Набор реагентов для идентификации штаммов Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Brucella - идентификация - РГФ)» по ТУ 9398-045-01898109-2013 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- УТВЕРЖДЕНА Приказом Росздравнадзора «УТВЕРЖДАЮ» Директор ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора от 20 г. № _________________Кутырев В.В. « » 201 г. 201 г. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ BRUCELLA SPP. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (ГЕН BRUCELLA - ИДЕНТИФИКАЦИЯ - РГФ) 1. НАЗНАЧЕНИЕ «Набор реагентов для идентификации штаммов Brucella spp. методог полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов режиме реального времени (Ген Brucella - идентификация - РГФ)», далее - набо реагентов «Ген Brucella - идентификация - РГФ», предназначен для идентификаци штаммов бруцелл, выделенных из биологического материала и объектов внешней среды определением принадлежности к видам В. abortus!В. ovis; В. melitensis; В. suis/B.canh B.neotomae методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентны учетом результатов в режиме реального времени. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1. Принцип действия. Для идентификации и определения видовой принадлежности 6pyuej исследования проводят с ПЦР-смесью-1 (содержит праймеры и зонды, специфичные генам BR0262 и ВМЕ0711) и ПЦР-смесью-2 (содержит праймеры и зонд, специфичные гену BRA0541). Реакцию амплификации осуществляют одновременно с каждой ПЦ смесью. Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. abortis и В. ovis осуществляют ] основании отсутствия амплификации с ПЦР-смесью-1 фрагмента гена BR0262 (кан; ^ З А М . ДИРЕКТОРА J п о ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ | И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ РАБОТЕ А- К Н и к и ф о р о в --- стр. 2 --- ROX), наличия амплификации гена ВМЕ0711 (канал JOE), наличия амплификации с ПЦР-смесью-2 фрагмента гена BRA0541 (канал JOE). Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. melitensis осуществляют на основании отсутствия амплификации фрагмента гена BR0262 (канал ROX), наличия амплификации гена ВМЕ0711 (канал JOE), отсутствия амплификации с ПЦР-смесью-2 фрагмента гена BRA0541 (канал JOE). Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. suis и В. canis осуществляют на основании наличия амплификации с ПЦР-смесью-1 фрагментов гена BR0262 (канал ROX) и гена ВМЕ0711 (канал JOE), наличия амплификации с ПЦР-смесью-2 фрагмента гена BRA0541 (канал JOE). Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. neotomae осуществляют на основании наличия амплификации с ПЦР-смесью-1 фрагмента гена BR0262 (канал ROX), отсутствия амплификации гена ВМЕ0711 (канал JOE), наличия амплификации с ПЦР- смесью-2 фрагмента гена BRA0541 (канал JOE). 2.2. Состав набора: Реактив Описание Объем (мл) Количество ПЦР-смёсь-1 прозрачная бесцветная жидкость, содержащая праймеры, зонды, дНТФ и натрия азид 0,15 1 пробирка ПЦР-смесь-2 прозрачная бесцветная жидкость, содержащая праймеры, зонды, дНТФ и натрия азид 0,15 1 пробирка ПЦР-смесь-3 прозрачная бесцветная жидкость, содержащая Трис-HCl; аммония сульфат; магния хлорид; Tween-20; натрия азид 0,6 1 пробирки Taq ДНК- полимераза прозрачная бесцветная жидкость, содержащая фермент с активностью 5 ед/мкл 0,012 1 пробирка ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость, содержащая трис-HCl; Naj-ЭДТА 1,0 1 пробирка Н20 прозрачная бесцветная жидкость, свободная от нуклеаз 5,0 2 пробирки ПКО ДНК Brucella прозрачная бесцветная жидкость, представляющая собой водный раствор ДНК В. suis 0,3 2 пробирки Набор реагентов «Ген Brucella - идентификация - РГФ» рассчитан на рассчитан на 30 определений, включая положительные и отрицательные контроли. « Д И Р Е К ТО Р А I d f П0 экспериментальной 'nn , *„ и, Производственной работе К. НИКИФОРОВ --- стр. 3 --- 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1. Специфичность. Набор «Ген Brucella - идентификация - РГФ» не должен давать положительных результатов с ДНК микроорганизмов других родов в концентрации ПК)4 м.к./мл. 3.2. Аналитическая чувствительность. Набор «Ген Brucella - идентификация - РГФ» должен идентифицировать штаммы бруцелл и определять их принадлежность к видам В. abortus!В. ovis; В. melitensis; В. suis/B.canis; B.neotomae при концентрации суспензий исследуемых культур не менее 1 х 104 м.