Набор реагентов для определения профиля экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета с целью оценки локального воспаления нижних отделов женского репродуктивного тракта методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ИммуноКвантэкс C/V) по ТУ 9398-079-46482062-2015 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 4 --- ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 4 ИммуноКвантэкс ZN Листов 24 Соответственно, Индекс воспаления в общем виде может быть представлен как вероятность наличия у пациентки воспаления при полученном соотношении уровня транскриптов и вычисляется по формуле (1): р=1/(1+е'^) (1), где р - вероятность принадлежности наблюдения к определенному классу при полученном значении функции ъ \ е - основание натуральных логарифмов; ъ - классифицирующая дискриминантная функция вида: у = а + Ы*Х1 + Ь2*Х2+ ...+ Ьп*Хп (2), где а - некоторая константа; XI - независимые переменные (предикторы); Ь 1 - коэффициенты. Все молекулярно-генетические маркеры, используемые в клинической лабораторной диагностике воспалительных заболеваний нижних отделов женского репродуктивного тракта (транскрипты генов иммунной системы и нуклеиновые кислоты инфекционных агентов) могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием единого метода - полимеразной цепной реакции, что позволяет сократить время диагностики, и снизить нагрузку на лабораторию. --- стр. 5 --- ^ ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 5 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 1 НАЗНАЧЕНИЕ 1.1. Настоящая инструкция распространяется на Набор реагентов для определения профиля экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета с целью оценки локального воспаления нижних отделов женского репродуктивного тракта методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ИммуноКвантэкс С/У). 1.2. Набор реагентов ИммуноКвантэке С/У предназначен для определения профиля экспресеии мРНК генов врожденного иммунитета в соскобе эпителиальных клеток нижних отделов женского репродуктивного тракта с целью оценки локального воепаления методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием детектирующих амплификаторов. 1.3. В качестве биологического материала используют соскобы эпителиальных клеток заднебокового свода влагалища и цервикального канала. 1.4. Набор может быть использован в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений и научно-исследовательской практике. 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1. Принцип действия Принцип метода ОТ-ПЦР (полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) основан на использовании процесса обратной транскрипции РНК и последующей амплификации кДНК, заключающейея в повторяющихся циклах; температурной денатурации кДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров Тац-полимеразой. Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки. В реакционную смееь для проведения ПЦР введены ДНК-зонды, каждый из которых несёт флуоресцентную метку и гаеитель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуореецентную метку прекращается, что ведёт к возрастанию уровня --- стр. 6 --- ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 6 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) увеличивается пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов, и измеряется на каждом цикле амплификации в режиме реального времени. Для анализа продуктов ПЦР используют детектирующий амплификатор. ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой кДНК, помечены флуоресцентной меткой РАМ. В таблице 1 представлен перечень выявляемых мРНК генов, канал детекции продуктов амплификации и цветовая кодировка для набора реагентов ИммуноКвантэксСЛ/. Таблица 1 - Перечень выявляемых мРНК генов, каналы детекции продуктов амплификации и цветовая кодировка для набора реагентов N пробирки в Стрипе Канал детекции Цвет смеси /парафина*Раш Нех Кох Су5 1 1ЫВ - - - Г олубой/белый 2 1Ы0 - - - Бесцветный/белый 3 1Ы8 - - - 4 ТНРА - - - 5 ТРК4 - маркер - 6 ОАТАЗ - - - 7 СП68 - - - 8 В2М - - - Парафин присутствует только в пробирках со смесью для амплификации фасовки 5 В определенную пробирку набора реагентов добавлен олигонуклеотид с флуоресцентной меткой Кох - «Маркер». Он используется прибором как маркер определения положения стрипа в термоблоке. После прохождения амплификации программное обеспечение детектирующего амплификатора сравнивает заданное оператором расположение пробирок с реальным положением маркера, и, если находит несовпадение, то предупреждает оператора о несоответствии. Исследование с использованием набора состоит из следующих этапов: выделение нуклеиновых кислот (пробоподготовка); реакция обратной транскрипции; ПЦР-амплификация кДНК в режиме реального времени. --- стр. 7 --- ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 7 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 в основе оценки лежит метод сравнения индикаторных циклов иееледуемых цитокинов (АСр). Экспреесия мРНК цитокинов измеряется в относительных единицах и отражает соотношение уровня представленности транскриптов. Вывод о наличии локальной воспалительной реакции оеновывается на значении Индекса воспаления, который вычисляетея программным обеспечением детектирующего амплификатора в автоматичееком режиме. Для исключения ложноотрицательных результатов учитывается показатель амплификации кДНК гена В2М. Праймеры и ДНК-зонды подобраны с учетом структуры генов, кодирующих мРНК цитокинов, и не дают положительного результата на матрице геномной ДНК. 2.2 Состав набора Набор реагентов ИммуноКвантэкс С/У выпуекается в следующих фасовках: стандартная (маркируется - 8), для автоматизированного дозирования (маркируется - А). Набор реагентов в стандартной фасовке раеечитан на 24 определения, в фасовке для автоматизированного дозирования на 48 определений. По запросу потребителей допускается сокращенная комплектация смееей для амплификации с соответствующей маркировкой на упаковке. Таблица 2 - Вариант фасовки компонентов набора реагентов ИммуноКвантэке СА^ Стандартная фасовка (8) Наименование компонентов Количество пробирок Номинальное количество компонента ИммуноКвантэкс СР^ Праймеры ОТ+дНТФ 1 пробирка 50 мкл ОТ-буфер 1 пробирка 200 мкл Обратная транскриптаза 1 пробирка 25 мкл Смеси для амплификации, запечатанные парафином 24 стрипа по 8 пробирок по 20 мкл Т aq-пoлимepaзa 2 пробирки по 50 мкл ПЦР-буфер 4 пробирки по 500 мкл Минеральное масло 4 пробирки по 1,0 мл --- стр. 8 --- ^ ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 8 ИммуноКвантэкс C/V Листов 24 Положительный контрольный образец 1 пробирка 150 мкл Количество определений, шт. 24 Принадлежности: Крышки для Стрипов 24 шт. Фасовка для автоматизированного дозирования (А) Наименование компонентов Количество пробирок Номинальное количество компонента ИммуноКвантэкс Праймеры ОТ+дНТФ 1 пробирка 50 мкл ОТ-буфер 1 пробирка 200 мкл Обратная транскриптаза 1 пробирка 25 мкл Смесь для амплификации Стрим 2 стрипа по 8 пробирок по 140 мкл ПЦР-буфер Стрим 2 пробирки по 600 мкл Полимераза TexHoTaq МАХ 2 пробирки по 60 мкл Буфер для разведения ДНК 4 пробирки по 1,0 мл Положительный контрольный образец 2 пробирки по 100 мкл Количество определений, шт. 48 Принадлежности: Стрпы по 8 пробирок Крышки для стрипов 10 шт. 2 шт. Примечание - Приведена фасовка для использования дозирующего устройства ДТстрим (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) для дальнейшего проведения ПЦР на детектирующем амплификаторе «ДТпрайм» (384 лунки) (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). В таблице указаны номинальные количества компонентов, фасовка производится с 10-20 % (индивидуально для каждого компонента) превышением от номинального в соответствии с действующей версией производственного регламента №41. 2.3 время проведения анализа - от 5 ч (е учётом пробоподготовки). --- стр. 9 --- ^Д Н К -ТЕХН О Л О ГИ Я Инструкция по применению Лист 9 ИммуноКвантэкс C/V Листов 24 3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА 3.1 Специфичность анализа В таблице 3 приведен перечень мРНК генов, выявляемых с помощью набора реагентов ИммуноКвантэкс С/У. Таблица 3 - Перечень мРНК генов, выявляемых с помощью набора реагентов ИммуноКвантэкс С/У Номер пробирки в Стрипе 1 2 3 4 5 6 7 8 Наименование мРНК гена 1L1B 1L10 1L18 TNFA TLR4 GATA3 CD68 В2М В образцах биологического материала человека, содержащих мРНК исследуемого цитокина, после заверщения реакции амплификации программное обеспечение для детектирующих амплификаторов определяет индикаторный цикл и соотношение концентраций транскриптов. В образцах биологического материала человека, содержащих геномную ДНК человека и не содержающих мРНК исследуемых цитокинов, после завершения реакции амплификации программное обеспечение определяет отрицательный результат исследования. Диагностическая (клиническая) специфичность выявления локальной воспалительной реакции составляет более 94 % [100,0 (94-100) %]. 3.2 Чувствительность анализа Аналитическая чувствительность набора реагентов составляет 1000 копий/мл. Для определения уровня экспрессии всех генов количество мРНК гена В2М должно быть не менее 10000 ГЭ/мл (что соответствует показанию прибора 4,0 lg). При меньшем количестве результат определения уровня экспрессии всех генов считается недостоверным. Диагностическая (клиническая) чувствительность выявления локальной воспалительной реакции составляет более 90 % [100,0 (90,3-100) %]. --- стр. 10 --- ^ ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 10 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно биологические (ПЦР) исследования клинического материала с соблюдением методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У групп патогенности» и с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами Ш-1У групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Исследуемые образцы рассматриваются как потенциально-опасные. При работе с набором следует надевать одноразовые перчатки без талька. Использовать только новые наконечники и пробирки. Приготовление реакционной смеси следует проводить в ПЦР-боксах. Этап ПЦР в реальном времени следует проводить в помещении, снабженном комплектами полуавтоматических или автоматических дозаторов, халатами и прочими принадлежностями. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, штативы, лабораторная посуда, халаты, головные уборы и пр., а также растворы реагентов должны быть строго стационарными. Запрещается их перемещение из одного помещения в другое. Лабораторное оборудование и принадлежности, которые используются при работе с набором, должны быть соответствующим образом поверены (в аккредитованных лабораториях), маркированы и храниться отдельно. Поверхности рабочих столов, а также помещений, в которых проводится ПЦР, следует обязательно, до и после проведения работ, облучать бактерицидными облучателями в течение одного часа. Использованные одноразовые принадлежности (пробирки, наконечники) должны сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Утилизировать неиспользованные реактивы, реагенты с истекшим сроком годности, а также использованные реагенты и биологический материал 10 --- стр. 11 --- ^Д Н К -ТЕХН О Л О ГИ Я Инструкция по применению Лист 11 ИммуноКвантэкс СЛ/ Листов 24 необходимо в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно- эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». Не использовать набор реагентов; - при нарушении условий транспортирования и хранения; - при несоответствии внешнего вида реагентов, указанному в паспорте к набору; - при нарушении внутренней упаковки компонентов набора; - по истечении срока годности набора. Примечание - Набор реагентов не содержит материалы биологического происхождения, веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным действием, а также влияющих на репродуктивную функцию человека. При использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности является безопасным. 11 --- стр. 12 --- ^ ЛНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 12 ИммуноКвантэкс C/V Листов 24 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ При работе с набором реагентов необходимо оборудование и материалы, приведенные в таблице 4. Таблица 4 - Материалы, оборудование и реагенты Оборудование и материалы Вариант фасовки S А ПЦР-бокс, ООО НПО ДНК-Технология, Россия или аналогичный да да детектирующий амплификатор со специализированным программным обеспечением, например ДТпрайм, ООО НПО ДНК-Технология, Россия или аналогичный да да устройство дозирующее, например ДТстрим ООО НПО ДНК- Технология, Россия или аналогичное нет да устройство герметизирующее, например ДТпак ООО НПО ДНК- Технология, Россия или аналогичное нет да холодильник бытовой с морозильной камерой, например Стинол, Россия или аналогичный да да микроцентрифуга-вортекс, например В1о8апЛатвия, или аналогичная да да термостат твердотельный, поддерживающий температуру до 100°С, например «ТТ-1-“ДНК-Техн.”», ООО НПО ДНК- Технология, Россия или аналогичный да да центрифуга для микропробирок, 13000 g, например Eppendorf, Германия или аналогичная да нет центрифуга для микропланшет ПЦР (384 лунки), например Eppendorf, Г ермания или аналогичная нет да дозаторы переменного объема со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2,0-20 мкл, 10-100 мкл, 100-1000 мкл, например Eppendorf, Германия или аналогичные да нет дозаторы переменного объема со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 20-200 мкл, например Eppendorf, Г ермания или аналогичные нет да наконечники с фильтром, свободные от РНКаз и ДНКаз 100- 1000 мкл, например Axygen, США или аналогичные да нет наконечники вместимостью 1,0-200 мкл, 100-1000 мкл, например Axygen, США или аналогичные да да микропланшет ПЦР (384 лунки), например 4titude LTD или аналогичный нет да полимерная термопленка для запаивания микропланшета нет да перчатки одноразовые, без талька да да штатив «рабочее место» для стрипованных пробирок объёмом 0,2 мл, например ООО НПО ДНК-Технология, Россия да да ёмкость с дезинфицирующим раствором для сброса использованных наконечников, пробирок и других расходных материалов да да комплект для вьщеления ДНК из биологического материала (рекомендуется ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС, ООО НПО ДНК-Технология, ООО ДНК-Технология ТС, Россия да да программное обеспечение для амплификаторов детектирующих да да ini файл с параметрами анализа да да 12 --- стр. 13 --- Инструкция по применению Лист 13 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ В качестве биологического материала используют соскобы эпителиальных клеток заднебокового свода влагалища и цервикального канала. Взятие образцов (соскобов). Взятие соскобов проводится стерильным одноразовым зондом в пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл, которые содержат 500 мкл лизирующего раствора ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС, ООО «НПО ДНК-Технология». Ограничение метода - местное применение лекарственных препаратов, УЗИ вагинальным датчиком менее чем за 24 часа до исследования. Предобработку, пробоподготовку и хранение материала проводят в соответствии с инструкцией к комплекту реагентов для выделения ДНК из биологического материала. Рекомендуемые комплекты для выделения ДНК из биологического материала: ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС. 7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1 Подготовка и проведение обратной транскрипции. 7.1.1 Промаркируйте для каждого исследуемого образца и отрицательного контрольного образца К- по одной пробирке объёмом 0,5 мл. 7.1.2 Разморозъте содержимое пробирок ОТ-буфер и ИммуноКвантэкс СА^ Праймеры ОТ + дНТФ для обратной транскрипции при комнатной температуре от 18 °С до 25 °С, затем встряхните пробирки в течение 3-5 с и центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 3-5 с на микроцентрифуге-вортексе. 7.1.3 Приготовъте ОТ-смесь. Смещайте в отделъной пробирке: 4.0 X (N+1) мкл буферного раствора ОТ-буфер, 2.0 X (N+1) мкл праймеров ИммуноКвантэкс С/У Праймеры ОТ + дНТФ, 1.0 X (N+1) мкл обратной транскриптазы, где N - количество анализируемых образцов с учётом К-. 7.1.4 Встряхните пробирку с ОТ-смесъю на вортексе и центрифугируйте при 1000 - 3000 об/мин в течение 3-5 с. 13 --- стр. 16 --- Л днк-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 16 ИммуноКвантэкс C/V Листов 24 7.2.11 Установите все етрипы в амплификатор детектирующий. Рекомендуетея раеполагать пробирки по центру термоблока. 7.2.12 Запуетите программное обеепечение в режиме «Работа с прибором». При первом проведении ПЦР загрузите файл «ИммуноКвантэкс C/V .ini». При последующих постановках добавьте в протокол тест «ИммуноКвантэкс C/V», укажите количеетво и идентификаторы образцов, в том чиеле отрицательного и положительного контрольных образцов, отметьте расположение стрипов на матрице термоблока в соответетвии е их уетановкой и проведите ПЦР. 7.3 Подготовка и проведение ПЦР. Фасовка А (для автоматизированного дозирования^). 7.3.1 Центрифугируйте етрипы со смесями для амплификации Стрим в течение 1-3 с на микроцентрифуге-вортекее. 7.3.2 Встряхните пробирки е ПЦР-буфером Стрим и полимеразой TexHoTaq МАХ в течение 3-5 с и центрифугируйте в течение 1-3 е на микроцентрифуге-вортекее. Примечание - Полимеразу TexHoTaq МАХ следует доставать из морозильника непосредственно перед использованием. 7.3.3 Добавьте в пробирку с ПЦР-буфером Стрим вее содержимое второй пробирки с ПЦР-буфером Стрим и двух пробирок с полимеразой TexHoTaq МАХ. Закройте крышку пробирки. 7.3.4 Ветряхните пробирку со смесью ПЦР-буфера Стрим и полимеразой TexHoTaq МАХ в течение 3-5 е и центрифугируйте в течение 1-3 е на микроцентрифуге-вортекее. Примечание - смесь ПЦР-буфера Стрим и полимеразы TexHoTaq МАХ следует готовить непосредственно перед использованием, хранение смеси не допускается. на примере использования дозирующего устройства ДТстрим (ООО «НПО ДНК- Технология», Россия) для дальнейшего проведения ПЦР на детектирующем амплификаторе. 16 --- стр. 17 --- , ^ ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 17 ИммуноКвантэкс C/V Листов 24 7.3.5 Внесите аккуратно, без образования воздушных пузырей, в восемь пробирок пустого стрипа, полученного в наборе, по 140 мкл смеси ПЦР-буфера Стрим и полимеразы TexHoTaq МАХ. 7.3.6 Промаркируйте пустые стрипы, полученные в наборе. 7.3.7 Внесите в каждую пробирку стрипов по 100 мкл буфера для разведения ДНК. 7.3.8 Добавьте аккуратно, без образования воздушных пузырей, в соответствуюшие пробирки стрипов с буфером для разведения ДНК по 40 мкл анализируемых образцов. К- и К+. 7.3.9 Установите стрипы со смесями для амплификации Стрим, со смесью ПЦР-буфера Стрим и полимеразы TexHoTaq МАХ, с разведенными образцами. К- и К+, а так же пустые стрипы, микропланшет для ПЦР (384 лунки) на рабочий стол ДТстрим и проведите дозирование компонентов согласно руководству по эксплуатации. 7.3.10 После завершения программы на дозируюшем устройстве ДТстрим аккуратно переместите, не встряхивая, микропланшет в подложку герметизируюшего устройства ДТпак. 7.3.11 Проведите процедуру запечатывания микропланшета термопленкой согласно инструкции к прибору ДТпак. 7.3.12 Центрифугируйте микропланшет при 1000 об/мин в течение 30 с. 7.3.13 Установите микропланшет в блок детектирующего амплификатора «ДТпрайм» (384 лунки), заполните протокол, используя параметр «Тест» в программном обеспечении для детектирующего амплификатора, укажите идентификаторы образцов. Примечание - Для создания теста и проведения ПЦР должен быть загружен 1ш - файл «ИммуноКвантэкс», поставляемый производителем. 