годности набора реагентов. 10.2 Условия транспортирования набора Транспортирование набора реагентов «ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин- РВ» должно производиться в соответствии с ТУ 9398-003-46395995-2013 кры тым транспортом (автомобильным, железнодорожным либо воздушным) при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С. Допускается транспортирование до 14 су ток при температуре до плюс 20 °С. 10.3 Срок годности набора Срок годности набора реагентов составляет 12 месяцев с даты выпуска предприятием-изготовителем. Серии наборов реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежат. Срок годности вскрытых реагентов соот ветствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Срок годности разведенных препаратов ПКО-ЛХМ и ВПК-В-РНК не более месяца при температуре хранения не выше минус 20 °С. 10.4 Информация по безопасной утилизации Использование набора происходит в рабочей зоне 3-не подразумевающей контакта с биоматериалом (МУ 1.3.2569-09). Использованные наборы после анализа препаратов РНК собирают в пластиковые закрывающиеся емкости и выносят в рабочую зону 4-1 либо специально предназначенное вспомогатель ное помещение (МУ 1.3.2569-09) с целью последующей утилизации по классу Б (СанПиН 2.1.7.2790-10). 19 --- стр. 43 --- Наборы с истекшим сроком годности, а также в случае повреждения упа ковки, утилизируют по классу А (СанПиН 2.1.7.2790-10). 10.5 Гарантийные обязательства производителя Предприятие-производитель гарантирует соответствие функциональных характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и экс плуатационной документации, в течение установленного срока годности (12 месяцев) при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора реагентов «ОМ-Скрин- Ласса/Мачупо/Хунин-РВ» направлять на предприятие-изготовитель ЗАО «Син- тол» (127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, тел. (495) 984-69-93, факс. (499) 977-74-55 Е.таИ; 8уп1о1@8уп1о1.ш). При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по при менению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и меди цинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется напра вить сообщение на предприятие-изготовитель ЗАО «Синтол» по адресу, ука занному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую органи зацию в соответствии с действующим законодательством. --- стр. 44 --- Приложение РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОЙ АПРОБАЦИИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ «Набор реагентов для выявления и идентификации РНК вирусов Лаоса, Мачупо и Хунин методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Ласса/Мачупо/Хунин-РВ)» на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Всего было исследовано 64 пробы, содержащие вирус Мачупо, 32 пробы, содержащие вирус Ласса и 32 пробы, содержащие вирус Хунин; 64 пробы, содержащих одновременно вирусы Ласса, Мачупо и Хунин, а также 36 проб, содержащих штаммы гетерологичных вирусов (ви русы клещевого энцефалита, японского энцефалита, желтой лихорадки, денге. Западного Нила, лихорадки долины Рифт, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, бешенства. Эбо ла, Марбург, Хантаан, Пуумала) на двух сериях набора реагентов. Результаты приведены в таблице. Таблица 1 Образец Положи тельные об- разцы* Подтверждённые положительные образцы серия 010914 серия 130914 серия 270815 серия 250815 Данные по моделированию нагрузки проб вирусом Хунин Клеточные культуры (вируссодержащая жидкость), содержащие вирус Хунин 8 - - 8 8 Кровь, содержащая вирус Хунин 8 - - 8 8 Пробы окружающей среды, содержащие вирус Хунин 8 - - 8 8 Пробы суспензии органов, содержащих вирус Хунин 8 - - 8 8 Итого проб, содержащих вирус Хунин 32 - - 32 32 Данные по моделированию нагрузки проб вирусом Мачупо Клеточные культуры (вируссодержащая жидкость), содержащие вирус Мачупо 16 16 _16 - - Кровь, содержащая вирус Мачупо 16 16 16 - - Пробы окружающей среды, содержащие вирус Мачупо 16 16 16 - - Пробы суспензии органов, содержащих вирус Мачупо 16 16 16 - - Итого проб, содержащих вирус Мачупо 64 64 64 - - Данные по моделированию нагрузки проб вирусом Ласса Клеточные культуры (вируссодержащая жидкость), содержащие вирус Ласса 8 8 8 - - Кровь, содержащая вирус Ласса 8 8 8 - - Пробы окружающей среды, содержащие вирус Ласса 8 8 8 - - Пробы суспензии органов, содержащих вирус Ласса 8 8 ^ -О О - - Итого проб, содержащих вирус Ласса 32 32 32 - - * Согласно интерпретации результатов инструкции по применению 21