к./мл. 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 4.1. Использование набора реагентов «Ген Brucella - идентификация - РГФ» с истекшим сроком годности недопустимо. 4.2. Работу проводят в соответствии с требованиями СП 13.1285 - 03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 1.3.2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». 4.3. Уничтожение наборов реагентов с истекшим сроком годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10. 5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ*: Наименование Основные характеристики или обозначения документации, производитель 1 2 Амплификатор «RotorGene 3000», «RotorGene 6000», "RotorGene Q" «Qiagen», Нидерланды Бокс абактериальной воздушной среды для работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР-"Ламинар-С" «Ламинарные системы», Россия Микроцентрифуга-встряхиватель «ТЭТА-2», «Биоком», Россия Штатив IsoFreeze на 0°С или термостат твердотельный с функцией охлаждения Штатив для пробирок 0,5 мл и 1,5-2 мл поддерживающий температуру 0°С в течени 5 часов, 20 лунок, «SSI», США или термоста с температурой от 4 до 120 °С, «Биокомх Россия Набор электронных или механических дозаторов переменного объема 0,5-10 мкл, 10-100 мкл, 100-1000 мкл, Biohi Финляндия Штатив-подставка для дозаторов Универсальная на 5 дозаторов, «Хеликош Россия Наконечники универсальные для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 10 мкл В штативе, «Axygen», США Наконечники универсальные для В штативе, «Axyg/Ы», США \ , V t>W M E H T M lbHOft ЛГ1З8ОДСТВЕ8НОЙ РАБО ТЕ --- стр. 4 --- дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 100 мкл Наконечники универсальные для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 1000 мкл В штативе, «Axygen», США Штатив «рабочее место» для микропробирок на 0,2 мл 10x20 мест, «Хеликон», Россия Тонкостенные пробирки для ПЦР с плоской крышкой объемом 0,2 мл «Axygen», США Микроцентрифужные пробирки объемом 0,6 мл «Axygen», США Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл «Axygen», США Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой и не выше минус 18 °С «Атлант», Россия Емкость (для сброса отработанных расходных материалов) «Гем», Россия Одноразовый халат Халат медицинский стандартного покро плотность ткани 42 г/м2, «Здравмедтехника Россия Одноразовые перчатки Перчатки смотровые, текстурированны неопудренные «Sempercare», Германия * Примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим характеристикам не уступающего рекомендуемому. 6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ Материалом для исследования служат: суспензии культур, выделенных г биологического материала и объектов внешней среды, предварительн идентифицированных как Brucella spp. на основании изучения морфометрически) биохимических, серологических свойств или ПЦР-исследования с помощью наборо реагентов «ГенБру» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») и «АмплиСенс Brucella spp. - FL (ООО ИнтерЛабСервис). Из культур бруцелл готовят суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого п отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-2? 85-П (ЮМЕ)), что соответствует 1,7x109 м.к./мл для Brucella spp. 7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА ПЦР-анализ состоит из следующих этапов: обеззараживание материала, выделени М. ДИРЕКТОРА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ДНК; амплификация, регистрация и учет результатов И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ А - К-Никифоров РАБОТЕ7Л Обеззараживание материала: Материал обеззараживают в соответствии с Л/ПМ .3.2569 -09 «Организация работь лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». --- стр. 5 --- Бактериальные суспензии бруцелл в объеме 1 мл переносят в микроцентрифужш пробирки объемом 1,5 мл, добавляют натрия мертиолят до концентрации 1:10000 (0,01? и прогревают при (56±1) °С в течение 30 минут. Затем в отдельные микроцентрифужш пробирки объемом 1,5 мл переносят по 100 мкл обработанной мертиолятом натр: бактериальной суспензии бруцелл, добавляют лизирующий буфер на основе 6 гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения ДН и инкубируют 15 минут при температуре (65±1) °С. После выполнения данного эта: материал считается обеззараженным. 