7.3.14 Запустите программу детектирующего амплификатора, согласно руководству по эксплуатации. 17 --- стр. 18 --- ^ ^ ЛНК-ТЕХИОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 18 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 8 РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АМПЛИФИКАЦИИ Регистрация сигнала флуоресценции проводится прибором автоматически во время амплификации. Детекция и учёт результатов осуществляется амплификатором детектирующим автоматически. После окончания программы амплификации на экране появится соответствующее информационное сообщение и будет предложено перейти к анализу результатов (и. 4.6 части 1 («Работа с прибором») Руководства по эксплуатации для амплификаторов детектирующих). Анализ проводится программным обеспечением. На графике будет отображена зависимость флуоресценции от номера цикла для каждой пробирки в термоблоке. В таблице будет показан идентификатор образца, название исследования, индикаторный цикл (Ср) для каждой пробирки, указана концентрация мРНК гена В2М (lg ГЭ/мл), рассчитаны отношения уровня экспрессии генов. По результатам анализа можно сформировать и распечатать отчёт, содержащий Индекс воспаления для каждого исследуемого образца. 9 УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ 9.3 Учёт и интерпретация результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставляемого с амплификатором детектирующим. 9.4 После прохождения амплификации программное обеспечение сравнивает заданное оператором расположение пробирок с реальным положением маркера (флуоресцентной метки Кох), и, если находит несовпадение, то предупреждает оператора об этом. Оператору следует либо расположить данные из каждой отдельной пробирки в соответствующем порядке вручную, либо повторить исследование данного образца, правильно расположив пробирки в термоблоке. 18 --- стр. 22 --- г Л днк-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению ИммуноКвантэкс C/V Лист 22 Листов 24 14 ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1 . Пестрикова Т. Ю., Юрасов И.В., Юрасова Е.А. Воспалительные заболевания в гинекологии. / Москва: Литтерра, 2009. 256 с. 2. Hakakha М. М., Davis J., Korst L. М., Silverman N. S. Leukorrhea and baeterial vaginosis as in-office predietors of cervieal infeetion in high-risk women. // Obstetries and gyneeology. 2002. Vol. 100. №4. P. 808-812. 3. Lazenby G. B., Soper D. E., Nolle F. S. Correlation of leukorrhea and Triehomonas vaginalis infeetion. // Journal of clinieal mierobiology. 2013. Vol. 51. № 7. P. 2323-2327. 4. Бурменская O.B. Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воепалительных заболеваниях органов женской репродуктивной еиетемы. Диееертация на соиекание ученой степени доктора биологичееких наук / Москва, 2014. 249 с. 5. Pérou С.М., Sorlie T., Eisen М.В. et al. Moleeular portraits of human breast tumours // Nature. 2000.Vol. 406 (6797).P. 747-752. 6. Sehena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray // Science. 1995. Vol. 270 (5235). P. 467-470. 7. Sorlie T., Pérou C.M., Tibshirani R. et al. Gene expression patterns of breast earcinomas distinguish tumor subelasses with clinieal implieations // Proc Natl AeadSci U S A.2OOI.V0I. 98 (19). P. 10869-10874. 8. Sorlie T.,Tibshirani R., Parker J. et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. // Proc Natl AcadSci USA. 2003. Vol. 100(14). P. 8418-8423. 22 --- стр. 23 --- ^ ^ ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 23 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 Символы, используемые при маркировке набора ||У 0 | Только для 1пу1 1г о диагностики X Температурный диапазон V Количество определений Годен до | ю т | Серия набора Дата производства □а Содержит инструкцию по применению |ЯЕР| Каталожный номер ш Л Адрес производителя Не допускается воздействие солнечного света 23 --- стр. 24 --- г к ^ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 24 ИммуноКвантэкс C/V Листов 24 По вопросам, касающимся качества наборов реагентов ИммуноКвантэкс СА^ следует обращаться к официальному представителю производителя по адресу: ООО «ДНК-Технология», 117587, г. Москва, Варшавское шоссе, д. 125 ж, к.6. тел./факс +7 (495) 980-45-55, www.dna-technology.ru Служба клиентской поддержки: 8 800 200-75-15 (звонок по Роееии бееплатный), E-mail: hotline@dna-technologv.ru Анкета для осуществления обратной связи находится на сайте компании «ДНК- Технология»: http://www.dna-technology.ru/customer_support/ Ведущий научный сотрудник ООО «НПФ ДНК-Технология», д.б.н. О.В. Бурменская « f / » 2016г. СОГЛАСОВАНО Директор ФГБУ «НЦАГиП. им. В.И. Кулакова» Минздрав: академик РАМН, профессор ; Г О Х Р А н р > Г.Т. Сухих « » 0 ^ 2015г. Инструкция №004т-2 24 --- стр. 31 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 6 ИммуноКвантэкс СЛ/ Листов 24 1 в определенную пробирку набора реагентов добавлен олигонуклеотид с флуоресцентной меткой Кох - «Маркер». Он используется прибором как маркер определения положения стрипа в планшете. После прохождения амплификации программное обеспечение детектирующего амплификатора сравнивает заданное оператором расположение пробирок с реальным положением маркера, и, если находит несовпадение, то предупреждает оператора о несоответствии. Исследование с использованием набора состоит из следующих этапов: выделение нуклеиновых кислот (пробоподготовка); реакция обратной транскрипции; ПЦР-амплификация кДНК в режиме реального времени. В основе оценки лежит метод сравнения индикаторных циклов исследуемых цитокинов (АСр). Экспрессия мРНК цитокинов измеряется в относительных единицах и отражает соотношение уровня представленности транскриптов. Заключение о наличии локальной воспалительной реакции проводится на основании расчета значения Индекса воспаления', проводимом программным обеспечением детектирую щ его амплификатора в автоматическом режиме. Для оценки валидности полученных результатов учитывается показатель амплификации кДНК референсного гена В2М. Праймеры и ДНК-зонды подобраны с учетом структуры генов, кодирующих мРНК цитокинов, и не даю т положительного результата на матрице геномной ДНК. математической точки зрения Индекс воспаления является значением граничной функции соотношений уровней представленности транскриптов ключевых генов. Общее