7.2 Выделение ДНК Выделение ДНК осуществляют методом нуклеосорбции на силикагеле и. преципитации в присутствии гуанидинтиоцианата с использованием коммерческ: наборов: «Комплекта реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДН сорб-В», «Комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материа «РИБО-преп», «Комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материа «РИБО-сорб» производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и. аналогичных. Работу проводят в соответствии с инструкциями к указанным набора Элюцию ДНК осуществляют в 100 мкл ТЕ-буфера или РНК-элюента. Для проведения последующих исследований полученные препараты ДН последовательно разводят в 100 и 10000 раз, получая разведения ДНК 1хЮ6 и 1><1 ГЭ/мл. Для этого из набора извлекают пробирки «Н20» объемом 5 мл, отбирают hj каждого исследуемого штамма бруцелл по две микроцентрифужные пробирки объеме 1,5 мл и переносят в них по 495 мкл воды. Затем отдельными наконечниками аэрозольным барьером в первые пробирки вносят по 5 мкл препаратов ДНК, пробир! перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и центрифугируют при 3000-50( об/мин в течение 30 с для осаждения капель со стенок пробирок. Затем из этих пробир( переносят по 5 мкл во вторые пробирки с 495 мкл воды, перемешивают i микроцентрифуге/встряхивателе и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 30 для осаждения капель со стенок пробирок. У / , • ' , Для последующего анализа используют только разведения ДНК 1*10 ГЭ/мл!!! ^ - ДИРЕКТОРА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ РАБОТЕ7.3 Проведение ПЦР - амплификация ДНК Для проведения ПЦР из холодильной камеры изйлйсав4тК1ЦРибШ<96-1, ПЦР-смесь- ПЦР-смесь-3, ТЕ-буфер, из морозильной камеры” извлекают фермент Taq ДН полимераза, ПКО ДНК Brucella. Пробирки с ПКО ДНК Brucella полность --- стр. 6 --- размораживают при комнатной температуре или при температуре (6±1)°С. Все микропробирки тщательно перемешают на микроцентрифуге-встряхивателе и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 30 с для осаждения капель со стенок пробирок. Для проведения реакции отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл с плоской крышкой: - для РС-1 - количество исследуемых проб и 2 пробирки для ПКО ДНК Brucella и К-; - для РС-2 - количество исследуемых проб и 2 пробирки для ПКО ДНК Brucella и К-. В отдельных 2 микроцентрифужных пробирках объемом 0,6 мл или 1,5 мл готовят реакционные смеси: - РС-1 из расчета: ПЦР-смесь-1 - 5 мкл, ПЦР-смесь-3 - 10 мкл, Taq ДНК-полимераза - 0,2 мкл. - РС-2 из расчета: ПЦР-смесь-2 - 5 мкл, ПЦР-смесь-3 - 10 мкл, Taq ДНК-полимераза - 0,2 мкл. Полученные смеси тщательно перемешивают и переносят по 15 мкл в подготовленные и соответствующим образом промаркированные пробирки объемом 0,2 мл. В первую или последнюю пробирку с каждой PC вносят по 10 мкл ТЕ-буфера (отрицательный контроль амплификации "К-"). Затем в пробирки с РС-1 и РС-2 вносят по 10 мкл ДНК из исследуемых штаммов бруцелл в разведении 1*104 (!!!). В заключение в одну пробирку с РС-1 и РС-2 вносят по 10 мкл ПКО ДНК Brucella. Подготовленные микропробирки помещают в термоциклер типа RotorGene в следующем порядке: пробирки с РС-1, РС-2. Программирование амплификатора: Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 используют программу Rotor-Gene версии 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000- программу «Rotor-Gene 6000» версии 1.7 (build 67) или выше. При описании программы термины для каждой версии программы представлены следующим образом: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000. У * 'А ^ ^ п г\рьрП’'|у-;j *1 v V 1. Нажимают кнопку «New»/«HoBbid» в основном меню программы. .етальный мастер». Нажимают ДИРЕКТОРА 2. В открывшемся окне выбирают меню «Advan* ( |Sill кнопку «New»/«HoBbift». ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ РАБОТЕ А . К-Никифоров --- стр. 7 --- 3. Выбирают тип ротора «36-Well Rotor»/«36-луночный ротор». Ставят отметку в окне рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Кольцо закреплено». 4. Нажимают кнопку «№хЬ>/«Далее». 5. Выбирают объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции - 25 мкл. Для прибора «Rotor-Gene 6000» должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 pi oil layer volume»/«15 pL объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по умолчанию, ставят ее с помощью мышки). 6. Нажимают кнопку «Next»/«Дал ее». 7. В верхней части окна нажимают кнопку «Edit ргоШе»/«Редактор профиля». 8. Задают следующие параметры эксперимента: 8.1. Hold/Удерж, температуры 95 °С - 5 мин 8.2. Сус1п^/Циклирование 95 °С - 30 с 60 °С- 30 с 72 °С - 30 с Cycle repeats/Цикл повторить - 10 times/раз. 8.3. СусН^2/Циклирование2 95 °С - 20 с 57 °С - 20 с 72 °С - 20 с- Детекция Cycle repeats/Цикл повторить - 35 times/раз. Флюоресценцию измеряют при 72 °С (во втором блоке циклирования) по каналам JOE/Yellow, ROX/Orange. 8.4. Нажимают кнопку «ОК»/«Да». 9. В нижней части окна нажимают кнопку «Calibrate»/«Gain Optimisation...»/«Опт.уровня сигн.». В открывшемся окне нажимают кнопку «Calibrate Acquiring»/« Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для всех красителей (JOE, ROX) указывают в графе Min Reading/Мшим. Сигнал значение 5, а в графе Мах Reading/Максим. Сигнал значение 10. В графе Tube position/Позиция Пробирки указан номер пробирки, по которой будет автоматически выбран параметр «£ш'т>/«усиление сигнала», по умолчанию это 1-я пробирка в роторе. Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с РС-1. Помечают галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before 1s t Acquisition»/'«Perform Optimisation Before 1s t Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Закрыть окно Auto Gain Calibration Setup/Авто- оптимизацш уровня сигнала, нажимают кнопку « 11 / о га[ V «Next»/« Далее». т а /. \Ч А 2> «/«Закрыть». Нажимают кнопку AM. ДИРЕКТОРА ■ПО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ , И ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ РАБОТЕ К - НИКИФОРОВ --- стр. 8 --- 10. Запускают амплификацию кнопкой «Start пдп»/«Старт». 1 1 . Дают название эксперимента и сохраняют его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента). В процессе работы амплификатора или по окончании его работы программируют положение пробирок в карусели. Для этого используют кнопку «Edit samples»/«IIpaBKa образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробирки обозначают в меню Samples/Образцы как Unknown/Неизвестный. 8. УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Регистрация и учет результатов ПИР с РС-1 Регистрация результатов амплификации по каналу JOE/Yellow (ген ВМЕ0711): Нажимают в меню кнопку «Analysis»/« Анализ», выбирают режим анализа «С>иап1кабоп»/«Количественный», выбирают в меню Cycling A. JOE»/«Cycling А. Yellow», нажимают кнопку «Show»/«noKa3aTb». 1. Отменяют автоматический выбор Threshold/Порог. 2. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ активируют кнопки «Dynamic ШЬе»/«Динамич.фон». 3. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов, нажимают кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала видна кнопка Log scale/Лог.шкала). 4. В меню окна «More settings»/«Outlier 11етоуа1»/«Устранение выбросов» установить значение NTC threshold/Порог Фона - ПФ (NTC) - 20 %. 5. В меню «СТ Са1си1айоп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна) выставить Threshold/Порог = 0,1. 6. В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«Количественные Результаты») появятся значения (Ct). 7. 8. Регистрация результатов амплификации по каналу ROX/Orange (ген BR0262): Нажимают в меню кнопку «Analysis»/«AHariH3», выбирают режим анализа «Quantitation»/«KoHH4ecTBeHHbim>, выбирают в меню «Cycling A. ROX»/«Cycling А. Orange», нажимают кнопку «S ho w»/« Показать»; . Отменяют автоматический выбор Threshold/Порог. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ активируют кноц«и « Ш Ш к 1агШ >№ Й <<Динамич-фон>>- Ш ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ 4 ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ А . К Никифоров РАБОТЕ --- стр. 13 --- УТВЕРЖДЕНА Приказом Росздравнадзора от 20 г. № «УТВЕРЖДАЮ» Директор ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора 1 1 __Кутырев В.В. "» \ 201 Я . о ’ ■ § Ш X V ' ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ BRUCELLA SPP. МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (ГЕН BRUCELLA - ИДЕНТИФИКАЦИЯ - РГФ) 1. НАЗНАЧЕНИЕ «Набор реагентов для идентификации штаммов Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Brucella - идентификация - РГФ)», далее - набор реагентов «Ген Brucella - идентификация - РГФ», предназначен для идентификации штаммов бруцелл, выделенных из биологического материала и объектов внешней среды с определением принадлежности к видам В. abortus!В. ovis; В. melitensis\ В. suis/B.canis; B.neotomae методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. 