назначение данной функции состоит в анализе связи между несколькими независимыми переменными. Значением функции является вероятность того, что полученный профиль экспрессии соответствует профилю экспрессии при воспалении. Для вычисления Индекса воспаления используется метод бинарной логистической регрессии. --- стр. 32 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 7 ИммуноКвантэкс СА/ Листов 24 2.2 Состав набора Набор реагентов ИммуноКвантэкс С/У выпуекается в следующих фасовках: стандартная (маркируется - 8), для автоматизированного дозирования (маркируется ~ А). Набор реагентов в стандартной фасовке рассчитан на 24 определения, в фасовке для автоматизированного дозирования на 48 определений. По запросу потребителей допускается комплектация сокращенного наименования смесей для амплификации с соответствующей маркировкой на упаковке. Таблица 2-Вариацт фасовки компонентов набора реагентов ИммуноКвантэкс С/У Стандартная фасовка(S) Наименование компонентов Количество пробирок Номинальное количество компонента ИммуноКвантэкс С/У Праймеры ОТ+дНТФ 1 пробирка 50 мкл ОТ-буфер 1 пробирка 200 мкл Обратная транскриптаза 1 пробирка 25 мкл Смеси для амплификации, запечатанные парафином 24 стрипа по 8 пробирок по 20 мкл Тац-полимераза 2 пробирка по 50 мкл ПЦР-буфер 4 пробирки по 500 мкл Минеральное масло 4 пробирки по 1,0 мл Положительный контрольный образец 1 пробирка 150 мкл Количество определений, шт. 24 Принадлежности: Крышки для стрипов 24 шт. Фасовка для автоматизированного дозирования (А) Наименование компонентов Количество пробирок Номинальное количество компонента ИммуноКвантэкс C/V Праймеры ОТ+дНТФ 1 пробирка 50 мкл ОТ-буфер 1 пробирка 200 мкл Обратная транскриптаза 1 пробирка 25 мкл Смесь для амплификации Стрим 2 стрипа по 8 пробирок по 140 мкл ПЦР-буфер Стрим 2 пробирки по 600 мкл Полимераза TexHoTaq МАХ 2 пробирки по 60 мкл Буфер для разведения ДНК 4 пробирки по 1,0 мл Положительный контрольный образец 2 пробирки по 100 мкл --- стр. 33 --- ДНК-ТЕХНОЛОГИЯ Инструкция по применению Лист 8 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 Количество определений, шт. 48 Принадлежности: Стрпы по 8 пробирок Крышки для стрипов 10 шт. 2 шт. Примечание - Приведена фасовка для использования дозирующего устройства ДТстрим (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) для дальнейшего проведения ПЦР на детектирующем амплификаторе «ДТпрайм» (384 лунки) (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). В таблице указаны номинальные количества компонентов, фасовка производится с 10-20% (индивидуально для каждого компонента) превышением от номинального в соответствии с действующей версией производственного регламента № 41.___________________________________________ 2.2. Время Проведения анализа - от 5 ч (с учётом пробоподготовки). --- стр. 34 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 9 ИммуноКвантэкс СА/ Листов 24 3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА З Л Специфичность анализа В таблице 3 приведен перечень мРНК генов, выявляемых с помощью набора реагентов ИммуноКвантэкс С/У. Таблица 3 - Перечень мРНК генов, выявляемых с помощью набора реагентов ИммуноКвантэкс С/У. Номер пробирки в Стрипе 1 2 3 4 5 6 7 8 Наименование мРНК гена 1L1B 1L10 1L18 TNFA TLR4 GATA3 CD68 В2М В образцах биологического материала человека, содержащих мРНК исследуемого цитокина, после заверщения реакции амплификации программное обеспечение для детектирующих амплификаторов определяет индикаторный цикл и соотношение (индекс) концентраций транскриптов. В образцах биологического материала человека, содержащих геномную ДНК человека и не содержающих мРНК исследуемых цитокинов, после заверщения реакции амплификации программное обеспечение определяет отрицательный результат исследования. Диагностическая (клиническая) специфичность выявления локальной воспалительной реакции составляет 96,8 (88,8-99,6) %. 3 .2 Чувствительность анализа Аналитическая чувствительность набора реагентов составляет 1000 копий/мл. Для определения уровня экспрессии всех генов количество мРНК гена В2М должно быть не менее 10000 ГЭ/мл (что соответствует показанию прибора 4,0 1§). При меньщем количестве результат определения уровня экспрессии всех генов считается недостоверным. Диагностическая (клиническая) чувствительность выявления локальной воспалительной реакции составляет 100,0 (90,7-100) %. --- стр. 35 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 10 ИммуноКвантэкс СА/ Листов 24 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно биологические (ПЦР) исследования клинического материала с соблюдением методических указаний МУ ЕЗ.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У групп патогенности» и с соблюдением санитарно-эпидемиологических правил СП ЕЗ.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами ПМУ групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Исследуемые образцы рассматриваются как потенциально-опасные. При работе с набором следует надевать одноразовые перчатки без талька. Использовать только новые наконечники и пробирки. Приготовление реакционной смеси следует проводить в ПЦР-боксах. Этап ПЦР в реальном времени следует проводить в помещении, снабженном комплектами полуавтоматических или автоматических дозаторов, халатами и прочими принадлежностями. Все лабораторное оборудование, в том числе дозаторы, щтативы, лабораторная посуда, халаты, головные уборы и пр., а также растворы реагентов должны быть строго стационарными. Запрещается их перемещение из одного помещения в другое. Лабораторное оборудование и принадлежности, которые используются при работе с набором, должны быть соответствующим образом поверены (в аккредитованных лабораториях), маркированы и храниться отдельно. Поверхности рабочих столов, а также помещений, в которых проводится ПЦР, следует обязательно, до и после проведения работ, облучать бактерицидными облучателями в течение одного часа. Использованные одноразовые принадлежности (пробирки, наконечники) должны сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Утилизировать неиспользованные реактивы, реагенты с истекщим сроком годности, а также использованные реагенты и биологический материал --- стр. 36 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 11 ИммуноКвантэкс СА/ Листов 24 необходимо в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно- эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами». Не использовать набор реагентов: - при нарушении условий