2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика. Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных I- IV групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеющих санитарно- эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности. 3. ТРЕБОВАНИЯ К ПЕРСОНАЛУ, УЧАСТВУЮЩЕМУ В ВЫПОЛНЕНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие соответствующие курсы специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) 1-II групп патогенности. 4. ПРИНЦИП МЕТОДА Для идентификации и определения видовой принадлежности бруцелл исследования проводят с ПЦР-смесью-1 (содержит праймеры и зонды, специфичные к генам BR0262 и ВМЕ0711) и ПЦР-смесью-2 (содержит праймеры и зонд, специфичные к --- стр. 14 --- гену BRA0541). Реакцию амплификации осуществляют одновременно с каждой смесью. Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. abortis и В. ovis осуществл; основании отсутствия амплификации с ПЦР-смесью-1 фрагмента гена BR0262 ROX), наличия амплификации гена ВМЕ0711 (канал JOE), наличия амплифик; ПЦР-смесью-2 фрагмента гена BRA0541 (канал JOE). Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. melitensis осуществл) основании отсутствия амплификации фрагмента гена BR0262 (канал ROX), н амплификации гена ВМЕ0711 (канал JOE), отсутствия амплификации с ПЦР-cn фрагмента гена BRA0541 (канал JOE). Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. suis и В. canis осуществ .1 основании наличия амплификации с ПЦР-смесью-1 фрагментов гена BR0262 (кана и гена ВМЕ0711 (канал JOE), наличия амплификации с ПЦР-смесью-2 фрагмеь BRA0541 (канал JOE). Подтверждение наличия в пробе ДНК видов В. neotomae осуществл основании наличия амплификации с ПЦР-смесью-1 фрагмента гена BR0262 (кана отсутствия амплификации гена ВМЕ0711 (канал JOE), наличия амплификации смесью-2 фрагмента гена BRA0541 (канал JOE). 5. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора входят 7 pear Реактив Описание Объем (мл) Количес ПЦР-смесь-1 прозрачная бесцветная жидкость, содержащая праймеры, зонды, дНТФ и натрия азид 0.15 1 проби ПЦР-смесь-2 прозрачная бесцветная жидкость, содержащая праймеры, зонды, дНТФ и натрия азид 0,15 1 проби ПЦР-смесь-3 прозрачная бесцветная жидкость, содержащая Трис-HCl; аммония сульфат; магния хлорид; Tween-20; натрия азид 0,6 1 проби Taq ДНК- полимераза прозрачная бесцветная жидкость, содержащая фермент с активностью 5 ед/мкл 0,012 1 проби ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость, содержащая трис-HCl; № 2-ЭДТА 1,0 1 пробг Н20 прозрачная бесцветная жидкость, свободная от нуклеаз 5,0 2 пробг ПКО ДНК Brucella прозрачная бесцветная жидкость, представляющая собой водный раствор ДНК В. suis 0,3 2 пробг --- стр. 15 --- Набор реагентов «Ген B ru c e lla - идентификация - РГФ» рассчитан на 30 определ' включая положительные и отрицательные контроли 6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ*: Наименование Основные характеристики или обознач . документации, производитель 1 2 Амплификатор «RotorGene 3000», «RotorGene 6000», "RotorGene Q" «Qiagen», Нидерланды Бокс абактериальной воздушной среды для работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР-"Ламинар-С" «Ламинарные системы». Россия Микроцентрифуга-встряхиватель «ТЭТА-2», «Биоком», Россия Штатив IsoFreeze на 0°С или термостат твердотельный с функцией охлаждения Штатив для пробирок 0,5 мл и 1,5- поддерживающий температуру 0°С в те 5 часов, 20 лунок, «SSI», США или тер? с температурой от 4 до 120 °С, «Би< Россия Набор электронных или механических дозаторов переменного объема 0,5-10 мкл, 10-100 мкл, 100-1000 мкл, Финляндия Штатив-подставка для дозаторов Универсальная на 5 дозаторов, «Хел Россия Наконечники универсальные для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 10 мкл В штативе, «Axygen», США Наконечники универсальные для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 100 мкл В штативе, «Axygen», США Наконечники универсальные для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 1000 мкл В штативе, «Axygen», США Штатив «рабочее место» для микропробирок на 0,2 мл 10x20 мест, «Хеликон», Россия Тонкостенные пробирки для ПЦР с плоской крышкой объемом 0,2 мл «Axygen», США Микроцентрифужные пробирки объемом 0,6 мл «Axygen», США Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл «Axygen», США Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой и не выше минус 18 °С «Атлант», Россия Ёмкость (для сброса отработанных расходных материалов) «Гем», Россия Одноразовый халат Халат медицинский стандартного г плотность ткани 42 г/м2, «Здравмедтех Россия Одноразовые перчатки Перчатки смотровые, текстуриров неопудренные «Sempercare», Германия * Примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим характеристикам не уступающего рекомендуемому. --- стр. 16 --- 7. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ, ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУА НАБОРА Набор реагентов «Ген Brucella - идентификация - РГФ» транспортироваться всеми видами крытых транспортных средств в соответ требованиями ГОСТ 15150 и правилами, установленными для каждого вида тра Условия транспортирования - при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С не более при температуре от минус 16 до минус 20 °С - неограниченно. Условия хранения - ПЦР-смесь-1, ПЦР-смесь-2, ПЦР-смесь-3, ТЕ-буфер, 1 температуре от 2 до 8 °С, Taq ДНК-полимераза, ПКО ДНК Brucella - при темпер; минус 16 до минус 20 °С. Срок годности - 6 месяцев. Условия эксплуатации набора реагентов «Ген Brucella - идентификация - 1 при температуре от 18 до 25 °С. 8. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Использование набора реагентов «Ген Brucella - идентификация - РГФ» с ис сроком годности недопустимо. Работу проводят в соответствии с требованиями СП 13.1285 - 03 «Безоп; работы с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 1.3.2569 -09 «Оргаг работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кисл работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». 9. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ Материалом для исследования служат: суспензии культур, выделенны биологического материала и объектов внешней среды, предвари идентифицированных как Brucella spp. на основании изучения морфометр^ биохимических, серологических свойств или ПЦР-исследования с помощью н; реагентов «ГенБру» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб») и «АмплиСенс Brucella spp. (ООО ИнтерЛабСервис). Из культур бруцелл готовят суспензии в 2 мл 0.9 % раствора натрия хлорисп отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО ■ 85-П (ЮМЕ)), что соответствует 1,7x10Ч м.к./мл для Brucella spp. 10. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА ПЦР-анализ состоит из следующих этапов: обеззараживание материала, выде. ДНК; амплификация, регистрация и учет результатов. --- стр. 18 --- 10.3 Проведение ПЦР - амплификация ДНК Для проведения ПЦР из холодильной камеры извлекают ПЦР-смесь-1, ПЦ ПЦР-смесь-3, ТЕ-буфер, из морозильной камеры извлекают фермент Т полимераза, ПКО ДНК Brucella. Пробирки с ПКО ДНК Brucella п размораживают при комнатной температуре или при температуре (6±1 микропробирки тщательно перемешают на микроцентрифуге-встряхив центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 30 с для осаждения капель пробирок. Для проведения реакции отбирают необходимое количество пробирок обт мл с плоской крышкой: - для РС-1 - количество исследуемых проб и 2 пробирки для ПКО ДНК Вгис - для РС-2 - количество исследуемых проб и 2 пробирки для ПКО ДНК Вгис В отдельных 2 микроцентрифужных пробирках объемом 0,6 мл или 1,5 м реакционные смеси: - РС-1 из расчета: ПЦР-смесь-1 - 5 мкл, ПЦР-смесь-3 - 10 мкл, Taq ДНК-пс - 0,2 мкл. - РС-2 из расчета: ПЦР-смесь-2 - 5 мкл, ПЦР-смесь-3 - 10 мкл, Taq ДНК-по - 0,2 мкл. Полученные смеси тщательно перемешивают и переносят по 15 подготовленные и соответствующим образом промаркированные пробирки объ мл. В первую или последнюю пробирку с каждой PC вносят по 10 мкл Т] (отрицательный контроль амплификации "К-"). Затем в пробирки с РС-1 и РС-2 вносят по 10 мкл ДНК из исследуемых i бруцелл в разведении 1 х 104 (!!!). В заключение в одну пробирку с РС-1 и РС-2 в 10 мкл ПКО ДНК Brucella. Подготовленные микропробирки помещают в термоциклер типа Roto следующем порядке: пробирки с РС-1, РС-2. Программирование амплификатора: Для работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 используют программу Rotor-Ger 6, с прибором «Rotor-Gene» 6000- программу «Rotor-Gene 6000» версии 1.7 (build выше. При описании программы термины для каждой версии программы пред следующим образом: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для англоязычной программы «Rotor-Gene» 6000 / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene 1. Нажимают кнопку «1Меш»/«Новый» в основном меню программы. 