транспортирования и хранения; - при несоответствии внешнего вида реагентов, указанного в паспорте к набору; - при нарушении внутренней упаковки компонентов набора; - по истечению срока годности набора. Примечание - Набор реагентов не содержит материалы биологического происхождения, веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным действием, а также влияющих на репродуктивную функцию человека. При использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности является безопасным. --- стр. 37 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 12 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 5 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ При работе с набором реагентов необходимо оборудование и материалы, приведенные в таблице 4. Таблица 4 - Материалы, оборудование и реагенты Оборудование и материалы Вариант фасовки S А ПЦР-бокс да да детектирующий амплификатор «ДТпрайм» да да устройство дозирующее ДТстрим нет да устройство герметизирующее, например ДТпак нет да холодильник бытовой с морозильной камерой нет да микроцентрифуга-вортекс да да центрифуга для микропланщет ПЦР (384 лунки) нет да дозаторы переменного объема со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 2,0-20 мкл, 10-100 мкл да нет дозаторы переменного объема со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 20-200 мкл нет да наконечники вместимостью 1,0-20 мкл с фильтром, 100-1000 мкл да нет наконечники вместимостью 1,0-200 мкл, 100-1000 мкл да да микропланещт ПЦР (384 лунки) нет да полимерная термопленка для запаивания микропланшета нет да щтатив «рабочее место» для стрипованных пробирок объёмом 0,2 мл да да ёмкость с дезинфицирующим раствором для сброса использованных наконечников, пробирок и других расходных материалов да да комплект для выделения ДНК из биологического материала (рекомендуется ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС) да да программное обеспечение для амплификаторов детектирующих да да ini файл с параметрами анализа «ИммуноКвантексУ/С» да да --- стр. 38 --- т 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 13 ИммуноКвантэкс СА/ Листов 24 6 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ В качестве биологического материала используют соскобы эпителиальных клеток из заднебоковых сводов влагалища и цервикального канала. Ограничение метода - местное применение лекарственных препаратов, УЗИ вагинальным датчиком менее чем за 24 часа до исследования. Взятие, предобработку и хранение материала проводят в соответствии с инструкцией к комплекту реагентов для выделения ДНК из биологического материала. Рекомендуемые комплекты для выделения ДНК из биологического материала: ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС. Взятие образцов (соскобов). Взятие соскобов проводится стерильным одноразовым зондом в пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл, которые содержат 500 мкл лизирующего раствора ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС ООО «НПО ДНК-Технология». 7 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1 Подготовка и проведение обратной транскрипции. 7.1.1 Промаркируйте для каждого исследуемого образца и отрицательного контрольного образца К- по одной пробирке объёмом 0,5 мл. 7.1.2 Разморозъте содержимое пробирок ОТ-буфер и ИммуноКвантэкс С/У Праймеры ОТ + дНТФ для обратной транскрипции при комнатной температуре от 18 °С до 25 °С, затем встряхните пробирки в течение 3-5 с и центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 3-5 с на микроцентрифуге-вортексе. 7.1.3 Приготовьте ОТ-смесь. Смещайте в отдельной пробирке: 4.0 X (N+1) мкл буферного раствора ОТ-буфер, 2.0 X (N+1) мкл праймеров ИммуноКвантэкс С/У Праймеры ОТ + дНТФ, 1.0 X (N+1) мкл обратной транскриптазы, где N - количество анализируемых образцов с учётом К-. --- стр. 47 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция no применению Лист 22 ИммуноКвантэкс CN Листов 24 ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Е Пестрикова Т. Ю., Юрасов И.В., Юрасова Е.А. Воспалительные заболевания в гинекологии. / Москва: Литтерра, 2009. 256 с. 2. Hakakha М. М., Davis J., Korst L. М., Silverman N. S. Leukorrhea and bacterial vaginosis as in-office predictors of cervical infection in high-risk women. // Obstetrics and gynecology. 2002. Vol. 100. №4. P. 808-812. 3. Lazenby G. В., Soper D. E., Nolte F. S. Correlation of leukorrhea and Trichomonas vaginalis infection. // Journal of clinical microbiology. 2013. Vol. 51. J4 2 7. P.2323-2327. 4. Бурменская О.В. Молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук / Москва, 2014. 249 с. 5. Pérou С.М., Sorlie T., Eisen М.В. et al. Molecular portraits of human breast tumours // Nature. 2000.Vol. 406 (6797).P. 747-752. 6. Schena M., Shalon D., Davis R.W., Brown P.O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray // Science. 1995. Vol. 270 (5235). P. 467-470. 7. Sorlie T., Pérou C.M., Tibshirani R. et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications // Proc Natl AcadSci U S A. 2OOI.V0I. 98 (19). P. 10869-10874. 8. Sorlie T.,Tibshirani R., Parker J. et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. // Proc Natl AcadSci USA. 2003. Vol. 100(14). P. 8418-8423. --- стр. 48 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 23 ИммуноКвантэкс СА/ Листов 24 Символы, используемые при маркировке набора 1У0 Только для 1 пуТг о диагностики 1 Температурный диапазон V Количество определений 2 Годен до ют Серия набора Дата производства • ж Содержит инструкцию по применению |ЯЁ^ Каталожный номер ы Л Адрес производителя Не допускаетея воздейетвие солнечного света --- стр. 49 --- 7ДНК-ТЕХН0Л0ГИЯ Инструкция по применению Лист 24 ИммуноКвантэкс СЛ/ Листов 24 ( По вопросам, касающимся качества наборов ИммуноКвантэкс C/V следует обращатьея к официальному представителю производителя по адрееу: ООО «ДНК-Технология», 117587, г. Москва, Варшавское шосее, д. 125 ж, к.6, а/я 181, тел./факс +7 (495) 980-45-55, www.dna-technology.ru Служба клиентской поддержки; 8 800 200-75-15 (звонок по России бесплатный). E-mail: hotline@dna-technology.ru Анкета для осуществления обратной евязи находитея на еайте компании «ДНК-Технология»: www.dna-technology.ru/support Ведущий научный сотрудник ООО «НПФ ДНК-Технология», д.б.н. СОГЛАСОВАНО О-В- Бурменская » / О 2015г. Директор ФГБУ «НЦАГиП. им. В.