2. В открывшемся окне выбирают меню «Абуапсеб»/«Детальный мастер». На --- стр. 19 --- к н о п к у « N e w » / « H o B b m » . 3. Выбирают тип ротора «Зб-Well КоЮг»/«36-луночный ротор». Ставят отм рядом с надписью «No Domed 0.2 ml Tubes»/«Locking ring attached»/«Konbno : 4. Нажимают кнопку «№хЬ>/«Далее». 5. Выбирают объем реакционной смеси: Reaction volume/Объем реакции - : прибора «Rotor-Gene 6000» должно быть активно (отмечено галочкой) ою layer volume»/«15 pL объем масла/воска». (Если галочка не стоит в окне по ставят ее с помощью мышки). 6. Нажимают кнопку «№хЬ>/«Далее». 7. В верхней части окна нажимают кнопку «Edit ргоГ11е»/«Редактор профиля». 8. Задают следующие параметры эксперимента: 8.1. Hold/Удерж, температуры 95 °С - 5 мин 8.2. Сус1^/Циклирование 95 °С - 30 с 60 °С - 30 с 72 °С - 30 с Cycle repeats/Цикл повторить - 10 times/раз. 8.3. Сус1^2/Циклирование2 95 °С - 20 с 57 °С - 20 с 72 °С - 20 с- Детекция Cycle repeats/Цикл повторить - 35 times/раз. Флюоресценцию измеряют при 72 °С (во втором блоке циклирования) JOE/Yellow, ROX/Orange. 8.4. Нажимают кнопку «ОК»/«Да». 9. В нижней части окна нажимают кнопку «Calil Optimisation...»/«Опт.уровня сигн.». В открывшемся окне нажимают кнот Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для всех красителей указывают в графе Min Reading/Мин им. Сигнсш значение 5, а в Reading/Максим. Сигнал значение 10. В графе Tube position/Позиция Проб номер пробирки, по которой будет автоматически выбран параметр « gain сигнала», по умолчанию это 1-я пробирка в роторе. Поэтому в Пой позиц должна ставиться пробирка с РС-1. Помечают галочкой бокс в crpoi Calibration Before Is' Acquisition»/«Perform Optimisation Before lsl Acquisition»/ оптимизацию при 1-м шаге детекции». Закрыть окно Auto Gain Calibration оптимизация уровня сигнала , нажимают кнопку «С1озе»/«Закрыть». Нажим «ЫехЫ«Далее». 10. Запускают амплификацию кнопкой «Start гип»/«Старт». --- стр. 20 --- I 11. Дают название эксперимента и сохраняют его на диске (в этом (j автоматически сохранены результаты данного эксперимента). В процессе работы амплификатора или по окончании его работы про положение пробирок в карусели. Для этого используют кнопку «Edit samp] образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробирки обознач Samples/Образцы как Unknown/Неизвестный. 11. УЧЕТ И РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Регистрация и учет результатов ПНР с РС-1 Регистрация результатов амплификации по каналу JOE/Yellow (ген В 1\ 1. Нажимают в меню кнопку «Analysis»/«AHanH3», выбирают реж «С)иапМа1юп»/<<Количественный», выбирают в меню Cycling A. JOE», Yellow», нажимают кнопку «Show»/«noKa3aTb». 2. Отменяют автоматический выбор Threshold/Порог. 3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ кнопки «Dynamic шЬе»/«Динамич.фон». 4. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (есл активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала bi Log scale/Лог.шкала). . 5. В меню окна «More settings»/«Outlier Летоуа1»/«Устранение выбросов): значение NTC threshold/Порог Фона - ПФ (NTC) - 20 %. 6. В меню «СТ Са1си1аПоп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна Threshold/Порог = 0,1. 7. В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«KonH4ecTBeHHbie Р появятся значения (Ct). Регистрация результатов амплификации по каналу ROX/Orange (ген В 1. Нажимают в меню кнопку «Analysis»/«AHanH3», выбирают реж: «Quantitation»/«KonH4ecTBeHHbim>, выбирают в меню «Cycling A. ROX» Orange», нажимают кнопку «Show»/«noKa3aTb». 2. Отменяют автоматический выбор Threshold/Порог. 3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ кнопки «Dynamic шЬе»/«Динамич.фон». 4. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов, кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (есл активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала bi Log scale/Лог.шкала). 5. В меню окна «More settings»/«Outlier Летоуа1»/«Устранение выбросов» --- стр. 21 --- значение NTC threshold/Порог Фона - ПФ (NTC) - 20 %. 6. В меню «СТ Са1си1а0оп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна) Threshold/Порог = 0.05. 