И. Кулакова» Минздрава России, академик РАМН, профессор ь н и я" Инструкция №004m. --- стр. 50 --- Прошито и пронумеровано листов Директор ФГБУ «НЦАГиП им. Кулакова» Минздрава Р о сси и , академик РАМН, профессор --- стр. 51 --- I Ш РЖДЕНА Приказом Росздравнадзора от 201 г№ УТВЕРЖДАЮ Генеральньй директор 11 ЗАО «Н П «]^ ДНК-Технология» Д.Ю.Трофимов 2013 г. I ИНСТРУКЦИЯ I по применению набора реагентов для оценки локальной воспалительной реакции вдагалища методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Экспрессия генов. Воспаление влагалища) 1. НАЗНАЧЕНИЕ 1.1. Набор предназначен для оценки локальной воспалительной реакции во влагалище по профилю экспрессии мРНК генов человека в биологическом материале человека методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием детектирующих амплификаторов. 1.2. Набор может быть использован в клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений и научно-исследовательской практике. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1. Принцип действия Принцип метода основан на использовании процесса обратной транскрипции РНК и последующей амплификации кДНК, заключающейся в повторяющихся циклах; температурной денатурации кДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров Таа-полимеразой. ‘ в реакционную смесь для проведения ПЦР введены ДНК-зонды, каждый из которых несет флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя на флуоресцентную метку прекрагцается, что ведёт к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) пропорционально количеству образовавшихся специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле амплификациим в режиме реального времени. Для анализа продуктов ПЦР и^прдюуют детектирующий амплификатор. ДЬЖ-зонды, использующиеся для дете амплификации искомой кДНК, помечены флуоресцентными метками Р Исследование с использованием набора состоит из еле, выделение нуклеиновых кислот (пробоподготовка); pe^p^ия обратно ПЦР-амплификация кДНК в режиме реального времени’^ * П й Я ВЕРНА ГЕН. ДИРЕКТОР ДМИТРОВСКИЙ Л И Н Е .Н й Е «#срфищциг ■ г М о с к з д / * > ■•I 1'ЧчЧ | --- стр. 52 --- основе оценки лежит метод сравнения индикаторных циклов исследуемых 0ШОВ (метод дельта Си-пи (АСр)). Экспрессия мРНК цитокинов измеряется в ^(7сительных единицах и отражает соотношение уровня представленности Р^шскриптов. Заключение о вероятности локальной воспалительной реакции проводится на основании расчета значения канонической линейной дискриминантой функции, проводимом программным обеспечением детектируюш,его амплификатора в автоматическом режиме. Для исключения ложноотрицательных результатов учитывается показатель амплификации кДНК референсного гена В2М. Праймеры и ДНК-зонды подобраны с учетом структуры генов, кодирующих мРНК цитокинов, и не дают положительного результата на матрице геномной ДНК. Для повышения чувствительности и специфичности реакции предусмотрено применение «горячего» старта, который обеспечивается методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоёв, разделённых прослойкой из парафина. Смешение слоёв и превращение их в амплификационную смесь происходит только после плавления парафина, что исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки. 2.2. Состав набора Набор выпускается в стандартных комплектациях, также допускается оптовая фасовка реагентов для крупных лабораторий, фасовка для автоматических раскапывающих станций, в т.ч. для использования в пакетных исследованиях. В состав набора входят следующие компоненты; специфичные для определяемых генов смеси для амплификации, положительные контрольные образцы и вспомогательные реагенты. Набор в стандартных комплектациях рассчитан на 24 определения. По запросу потребителей возможна фасовка, рассчитанная на другое количество определений. Полный перечень генов, определяемых с помощью набора, приведен в таблице 1. По запросу потребителей возможна сокращенная комплектация набора. Варианты фасовок наборы приведены в таблице 2. Таблица 1. ПЕРЕЧЕНЬ ГЕНОВ, ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ С ПОМОЩЬЮ НАБОРА N пробирки в стрипе Канал детекции цвет смеси для амплификацииРаш Нех Рох Су5 1 1116 - - - голубой 2 1110 - - - бесцветный 3 1118 - - - 4 ТМРА - - - 5 Т 1 к 4 - маркер - 6 С А Т А З - - - 7 С068 - - - 8 В2М - - - Таблица 2. ВАРИАНТЫ ФАСОВОК РЕАГЕНТОВ Реагент Стандартная Сокращенная Фасовка для комплектация комплектация автоматических (на 24 определения) (фасовка на одно раскапывающих наименование на 48 станций, в т.ч. для определений)* пакетных --- стр. 53 --- ^ 7 исследований** а^Шесь для Нрплификации, И У ^алечатанная парафином 24 стрипа (по 8 пробирок) по 20 мкл 48 пробирок или 6 стрипов по 8 пробирок отсутствует Т[Смесъ для амплификации / Стрим отсутствует отсутствует 1 стрип (по 8 пробирок) по 140 мкл ОТ-буфер 1 пробирка (200 мкл) 1 пробирка (200 мкл) 1 пробирка (200 мкл) Обратная транскриптаза 1 пробирка (25 мкл) 1 пробирка (25 мкл) 1 пробирка (25 мкл) Праймеры ОТ+дНТФ 1 пробирка (50 мкл) 1 пробирка (50 мкл) 1 пробирка (50 мкл) ПЦР-буфер 4 пробирки (по 500 мкл)*** 500 мкл 1 пробирка*** отсутствует ПЦР-буфер Стрим отсутствует отсутствует 1 пробирка (1280 мкл) Т ац-АТ-полимераза Или отсутствует отсутствует 1 пробирка (120 мкл) Тац-полимераза Или 2 пробирки (по 50 мкл) 1 пробирка (50 мкл) отсутствует раствор Тац-полимеразы 4 пробирки (по 500 мкл) 1 пробирка (500 мкл) отсутствует Минеральное масло 4 пробирки (1,0 мл) 1 пробирка (1,0 мл) отсутствует Буфер для разведения ДНК отсутствует отсутствует 3 пробирки (по 1080 мкл) Положительный контрольный образец 1 пробирка (300 мкл) 1 пробирка (75 мкл) 1 пробирка 60 мкл Отрицательный контрольный образец (по запросу) 1 пробирка (300 мкл) 1 пробирка (75 мкл) 1 пробирка 60 мкл * - по запросу потребителей допускается комплектация сокращенного количества смесей для амплификации (менее 8 наименований) с соответствующей маркировкой упаковки, ** - приведена фасовка для раскапывания с использованием автоматической раскапывающей станции ДТстрим (ООО «НПО ДНК-Технология») для дальнейшего проведения ПЦР на амплификаторе ДТпрайм (на 384 лунки) (ООО «НПО ДЬЖ- Технология»). *** - включен в наборы с Тац-полимеразой. 2.3. Время проведения анализа - от 5 ч (с учётом пробоподготовки). 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА 3.1. Специфичность анализа В образцах биологического материала человека, содержащих мРНК исследуемого цитокина, после завершения реакции амплификации программное обеспечение для детектирующих амплификаторов определяет индикаторный цикл и соотношение (индекс) концентраций транскриптов. В образцах биологического материала человека, содержащих геномную ДНК человека и не содержающих мРНК исследуемых цитокинов, после завершения --- стр. 54 --- у^щии амплификации программное обеспечение определяет отрицательный Ьультат исследования. 1 2 . Чувствительность анализа Чувствительность анализа - 1 000 копий/мл. Для исключения ложноотрицательных результатов учитывается показатель амплификации мРНК референсного гена В2М. В2М - высокоэкспрессируемый ген во влагалищных мазках (средняя копийность 1,0*10^ копий/мл). Количество мРНК гена В2М должно быть не менее 1,0*10'^ копий/мл. При меньшем количестве результат определения уровня экспрессии всех генов считается недостоверным. 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Потенциальный риск применения набора - класс 26 (п.9.3.3 Приказа Минздрава России от 06.06.2012 N 4н). Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322- O S «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». При работе с набором следует соблюдать требования ГОСТ Р 529205-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности». Использованные одноразовые принадлежности (пробирки, наконечники) должны сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор. Удалять неиспользованные реактивы необходимо в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» и МУ 287-113 по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения. 5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ При работе с набором реагентов требуются следующие оборудование и материалы: амплификатор детектирующий со специализированным программным обеспечением; автоматическая раскапывающая станция (при использовании фасовки для АСР); микроцентрифу га/вортекс; холодильник бытовой; термостат твердотельный, поддерживающий температуры 50 °С и 65 °С; щтатив «рабочее место» для пробирок объёмом 1,5 мл; штатив «рабочее место» для стрипованных пробирок объёмом 0,2 мл; пробирки пластиковые объёмом 1,5 мл; --- стр. 55 --- пробирки вместимостью 200мкл стрипованные по 8шт. (при использовании фасовки для АСР); крышки для пробирок стрипованных (при использовании фасовки для АСР); пипетки полуавтоматические одноканальные с переменным объёмом, позволяющие отбирать объёмы жидкости 2-20 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл; одноразовые наконечники с фильтром для полуавтоматических пипеток, свободные от РНКаз и ДНКаз, объёмом 20 мкл, 200 мкл, 1000 мкл; одноразовые перчатки медицинские, без талька, текстурированные; контейнер с дезинфицирующим раствором для сброса использованных наконечников, пробирок и других расходных материалов; транспортная среда для биопроб (производство ООО «НПО ДНК- Технология») комплект для выделения ДНК из биологического материала (рекомендуется ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС производства ООО «НПО ДНК- Технология»). ini файл с параметрами анализа. 6.1. 6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ Для исследования у женщин используют соскобы эпителиальных клеток из влагалища (заднебоковые своды). Ограничение метода - применение местных противовоспалительных препаратов, УЗР1 вагинальным датчиком менее чем за 24 часа до исследования. Взятие, предобработку и хранение материала проводят в соответствии с инструкцией к комплекту реагентов для выделения ДНК из биологического материала. Рекомендуемые комплекты для выделения ДНК из биологического материала: ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС. Взятие образцов образцов урогенитальных соскобов Взятие соскобов из влагалища проводится стерильным одноразовым зондом в пластиковые пробирки объёмом 1,5 мл, которые содержат 500 мкл лизирующего раствора ПРОБА-МЧ, ПРОБА-НК-ПЛЮС ООО «НПО ДНК-Технология». отрицательного 7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1. Подготовка и проведение обратной транскрипции. 7.1.1. Промаркируйте для каждого исследуемого образца и контрольного образца «К-» по одной пробирке объёмом 0,5 мл. 7.1.2. Разморозьте содержимое пробирок «ОТ-буфер» и «Праймеры ОТ + дНТФ» из комплекта реагентов для обратной транскрипции при комнатной температуре (18- 25 °С), затем встряхните пробирки в течение 3-5 сек и центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 3-5 сек на микроцентрифуге/вортексе. --- стр. 56 --- приготовьте ОТ-смесь. Смешайте в отдельной пробирке: 4.0 X (N+1) мкл буферного раствора «ОТ-буфер», 2.0 X (N+1) мкл праймеров «Праймеры ОТ + дНТФ», 1.0 X (N+1) мкл обратной транскриптазы, где N - количество анализируемых образцов с учётом «К-». Встряхните пробирку на вортексе и центрифугируйте при 1000-3000 об/мин в течение 3-5 сек. Добавьте в промаркированные пробирки по 7,0 мкл ОТ-смеси. Внесите в пробирки с ОТ-смесью по 33 мкл соответствующего образца НК, используя отдельные наконечники для каждого образца. В пробирку «К-» НК не вносится. 7.1.7. В пробирку, маркированную «К-», внесите 33 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего этап выделения НК. Примечание: во избежание контаминации рекомендуется вносить образцы НК наконечниками с аэрозольными барьерами. 7.1.8. Встряхните пробирки на вортексе в течение 3-5 сек и осадите капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. 7.1.9. Поместите пробирки в термостат и инкубируйте при 40 °С в течение 30 мин, затем прогрейте при 95 °С в течение 5 мин. Примечание: рекомендуется использовать программируемые термостаты с прижимной крышкой (например «Гном» производства ООО «НПО ДНК- Технология») 7.1.10. 7.1.11. 7.2. 7.2.1. 7.2.2. 7.2.3. Осадите капли со стенок пробирок центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 сек. Добавьте к полученному препарату ДНК 60 мкл буфера для растворения из состава комплекта «ПРОБА-ЬЖ-ПЛЮС». Встряхните пробирки на вортексе в течение 3-5 сек и осадите капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 сек. Полученный препарат кДНК готов для проведения ПЦР. Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции (стандартная фасовка). Промаркируйте стрипы с запечатанной парафином смесью для амплификации для каждого исследуемого образца, положительного контрольного образца («К+») и отрицательного контрольного образца («К-»). Встряхните пробирки с ПЦР-буфером и Taq-пoлимepaзoй, затем центрифугируйте при 1000 об/мин в течение 1— 3 сек на микроцентрифуге/вортексе. Приготовьте смесь ПЦР-буфера с Taq-пoлимepaзoй. Смешайте в отдельной пробирке: • 80хП+10 мкл ПЦР-буфера, • 4хП+0,5 мкл Taq-пoлимepaзы, где N - количество анализируемых образцов с учётом «К-» и «К+».