7. В таблице результатов (окно «Quant. Results»/«KoHH4ecTBeHHbie Р появятся значения (Ct). Регистрация и учет результатов ПЦР с РС-2 Регистрация результатов амплификации по каналу JOE/Yellow (ген BR 1. Нажимают в меню кнопку «Analysis»/«AHann3», выбирают реж! «Quantitation»/«KonH4ecTBeHHbm», выбирают в меню «Cycling A. JOE»/ Yellow», нажимают кнопку «Show»/« По казать». 2. Отменяют автоматический выбор Threshold/Порог. 3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ кнопки «Dynamic шЬе»/«Динамич.фон». 4. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов, кнопку Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (есл активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale/Линейная шкала вг Log scale/Лог.шкала). 5. В меню окна «More settings»/«Outlier 11етоуаЬ>/«Устранение выбросов» значение NTC threshold/Порог Фона - ПФ (NTC) - 20 %. 6. В меню «СТ Са1си1абоп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна) Threshold/Порог = 0.05. 7. В т а б л и ц е р е з у л ь т а т о в (о к н о «Quant. R e s u lts »/ «K o n H 4 e c T B e H H b ie Р п о я в я т с я з н а ч е н и я (Ct). Интерпретация результатов амплификации с РС-1 и РС-2 Результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) пересеч' флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой j соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цик соответствующей графе в таблице результатов). К учету результатов исследуемых проб с РС-1 и РС-2 приступают тол! прохождения положительных (К+), отрицательных (К-) контролей ам: (таблица). Наименование контроля Значения порогового цикла (Ct) по каналам РС-1 РС-2 JOE ВМЕ071 1 ROX BR0262 JOE BRA0541 К + <JJ <33 <33 К- - - - --- стр. 22 --- Учет и интерпретацию результатов с PC-1 и РС-2 проводят в соо' таблицей. Значения порогового цикла (Ct) по каналам Резуль Пробы РС-1 РС-2 аналг JOE (ВМЕ0711) ROX (BR0262) JOE (BRA054I) <33 Отсутствие флуоресценции <33 Положительн виды В. abort <33 Отсутствие флуоресценции Отсутствие флуоресценции Положительн; вид В. meliten <33 IA <33 Положительн) В. suis/B. cani. Исследу емые пробы Отсутствие флуоресценции " Л <33 Положительн! В. neotomae. Отсутствие флуоресценции <j 3 Отсутствие флуоресценции Штамм не принадлежит Отсутствие флуоресценции Отсутствие флуоресценции Brucella. Необходимо уг <33 тС П VI Отсутствие флуоресценции его системать положение. Отсутствие флуоресценции Отсутствие флуоресценции Отсутствие флуоресценции 12. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 12.1. Аналитическая чувствительность. Набор «Ген Brucella - идентификаци должен идентифицировать штаммы бруцелл и определять их принадлежность к abortus/В. ovis; В. melitensis: В. suis/B.canis; B.neotomae при концентрации с исследуемых культур не менее 1 х 104 м.к./мл. 12.2. Аналитическая специфичность. Набор «Ген Brucella - идентификация - должен давать положительных результатов с ДНК микроорганизмов других р суспензиях концентрации 1 х 104 м.к./мл. 12.3. Диагностическая чувствительность Диагностическая чувствительность - не менее 98,5 % с доверительной вероятн % при исследовании 228 положительных образцов, содержащих В. abortus/B. melitensis ; В. suis/B.canis: B.neotomae при концентрации суспензий исследуемых не менее 1 х 104 м.к./мл. --- стр. 23 --- 12.4. Диагностическая специфичность Диагност ическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятное! при исследовании 228 положительных образцов, содержащих ДНК бруце отрицательных образцов, содержащих ДНК гетерологичных микроорганизмов. 13. БЕЗОПАСНАЯ УТИЛИЗАЦИЯ Уничтожение наборов реагентов с истекшим сроком годности провс соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10. 14. ГАРАНТИИ И ИНФОРМАЦИЯ О ПРОИЗВОДИТЕЛЕ Производитель гарантирует качество набора реагентов «Ген Вп идентификация - РГФ» при соблюдении условий транспортирования, хра эксплуатации в течение указанного срока годности. Рекламации на качество «Набор реагентов для идентификации штаммов spp. методами полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентныг результатов в режиме реального времени (Ген Brucella - идентификация - течение срока годности направлять в организацию - производитель ФКУЗ Рос «Микроб» Роспотребнадзора (410005. г. Саратов, ул. Университетская, 46 Тел. ((8' 69-65). Зам. директора по экспериментальной и производственной работе ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 1, m " m m nв <5 д [! • Я р 1 1 1 Imli f e jf ib . А.К. Никифс Директор ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора д.м.н., профессор ^ V ^$А Ш . Куличе